Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Özet

Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.

Özet

Confocal mikroskobu, nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) varlığı tanımlamak için kullanılan bir birincil yöntemidir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) görselleştirmek için kurulan confocal mikroskobu yöntemleri değiştirdiniz. Bu hücre dışı tuzakları ekstraselüler Kromatin varlığı granül proteaz, citrullinated Histon ve peptit arginase deiminase (PAD) gibi diğer bileşenlerinin ortak ifade ile tanımlanır. METs ifade genellikle bir uyarana maruz kaldıktan sonra ölçülen ve un uyarılmış örnekleri karşılaştırıldığında. Örnekleri de arka plan ve izotip kontrol için yer almaktadır. Hücreleri iyi tanımlanmış görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Confocal mikroskobu METs varlığı tanımlamak için kullanılan vitro ve in vivo akciğer dokusunda.

Giriş

Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), ilk olarak Brinkmann vd tarafından açıklanan ¹ onlar enfeksiyon (özellikle bakteri) yanıt olarak ağırlıklı olarak üretilen ve konak savunma^1,2' önemli bir role sahiptir. Onlar da yanıt olmayan bulaşıcı hastalık, vaskülit ve sistemik lupus Eritematozus (SLE); de dahil olmak üzere için gerçekleşmesi için tarif edilmistir ve mitojenle phorbol 12-myrisate 13-asetat (PMA)^2,3. Bu son zamanlarda diğer hücre tipleri aynı zamanda hücre dışı tuzakları, makrofajlar da dahil olmak üzere neden olabilir kabul edilmiştir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) henüz edebiyat^4,5iyi tanımlanmış bir varlık değildir. Biz son zamanlarda METs olup olmadığını belirlemek için yöntemleri kurduk vitro ve in vivo^6,7. Bu makalede, METs confocal mikroskobu kullanılarak ölçüm açıklanacaktır.

Kromatin ile birlikte ekstrüzyon (gibi Apoptozis⁸) hücresel diğer yolları ayırmak NETosis temel özellikleri şunlardır: (1) citrullination histonlarla (H3Cit)⁹, (2) ortak ifade granül proteaz¹⁰ ve peptit arginin deiminase (PAD) 4 (3) katılımı^11,12. Makrofajlar da ifade H3Cit, granül proteaz ve PAD ve bu özellikler METs varlığı tanımlamak için kullanılabilir.

METs makrofaj baskın hücre mevcut alveoller ve akciğerin airways ve hücresel immün yanıt enfeksiyon/iltihap için yönetmenlik ilk rolü vardır akciğerde, özellikle önemli bir rolü olabileceğini. Akciğer çok boş alanı (örneğin, içinde alveoller), Ayrıca, METs içine belgili tanımlık yer elde edilebilir, sağlam organların aksine genişletmek potansiyel olarak mümkün iken.

NETs varlığı tanımlamak için en çok kullanılan tarafından confocal mikroskobu yöntemidir. Henüz METs ölçmek için açıkça tanımlanmış bir yol değil. NETs ölçme tekniği METs huzurunda bu protokolü ölçmek için adapte edilmiştir. Bu yöntemin temel gereksinimleri confocal mikroskobu ve uygun görüntüleme yazılımı erişim analizi için vardır.

Protokol

yılında deneyler bu iletişim kuralı izler: (1) insanlar tarafından Etik Komitesi, Monash Tıp Merkezi ve Melbourne Üniversitesi Etik Komitesi hayvanlar (2).

1. Bronchoalveolar lavaj (BAL) makrofajlar

1. Kullanım akciğer makrofajlar edinmek için BAL: (1) insan denekleri Bronkoskopi ⁶ ve (2) fareler tarafından içi trakeal aspirasyon kullanarak ¹³ .
   Not: Makrofajlar edinimi genellikle bazı etkinleştirme bu hücrelerinin neden olur. Makrofajlar potansiyel bir tıbbi sorunu araştırmak için Bronkoskopi gerektirir hastalardan elde edilen ve tüm konular (bunun için tek tek her proje belirlenecek gerekir) METs çözümlenmesi için uygun olabilir.
   1. BAL çözüm ve (10 min için 500 x g) aşağı spin için bir Pelet biçiminde, iki kez kültür orta (Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) ile % 5 fetal buzağı serum ve % 1'l-glutamin) oda sıcaklığında yıkayın ve hücre kültür medi 4 ml seyreltik Um.
   2. Gerekirse, istek resmi bir fark sayısı; hücrelerin çoğu (genellikle > % 80) makrofajlar ⁶ olacak.
      Not: Bu genellikle farklı hücre türleri ⁶ morfolojik görünümünü kullanarak bir klinik Histoloji hizmeti tarafından gerçekleştirilecek.
   3. Gerçekleştir uygun makrofaj hücre saymak Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak BAL çözüm.
      Not: BAL çözüm insan ve fare 1.1 adımda belirtildiği gibi elde edilir.
   4. Ekle 1-4 x 10 ⁵ makrofajlar kültür orta iyi ve bırakın başına 500 µL coverslips 24-şey plakaları için 37 ° C'de gecede; hücreleri coverslips için uygun olacaktır. İnsan örnekleri için antibiyotik ekleyin (örneğin, penisilin ve streptomisin, 10 ⁴ U/mL) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için.

2. Ayirt etiketleme/mikroskobu BAL makrofajlar,

Not: yukarıda da belirtildiği gibi hücreleri coverslips yapıştırılır.

1. Kültür orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) bir kez hücrelerle yıkayın. % 2 paraformaldehyde/periodate/lizin (PIP) sabitleştirici 10 dakika süreyle hücreleri tamir
2. Yıkama PBS kısaca hücrelerde ve %0,2 permeabilize ara 20 dakika sonra 20 dakika süreyle PBS
3. Blok hücreleri % 10 tavuk sera içinde %5 sığır serum PBS için 30 dk içinde seyreltilmiş albumin (BSA) ile
4. Incubate ilköğretim ve izotip kontrol ile antikor için konsantrasyonlarda (daha özel ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) 1: 100 37 oda sıcaklığında 1 h ° C.
   Not: BAL örnekleri için belirli bir işaretleyici makrofajlar, genellikle gerekli değildir.
5. Birincil antikorlar eklenmesi sonra PBS hücrelerde yıkama ve daha fazla oda sıcaklığında 40 min için ilgili ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
6. PBS ve montajı ile DAPI tabanlı montaj orta confocal mikroskop lazer uyarilmalar 405, 488, 561 ve 647 nm ve X 40 at (yukarıda belirtildiği gibi) kullanarak görselleştirme için bölümlerde yıka, 1.0 NA petrol hedefi.

3. Akciğer doku örnekleri

Not: için in vivo çalışmalar Akciğer doku örnekleri ilgili maruz kaldıktan sonra çalışma (O tarafından açıklandığı gibi örneğin, ' Sullivan vd. ⁷). bu deneme için en uygun pozlama bulaşıcı mikroorganizmalar, özellikle bakteri vardır. Bu yöntem için kullanılabilecek fare suşları C57BL/6 veya BALB/c fare, 10-12 hafta yaşlı, ağırlık 25-30 g ve erkek vardır.

1. Ketamin (400 mg/kg) ve xylazine (40 mg/kg) mayi bir enjeksiyon yoluyla Euthanize fareler. Göğüs boşluğuna açın ve akciğer ve kalp cerrahi forseps ve makas kullanarak ortaya çıkarmak.
   1. Sıcak PBS 30 kapları kandan dışarı yıkamak için sağ ventrikül 21'lik iğne kullanarak demlemek s, 10 mL % 2 PIP sabitleştirici 30 demlemek s (içine sağ ventrikül).
   2. Sıcak PBS (42 ° C) lavaj açık göğüs boşluğu kullanın. Trakea 21'lik iğne ve boyutuna, kesme 0.8 mm boru parçası ile entübasyon ve Önceden ısıtılmış (için 42 ° C), 800 µL enjekte, düşük erime noktası % 3 özel çözüm.
   3. Kravat Trakea örgülü ipek (4.0 USP) ile kapalı. Hemen altında kanül, ekleme noktasını Trakea etrafında iplik yerleştirin ve basit bir yukarıdan aşağı düğüm güvenli. Özel kuvvetlendirmek için akciğer çevresinde buz gibi PBS yönetmek. Akciğer ve kalp makas ve künt diseksiyon kullanarak göğüs boşluğuna bir blok olarak kaldırın. Her akciğer tek tek kaldırmanız ve sonra onları saptamak için 2 16 h % PIP veya formalin 4 ° C.
   4. Örnekler doku kesit kadar 4 ° C'de PBS içinde saklayın. Akciğer dokusu elde etmek için bu yöntemleri yukarıda açıklanan ¹³ olmuştur.
2. Akciğer doku hazırlamak için örnekler aşağıdaki adımları kullanın.
   1. Düzeltme akciğer dokuları (3.1 adımda rezeke) doku % 10 formalin oda sıcaklığında 24 h için doğal arabelleğe alınmış. Aktarım için % 75 etanol ve 12 h döngüsü (2.5 s %75 alkol, 3 h mutlak alkol, Çözücü 3B ve 3 h parafin için 3,5 h) doku işlemcide koymak.
   2. Embed içinde oda sıcaklığında saklanan formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) blok oluşturmak için standart parafin.
      Not: Bu aşamada, akciğer bölümler standart slaytlar için kesmek genellikle uygun.
   3. 4-5 µm kalınlık bir microtome kullanarak FFPE akciğer bölümleri kesme ve ücret, daha önce O tarafından açıklandığı gibi kaplanmış slaytlar üzerinde monte ' Sullivan vd. ⁷
   4. Slaytlar bağlamak, 60 x 24 mm coverslips (boyutu 1,5) Montaj orta 3 damla koymak, slayt coverslip üzerinde ters çevir ve aşırı orta itmek için. Hermetik oje ile mühür ve mağaza oda sıcaklığında.

4. Hazırlık/mikroskobu Akciğer doku örneklerinin

de-wax, suyla temasa ve FFPE Akciğer doku örneği antijen alma çözümü ile pretreat için
1. . 60 ° C'de 60 dk için FFPE
   1. fırın kuru slaytlar Sonra slaytlar Ksilen çözüm 30 dk ve transfer için % 70 etanol çözüm oda sıcaklığında 5 min için koymak. Musluk suyu durulama.
   2. Yer ısı geçirmez plastik wrap ve HIER-antijen alma bir düdüklü tencere 10 10 dk içinde tabi m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 min bir rock'çı, sonra bir kez PBS ile rocker için musluk suyundaki iki kez 20 dk. yıkama için serin.
   3. % %5 10 tavuk serum ile blok BSA/PBS, oda sıcaklığında 30 dk için.
2. Doku leke.
   1. METs makrofajlar tanımlamak, birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) % 1'eklemek için BSA/PBS 1/100 seyreltme (antikor tutarlarla ilgili belirli ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) yönü 4 ° C'de 16 h için. Bir rocker üzerinde 5 min için PBS ile iki kez yıkayın.
   %1
   2. elde floresan algılama ile ilgili ikincil kuluçka tarafından antikor BSA/PBS 40 dakika oda sıcaklığında. Antikor vardır: (1) tavuk Anti-fare 488 (yeşil), (2) tavuk Anti-keçi 594 (kırmızı) ve (3) eşek Anti-fare 647 (çok kırmızı).
   3. PBS ve montajı ile Kromatin boyama için montaj orta DAPI içeren bölümlerde yıkayın.
3. Floresan görüntü ters bir mikroskop bağlı kafa tarama confocal lazer kullanarak elde.
   1. Excite 405, 488, 561 ve 647 hazırlıkla nm lazerler. Çizgi-sıralı üzerinde tıklatarak tek uçak 512 x 512 piksel görüntü yakalama, 20 X 0,1 kullanarak (2 satır ortalama) düğme tesviye NA hava ve 40 X 1.0 NA petrol hedefleri.
   2. Elde etmek için analiz bölümüne ve veri (örneğin, 10 yüksek güçlü alanları bakış açısı (HFOV) denetimi, uyarılmış örnek, vb, her fare için 10) her sonuç için başına en az on alanları bakış.
      Not: tüm alanı temsil edici bir örnek almak için bir matris sistemi hangi alanı ayrılmıştır kullanılabilir içine farklı bölümler ve aynı matris görüş alanları seçmek için kullanılan farklı her örnek için (örneğin, alan 9 bölümlere ayrılabilir ve merkezi ve 4 köşe, iki HFOV alınır).

5. Üç boyutlu (3-D) görüntüleme, METs

Not: METs 3-b yapılardır gibi birden çok z-yığın alarak yeniden, görüntüler, değerli bilgiler verebilir.

1. 200 µm 1.8 mm ve hız 0.1-0,5 olarak ayarlamak bir genlik adlı bir vibratome kullanarak, parafin blok gelen akciğer numuneler bölümünde mm/s.
2. Blok akciğer dokusu ile ilgili serum (% 10 fetal buzağı serum ve % 10 tavuk serum) % 20'si ve takıma PBS ve %3,75 permeabilize Triton-X 100 nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 7 h için.
3. Bölümleri ile ilgili birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) 4 ° C'de 16 h için microcentrifuge tüpler (antikor konsantrasyonları Malzemeler tablo içinde listelenen) 200 µL cilt leke.
4. PBS, 1 h için oda sıcaklığında ilgili ikincil antikorlar ile kuluçka önce 10 dakika için 3 kez bölümlerde yıkama
5. Kapak paket fişi için mikroskop ekleme PBS içinde slaytlar önce akciğer bölümler 20 dk, çözüm DAPI (1:5, 000) için leke.
6. 405 ile donatılmış bir confocal ters mikroskop (40 x 1.3 NA) kullanarak floresan görüntü elde nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm ve 635 nm lazerler.
7. 3-b z-yığınları 0,54 µm kalınlık 40 x 1.3 NA petrol amaç için en iyi z kesit ile rekor.
   Not: kullanılan yazılım bireysel mikroskop bağlı olarak değişir. Nasıl belgili tanımlık bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış için bir mikroskop bir örneği ek dosya 1 ' de sağlanan.

6. Görüntü analizi

Not: analiz örnekleri belirli görüntüleme analizi yazılımı kullanımı gerektirir ve örnekler Malzemeler tablo içinde listelenir. Analiz sonuçlarının kullandığınız belirli programa bağlıdır iken, listelenen aşağıdaki önemli noktalardır.

1. Mavi kanal DAPI için seçerek ve hücrelerin en az boyutu atama BAL analiz örnekleri
   1. tanımla makrofajlar sayısı (örneğin, > çapı 18 µm). İlgili yazılım kullanarak makrofajlar her alanı için toplam sayısını ölçmek.
   2. Hücre dışı Kromatin DAPI tarafından diğer işaretleri (örneğin, MMP12, PAD2 ve H3Cit) Co ifade ile tespit varlığı ile bir MET özelliklere sahip hücreleri say.
      Not: Analiz edilebilir işaretleri sayısı lazerler kullanılabilir sayısına bağlıdır, ancak ideal DAPI ek olarak, en az iki başka işaretleri dahil edilmelidir. Diğer daha az belirli parametreleri MET ifade (örneğin, hücreleri ekstrasellüler Kromatin ve genişlemiş bir çekirdeğe sayısı) için kullanılabilir.
   3. BAL MET ifadede karşılaştırmak için en az 100 BAL makrofajlar örnek başına örnekleri (Denetim arasında duman, duman/Dnaz tedavi grupları), analiz.
   İkincil antikor ve izotip ölçmek için
   4. kontrol Floresans düzeyde; en az 100 her örnek için onların Floresans hücrelerde ölçmek. Arka plan floresan (örneğin, H3Cit) her işaretçi için ortalama düzeyini ölçmek standart yazılım kullanarak.
   5. MET ifade, tanımlamak için tipik fenotip (örneğin, H3Cit ve MMP9 ortak ifadesi ile hücre dışı Kromatin) içeren hücreleri saymak ve her MET Floresans işaretleri (örneğin, H3Cit ve MMP9) düzeyini ölçmek. Eğer onların boyama arka plan ve izotip kontrol değildi METs üreten hücreleri dışlamak.
   6. İnsan BAL örnekleri için en az 100 hücre METs yapmak makrofajlar yüzdesi için her örnek için analiz. Fare örnekleri için hücreleri daha küçüktür ve METs daha sert tanımlamak için olarak, daha büyük bir sayı (örneğin, 200 makrofajlar) her örnek için hücre analiz.
2. Analiz Akciğer doku örnekleri
   1. METs huzurunda Akciğer doku belirlemek için belirli makrofaj marker F4/80 gibi kullanın.
   2. 6.1 bölümünde listelenen diğer parametrelerle ekstraselüler Kromatin hızlı hücrelerdeki F4/80 co lokalizasyonu kullanarak akciğer dokusunda METs varlığı tanımlayın.
   3. Arka plan Floresans örneklerinde ile ikincil antikor düzeyleri ve izotip denetimlerini belirler. Arka plan üstüne olmayan analiz METs dışlamak.

Sonuçlar

METs BAL örneklerinden, akciğer dokusu ve 3-b görüntülerle daha kalın akciğer bölümlerde görüntülenmeyecektir. Bir BAL örnek görüntülenir METs örneği şekil 1' de gösterilen. METs morfolojisi olgunlaşma onların sahne göre değişir. Mikroskobu ilk tespit özelliğini hücrenin kenarını çekirdeğine harekettir. Bu H3Cit ve granül proteaz gibi diğer ortak ifade arabulucu ile hücre dışı Kromatin tarafından takip ediyor. Önceki a?...

Tartışmalar

Bu derlemede açıklanan yöntemi tabanlı ağlar¹⁴varlığı tanımlamak için kullanılan tarih. Makrofajlar tarafından çok BAL örneklerinde baskın hücre tipi vardır ve bu yöntem koleksiyon METs eğitimi için özellikle uygundur. Kırmızı kan hücreleri içinde BAL varsa, bu hücreleri amonyum klorür kullanarak lysed. BAL yordam genellikle makrofajlar devreye giriyor ve bu nedenle bu METs un uyarılmış örnekleri mevcut olacak bekleniyor. BAL makrofajlar genellikle çok yapışık. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP