Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Zusammenfassung

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Zusammenfassung

Eine bevorzugte Methode verwendet, um das Vorhandensein von Neutrophilen extrazelluläre Traps (NETs) zu definieren ist konfokalen Mikroskopie. Wir haben etablierte konfokalen Mikroskopie Methoden zur Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) modifiziert. Diese extrazellulären fallen werden durch das Vorhandensein von extrazellulären Chromatin mit Co Ausdruck anderer Komponenten wie Granulat Proteasen, citrullinierte Histone und Peptidyl Arginase Deiminase (PAD) definiert. Der Ausdruck der METs in der Regel nach der Exposition auf einen Reiz gemessen und im Vergleich zu un-stimulierten Proben. Proben sind auch für Hintergrund und Isotype Kontrolle enthalten. Zellen werden mit genau definierten Bildanalyse-Software analysiert. Konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um das Vorhandensein von METs definieren sowohl in Vitro und in Vivo im Lungengewebe.

Einleitung

Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs), wurden zuerst von Brinkmann Et Al. beschrieben ¹ sie sind überwiegend als Reaktion auf die Infektion (vor allem Bakterien) hergestellt und haben eine wichtige Rolle im Host Verteidigung^1,2. Sie sind auch beschrieben worden, um als Reaktion auf nicht-infektiösen Krankheiten, einschließlich Vaskulitis und systemischer Lupus erythematodes (SLE); und die Mitogen Phorbol 12-Myrisate 13-Acetat (PMA)^2,3. Es ist vor kurzem erkannt worden, dass andere Zelltypen auch extrazelluläre fallen, einschließlich der Makrophagen produzieren können. Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) sind noch nicht definierte Entität in der Literatur^4,5. Vor kurzem haben wir Methoden, um das Vorhandensein von METs in Vitro und in Vivo^6,7. In diesem Artikel wird die Messung der METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beschrieben.

Hauptmerkmale der NETosis die Unterscheidung von anderen zellulären Wege (z. B. Apoptose⁸) sind die Extrusion von Chromatin in Verbindung mit: (1) Citrullination der Histone (H3Cit)⁹, (2) Co Ausdruck von Granulat Proteasen¹⁰ , und (3) Einbeziehung der Peptidyl Arginin Deiminase (PAD) 4^11,12. Makrophagen auch ausdrücken, H3Cit, Granulat Proteasen und PAD, und diese Funktionen können verwendet werden, um das Vorhandensein von METs zu definieren.

METs haben eine besonders wichtige Rolle in der Lunge, da die Makrophagen die dominante Zelle in die Alveolen und die Atemwege der Lunge vorhanden und die erste Rolle hat in der Leitung der zellulären Immunantwort auf Infektionen/Entzündungen. Darüber hinaus zwar ein Großteil der Lunge leeren Raum (z. B.innerhalb der Alveolen), sind die METs potenziell in der Lage, in den Raum zur Verfügung, im Gegensatz zu soliden Organe zu erweitern.

Die am weitesten verbreitete Methode, um das Vorhandensein von Netzen zu definieren ist von konfokalen Mikroskopie. Es gibt nicht noch eine klar definierte Methode zum Messen der METs. Die Technik für die Messung der Netze wurde angepasst um das Vorhandensein von METs in diesem Protokoll zu messen. Die wichtigsten Anforderungen für diese Methode sind Zugriff auf konfokalen Mikroskopie und entsprechende imaging-Software für die Analyse.

Protokoll

dieses Protokoll folgt Experimente in zugelassen: (1) Menschen von der Ethik Komitee der Monash Medical Center und (2) Tiere, die von der Ethikkommission der Universität Melbourne.

1. alvéolaire Lavage (BAL) Makrophagen

1. Verwendung BAL Lung Makrophagen in zu erhalten: (1) menschliche Themen durch Bronchoskopie ⁶ und (2) Mäuse mit Intra-trachealen streben ¹³ .
   Hinweis: Erwerb von den Makrophagen führt in der Regel einige Aktivierung dieser Zellen. Makrophagen stammen aus Patienten, die erfordern eine Bronchoskopie, ein mögliches medizinisches Problem zu untersuchen und möglicherweise nicht alle Themen geeignet für die Analyse der METs (Dies müssen für jedes einzelne Projekt ermittelt werden).
   1. BAL Lösung und Spin-down (500 X g für 10 min.) in Form einer Tablette nehmen, waschen zweimal mit Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) mit fetalen Kälberserum 5 % und 1 % L-Glutamin) bei Raumtemperatur und verdünnen Sie Zellen in 4 mL Kultur medi Umm.
   2. Bei Bedarf anfordern eine formalen differenzielle Graf; die meisten Zellen (in der Regel > 80 %) werden Makrophagen ⁶.
      Hinweis: Dies wird in der Regel erfolgen durch einen klinischen Histologie-Service über die morphologische Darstellung der verschiedenen Zellen Typen ⁶.
   3. Führen eine tragfähige Makrophagen Zelle zählen auf die BAL-Lösung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und ein Hemocytometer.
      Hinweis: BAL Lösung ergibt sich aus Mensch und Maus wie unter Schritt 1.1.
   4. Add 1-4 x 10 ⁵ Makrophagen zu 24-Well-Platten auf Deckgläsern in 500 µL Kulturmedium pro gut und lassen Sie über Nacht bei 37 ° C; die Zellen haften an den Deckgläsern. Fügen Sie für Humanproben, Antibiotika (z.B. Penicillin und Streptomycin, 10 ⁴ U/mL), bakterielle Kontamination zu verhindern.

2. Immunfluoreszenz Beschriftung/Mikroskopie von Makrophagen BAL

Hinweis: Zellen auf Deckgläsern eingehalten werden, wie oben erwähnt.

1. Das Kulturmedium zu entfernen und waschen Sie die Zellen einmal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Beheben von Zellen in 2 % Paraformaldehyd/periodate/Lysin (PLP) Fixiermittel für 10 min.
2. Zellen kurz in PBS waschen, und dann permeabilize in 0,2 % Tween 20 in PBS für 20 min.
3. Block-Zellen mit 10 % Huhn Sera in 5 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt mit PBS-Puffer für 30 min.
4. Inkubation mit Primär- und Isotype Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur in 1: 100-Konzentrationen (weitere Einzelheiten finden Sie in Tabelle of Materials) bei 37 ° c
   Hinweis: Für die BAL-Proben, ein spezifische Marker von Makrophagen ist in der Regel nicht erforderlich.
5. Nach der Zugabe von Primärantikörpern, waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, und weiter mit der entsprechenden Sekundärantikörper für 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-basierte Eindeckmittel zur Visualisierung mit einem confocal Mikroskop (siehe oben) am Laser Erregungen 405, 488, 561 und 647 nm und 40 X, 1,0 NA Öl Ziel.

3. Lunge Gewebeproben

Hinweis: für in Vivo Studien von Lungengewebe, studieren die Proben nach der entsprechenden Exposition (z. B., wie beschrieben durch O ' Sullivan Et Al. ⁷). die Belichtung, die am besten für dieses Experiment sind infektiöse Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Maus-Stämmen, die für diese Methode verwendet werden könnten sind C57BL/6 oder BALB/c Mäuse, 10-12 Wochen alt, Gewicht 25-30 g und männlich.

1. Einschläfern Mäuse, über eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (400 mg/kg) und Xylazin (40 mg/kg). Öffnen der Brusthöhle und aussetzen von Lunge und Herz mit chirurgischen Pinzetten und Scheren.
   1. Einflößen warm PBS mit einer 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel zum Auswaschen des Blutes aus den Gefäßen für 30 s, dann die Infusion 10 mL 2 % PLP Fixativ für 30 s (in den rechten Ventrikel).
   2. Verwenden um Lavage der offenen Brustraum warm PBS (42 ° C). Intubation der Trachea mit einer 21-Gauge-Nadel und ein Stück 0,8 mm Schlauch geschnitten, und 800 µL vorgewärmten (bis 42 ° C) zu injizieren, niedrigschmelzende 3 % Agarose-Lösung zeigen.
   3. Tie abseits die Luftröhre mit geflochtenen Seide (4.0 USP). Legen Sie den Faden um die Luftröhre, knapp unterhalb der Einfügemarke an die Stelle der Kanüle, und sichern Sie sie über eine einfache Überhandknoten. Um die Agarose erstarren, eiskaltem PBS um die Lunge zu verwalten. Entfernen Sie die Lungen und das Herz als einen Block von der Brusthöhle mit Schere und stumpfe Dissektion. Jede Lunge einzeln entfernen und dann beheben sie für 16 h in 2 % PLP oder Formalin bei 4 ° c
   4. Speichern die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Gewebe zu schneiden. Diese Methoden für den Erhalt der Lungengewebe wurden zuvor beschriebenen ¹³.
2. Zur Vorbereitung des Lungengewebes Beispiele verwenden die folgenden Schritte.
   1. Fix Lungengewebe Gewebe (reseziert im Schritt 3.1)-10 % natürlichen gepuffert Formalin für 24 h bei Raumtemperatur. Übertragen auf 75 % Ethanol und stellen in einem Gewebe-Prozessor auf einem 12 h Zyklus, (2,5 h in 75 % EtOH, 3 h in absolute EtOH, 3,5 h im Lösungsmittel 3 b und 3 h in Paraffin).
   2. Einbetten in standard Paraffin, Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Blöcke, die gespeichert sind bei Raumtemperatur zu schaffen.
      Hinweis: In diesem Stadium ist es in der Regel zweckmäßig, die Lunge Querschnitte für standard Folien.
   3. Die Proteinkinase Lungen-Abschnitte bei 4-5 µm Dicke mit einem Mikrotom schneiden und montieren auf aufgeladen, beschichtete Folien wie oben beschrieben durch O ' Sullivan Et Al. ⁷
   4. , Folien zu montieren, 3 Tropfen Eindeckmittel auf Deckgläsern 60 mm x 24 mm (Größe 1,5), invertieren die Folie auf das Deckglas und push-out überschüssige Mittel. Hermetisch dichten mit Nagellack und bei Raumtemperatur lagern.

4. Vorbereitung/Mikroskopie von Gewebeproben Lunge

1. de-einwachsen, rehydrieren und die Proteinkinase Lunge Gewebeprobe mit Antigen-Retrieval-Lösung vorbehandeln.
   1. Ofen trocken gleitet die Proteinkinase für 60 min bei 60 ° C. Dann legen Sie die Folien in Xylol Lösung für 30 min und den Transfer zu 70 % Ethanol Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Spülen in Leitungswasser.
   2. Ort in hitzebeständigen Folie eingeschweißt und unterliegt HIER-Antigen-Retrieval im Schnellkochtopf für 10 min in 10 m/Mol/L Tris, 1 Mmol/EDTA pH 9.0. Cool für 20 min. Waschen zweimal im Leitungswasser für 5 min auf einer Wippe, dann einmal mit PBS auf Rocker.
   3. Block mit 10 % Huhn Serum in 5 % BSA/PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
2. Des Gewebes zu beflecken.
   1. , METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 1 % BSA/PBS 16 h bei 4 ° C in 1/100 Verdünnung (genauere Angaben zu Mengen Antikörper sind in Tabelle Materialien aufgeführt). Waschen zweimal mit PBS für 5 min auf einer Wippe.
   2. Erreichen-Fluoreszenz-Detektion durch Inkubation mit entsprechenden sekundären Antikörper in 1 % BSA/PBS für 40 min bei Raumtemperatur. Antikörper sind: (1) Huhn Anti-Maus 488 (grün), Huhn (2) Anti-Ziege 594 (rot) und (3) Esel Anti-Maus (weit rot) 647.
   3. Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-haltigen Eindeckmedium für das Chromatin beflecken.
3. Fluoreszierenden Bilder mit einem konfokalen Laser-scanning-Kopf befestigt an einem inversen Mikroskop zu erhalten.
   1. Excite die Vorbereitung mit 405, 488, 561 und 647 nm Laser. Einziges Flugzeug 512 x 512 Pixel großen Bildern zu erfassen, durch Anklicken der Linie-sequentielle, Nivellierung Knopf (2 Zeile durchschnittlich) mit 20 X 0,1 NA Luft- und 40 X 1.0 NA Öl Ziele.
   2. Erhalten mindestens zehn Gesichtsfelder pro Abschnitt für Analysen und Daten für jedes Ergebnis (d.h. 10 Hochleistungs-FOV (HFOV) für das Steuerelement, 10 für die angeregten Probe, etc., für jede Maus).
      Hinweis: Um eine repräsentative Stichprobe von das gesamte Feld zu erhalten, eine Matrixsystem kann verwendet werden in dem Bereich unterteilt ist in verschiedenen Abschnitten und für jede andere Probe die gleiche Matrix verwendet wird, um die Sichtfelder auswählen (z.B. Feld kann in 9 Abschnitte unterteilt werden, und das Zentrum und die 4 Ecken, zwei HFOV sind entnommen).

5. Dreidimensionale (3D) Imaging der METs

Hinweis: da METs 3-d-Strukturen sind, indem man mehrere Z-Stapel Bilder, die wieder hergestellt werden, können geben wertvolle Informationen.

1. Abschnitt der Lunge Exemplare aus Paraffin-Blöcke bei 200 µm mit einem Vibratome bei einer Amplitude auf 1,8 mm und die Geschwindigkeit von 0,1-0,5 mm/s
2. Blockieren Lungengewebe mit 20 % des jeweiligen Serum (10 % fetalen Kälberserum und 10 % Huhn Serum) und dann permeabilize in PBS ergänzt und 3,75 % Triton X 100 für 7 h bei Raumtemperatur unter sanften Agitation.
3. Fleck in den Abschnitten 16 h bei 4 ° C mit der entsprechenden Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 200 µL Bände in Mikrozentrifugenröhrchen (Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle Materialien aufgeführt).
4. Waschen Sie die Abschnitte in PBS, 3 Mal für 10 min vor der Inkubation mit sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
5. Der Lunge Abschnitte für DAPI (1:5 000) in Lösung für 20 min, färben, bevor das Mikroskop schlüpft die Cover hinzufügen in PBS Folien.
6. Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem inversen konfokalen Mikroskop (40 x 1.3 NA) ausgestattet mit 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm und 635 nm Laser.
7. 3-d-Z-Stapel von 0,54 µm Dicke mit optimalen Z-Schnitt für das 40 x 1.3 NA Öl Ziel aufnehmen.
   Hinweis: Die verwendete Software variieren je nach dem individuellen Mikroskop. Ein Beispiel für die Verwendung der Software für ein Mikroskop erfolgt in ergänzende Datei 1.

6. Bildanalyse

Hinweis: die Analyse der Proben erfordert den Einsatz von speziellen bildgebenden Analyse-Software und Beispiele sind in Tabelle Materialien aufgeführt. Während die Analyse der Ergebnisse abhängig von der spezifischen Programm verwendet wird, die unten aufgeführten Punkte sind wichtig.

1. Analyse von BAL-Proben
   1. definieren die Anzahl der Makrophagen durch den blauen Kanal für DAPI auswählen und zuweisen eine Mindestgröße für die Zellen (z.B., > 18 µm im Durchmesser). Mit der entsprechenden Software, die Gesamtzahl der Makrophagen pro Feld messen.
   2. Die Anzahl der Zellen, die die Merkmale einer MET durch die Anwesenheit von extrazellulären Chromatin röntgenologisch DAPI mit Co Ausdruck von anderen Markern (z. B. MMP12, PAD2 und H3Cit).
      Hinweis: Die Anzahl der Markierungen, die analysiert werden können hängt von der Anzahl der Laser zur Verfügung, sondern im Idealfall neben DAPI, sollten mindestens zwei andere Marker einbezogen werden. Andere, weniger spezifische Parameter für MET Ausdruck (z. B. Anzahl der Zellen mit extrazellulären Chromatin und einem erweiterten Kern) verwendet werden.
   3. MET Ausdruck in BAL vergleichen Proben (zwischen Kontrolle, Rauch und Rauch/DNase behandelt Gruppen), ein Minimum von 100 BAL Makrophagen pro Probe.
   4. Zur Messung Sekundärantikörper und Isotype Ebenen der Fluoreszenz zu kontrollieren, ein Minimum von 100 Zellen in jeder Probe für ihre Fluoreszenz zu messen. Messen Sie das durchschnittliche Niveau der Hintergrundfluoreszenz für jede Markierung (z.B. H3Cit) mit standard-Software.
   5. MET Ausdruck definieren zählen die Zellen mit den typischen Phänotyp (z. B. extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit und MMP9) und für jede MET, messen die Höhe der Fluoreszenz von Markern (z. B. H3Cit und MMP9). Zellen produzieren METs, wenn ihre Färbung nicht über Hintergrund und Isotype Kontrolle lag ausschließen.
   6. Für BAL Humanproben, analysieren Sie ein Minimum von 100 Zellen für jede Probe für den Anteil von Makrophagen, die METs zu machen. Für murinen Proben analysieren wie die Zellen kleiner sind und METs schwerer sind zu definieren, eine größere Anzahl von Zellen für jede Probe (z. B. 200 Makrophagen).
2. Analyse von Gewebeproben Lunge
   1. verwenden um festzustellen, das Vorhandensein von METs im Lungengewebe spezifischen Makrophagen Marker wie F4/80.
   2. Definieren die Anwesenheit von METs in Lungengewebe mit Co Lokalisierung von F4/80 in Zellen, die extrazelluläre Chromatin mit anderen Parametern zu äußern, wie in Abschnitt 6.1 aufgeführt.
   3. Bestimmen den Umfang der Hintergrundfluoreszenz in Proben mit sekundären Antikörper und die Isotype-Steuerelemente. Analyse, die nicht über dem Hintergrund METs ausschließen.

Ergebnisse

METs können von BAL-Proben, im Lungengewebe und in dickeren Bereiche der Lunge mit 3-d-Bildern sichtbar gemacht werden. Ein Beispiel der METs visualisiert in einer BAL-Probe ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der METs variiert je nach ihrem Stadium der Reifung. Die ersten nachweisbare Funktion auf Mikroskopie ist die Bewegung des Kerns an den Rand der Zelle. Dies folgt extrazelluläre Chromatin mit anderen Co ausgedrückten Mediatoren, wie H3Cit ...

Diskussion

In diesem Beitrag beschriebene Methode basiert auf, die für die Definition der Präsenz der Netze¹⁴verwendet. Makrophagen sind bei weitem die dominierende Zelltyp in BAL-Proben und diese Methode der Sammlung eignet sich besonders für das Studium der METs. Wenn die roten Blutkörperchen in der BAL vorhanden sind, sollten diese Zellen lysiert werden, mithilfe von Ammoniumchlorid. Das BAL-Verfahren wird in der Regel die Makrophagen aktivieren und daher voraussichtlich werden METs in un-stimulierten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP