Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

Резюме

Макрофагов внеклеточного ловушки являются недавно описан сущности. Эта статья будет сосредоточена на confocal микроскопии методов и как они отображаются в пробирке и в естественных условиях от образцов легких.

Аннотация

Основной метод, используемый для определения присутствия нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) является confocal микроскопии. Мы изменили методы установленных confocal микроскопии визуализировать макрофагов внеклеточного ловушки (Мец). Эти внеклеточные ловушек определяются наличием внеклеточного хроматина с одним выражением других компонентов, таких как зерно протеаз, citrullinated гистонами и peptidyl arginase deiminase (PAD). Выражение Мец обычно измеряется после воздействия на раздражитель и по сравнению с ООН стимулировали образцов. Образцы также включены для фона и изотипа управления. Клетки анализируются с помощью программного обеспечения для анализа четкие изображения. Конфокальная микроскопия может использоваться для определения присутствия Мец как in vitro , так и в естественных условиях в легочной ткани.

Введение

Нейтрофильные внеклеточного ловушки (сетки), были впервые описаны, Бринкманн et al. ¹ они преимущественно производятся в ответ на инфекцию (особенно для бактерий) и имеют важную роль в принимающей обороны^1,2. Они также были описаны в ответ на неинфекционных заболеваний, в том числе васкулит и системная красная волчанка (СКВ); и с Митоген phorbol 12-myrisate 13-ацетат (PMA)^2,3. Недавно было признано, что другие типы клеток может также производить внеклеточные ловушки, включая макрофагов. Внеклеточные ловушки макрофагов (Мец) еще не четко определенной сущности в литературе^4,5. Недавно мы создали методы для обнаружения присутствия Мец как in vitro и in vivo^6,7. В этой статье будут описаны измерения с помощью конфокальной микроскопии Мец.

Основные черты NETosis, которые отличают его от других сотовых пути (например, апоптоз⁸) экструзии хроматина в сочетании с: (1) citrullination гистонами (H3Cit)⁹, (2) совместно выражение гранул протеаз¹⁰ и (3) участии peptidyl аргинин deiminase (PAD) 4^11,12. Макрофаги также выразить H3Cit, гранул протеаз и PAD, и эти функции могут использоваться для определения присутствия Мец.

Мец может иметь особенно важную роль в легких, как макрофагов является доминирующей в альвеолы и авиалинии легкя и первоначальный роль в управлении клеточный иммунный ответ на инфекции/воспаление. Кроме того в то время как большая часть легких является пустое пространство (например, в альвеолы), Мец потенциально способны расширить пространство, в отличие от солидных органов.

Наиболее широко используемый метод для определения наличия сетей является confocal микроскопии. Четко определенный способ измерить Мец еще не существует. Техника для измерения сеток была адаптирована для измерения присутствия Мец в настоящем Протоколе. Основные требования для данного метода являются доступ к confocal микроскопии и соответствующих изображений программное обеспечение для анализа.

протокол

этот протокол следует эксперименты, утвержденных в: (1) люди Комитет этики Монаш медицинский центр, и (2) животных Комитетом по этике университета Мельбурна.

1. макрофаги Бронхоальвеолярный лаваж (BAL)

1. использования бал для получения легких макрофагов в: (1) человека предметов, бронхоскопия ⁶ и (2) мышах с использованием внутри трахеи стремление ¹³ .
   Примечание: Приобретение макрофаги обычно вызывает некоторые активации этих клеток. Макрофаги получаются от пациентов, которые требуют бронхоскопии расследовать потенциальные медицинские проблемы, и не все предметы могут быть пригодны для анализа Мец (это нужно будет определяться для каждого конкретного проекта).
   1. Взять на бал решения и спин вниз (500 x g 10 мин) в форме гранул, мыть дважды с питательной среды (Розвелл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) с сывороткой плода теленка 5% и 1% L-глютамин) при комнатной температуре и затем разбавить клетки в 4 мл medi культуры ум.
   2. В случае необходимости, запросить официальное дифференциальных игр; большинство клеток (обычно > 80%) будет макрофаги ⁶.
      Примечание: Это будет обычно осуществляться клинические гистология службы с использованием морфологических появление клеток разных типов ⁶.
   3. Выполнять жизнеспособной макрофагов ячейки рассчитывать на бал решения, с помощью исключения Трипановый синий и Горяева.
      Примечание: Бал получено решение от людей и мышей как упомянуто на этапе 1.1.
   4. Добавить 1-4 x 10 ⁵ макрофагов в 24-ну пластины на coverslips в 500 мкл питательной среды на колодец и оставить на ночь при 37 ° C; клетки будут придерживаться coverslips. Для человека образцов, добавить антибиотики (например, пенициллина и стрептомицина, 10 ⁴ ед/мл) для предотвращения бактериального загрязнения.

2. Маркировка/иммунофлуоресценции макрофагов бал

Примечание: клетки соблюдаются на coverslips, как упомянуто выше.

1. Удалить питательной среды и вымыть клетки один раз с-фосфатный буфер (PBS). Исправить клетки в 2% параформальдегида/Периодат/Лизин (ПЛП) фиксатором для 10 мин
2. Мыть клетки кратко в PBS и затем разрушения в 0,2% 20 анимации в PBS на 20 мин
3. Блок клеток с 10% курица Сера в 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) разводят в PBS на 30 мин
Антитела
4. инкубировать с начальной и изотипа управления за 1 ч при комнатной температуре в концентрации 1: 100 (более подробные сведения приведены в Таблице материалов) при 37 ° с.
   Примечание: Для образцов бал, конкретные маркер макрофагов обычно не требуется.
5. После добавления первичных антител, вымыть клетки в PBS, далее и инкубировать и с соответствующими вторичные антитела для 40 мин при комнатной температуре.
6. Мыть в подразделах PBS и горе с среднего на основе DAPI монтажа для визуализации с помощью конфокального микроскопа (как упоминалось выше) в лазерной возбуждений 405, 488, 561 и 647 Нм и 40 X, 1.0 NA масло цель.

3. Образцы тканей легких

Примечание: в vivo исследований легочной ткани, изучение образцов после соответствующего воздействия (например, как описано в O ' Салливан и др. ⁷). экспозиции, которая является наиболее актуальной для этого эксперимента являются инфекционные микроорганизмы, особенно бактерии. Мышь штаммов, которые могут быть использованы для данного метода являются мышей C57BL/6 или BALB/c, 10-12 недель, вес 25-30 г и мужчины.

1. Euthanize мышей, через внутрибрюшинного введения кетамин (400 мг/кг) и ксилазина (40 мг/кг). Откройте грудной полости и разоблачить легких и сердца с помощью Щипцы хирургические и ножницы.
   1. Влить теплую PBS с помощью 21-иглы в правый желудочек промыть крови из сосудов для 30 сек, затем влить 10 мл 2% ПЛП фиксатором для 30 s (в правый желудочек).
   2. Использовать теплый PBS (42 ° C) для промывания открытой грудной полости. Интубации трахеи с 21-иглы и кусок трубы 0,8 мм, нарезанные по размеру и придать 800 мкл подогретым (до 42 ° C), легкоплавких пункт 3% раствор агарозы.
   3. Галстук покинуть трахеи с плетеные шелковые (4.0 USP). Поместите нить вокруг трахеи, чуть ниже точки вставки канюля и закрепите его через простой зашитый узел. Чтобы укрепить агарозы, администрировать ледяной PBS вокруг легких. Удаление легких и сердца как блок из грудной полости, используя ножницы и тупым рассечение. Удаление каждого легкого индивидуально и исправить их для 16 h в 2% ПЛП или формалина в 4 ° C.
   4. Хранить образцы в PBS на 4 ° C до разрезания ткани. Эти методы для получения легочной ткани были ранее описанных ¹³.
2. Подготовить легочной ткани образцы выполните следующие действия.
   1. Исправить ткани легких тканей (резецируется шаге 3.1) в природных амортизированное формалина 10% за 24 ч при комнатной температуре. Трансфер в 75% этанола и положить в процессоре ткани на 12 h цикла, (2,5 ч в 75% EtOH, 3 h в абсолютной EtOH, 3.5 h в жидкостной 3B и 3 h в парафин).
   2. Вставить Стандартный парафин для создания формалин исправлена, парафин врезанных блоков (FFPE), которые хранятся при комнатной температуре.
      Примечание: На данном этапе, это обычно удобно вырезать легких разделы для стандартных слайды.
   3. Сократить разделы легких FFPE толщиной 4-5 мкм, используя микротом и смонтировать на обвинение, покрытые слайды, как описано ранее, O ' Салливан и др. ⁷
   4. монтировать слайды, положить 3 капли среднего монтажа на coverslips 60 x 24 мм (размер 1.5), инвертировать слайд на coverslip и вытолкнуть превышение среднего. Герметично печать с лаком и хранить при комнатной температуре.

4. Подготовка/микроскопия образцов ткани легких

1. де воск, увлажняет и предварительной обработки образца ткани легких FFPE антигена поиска решения.
   1. Печь сухой FFPE горки для 60 мин при 60 ° C. Затем положите слайды в ксилоле решение для 30 мин и передачи 70% этанола раствор для 5 мин при комнатной температуре. Промыть в воде из крана.
   2. Место в жаропрочной пластиковой пленкой и при условии получения HIER-антигена в скороварке 10 мин в 10 м/моль/Л трис, 1 ммоль/ЭДТА рН 9,0. Cool для 20 мин мыть дважды в проточной воде в течение 5 мин на рокер, затем один раз с PBS на качалку.
   3. Блок с курицей 10% сыворотки в 5% BSA/PBS на 30 минут при комнатной температуре.
2. Пятно ткани.
   1. Определить Мец в макрофагах, добавить первичного антитела (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 1% BSA/PBS для 16 ч при температуре 4 ° C при разбавлении 1/100 (конкретные сведения о суммах антитела, перечислены в Таблице материалов). Мыть два раза с PBS для 5 мин на рокер.
   2. Достичь Флюоресцентная детекция инкубации с соответствующей средней антител в 1% BSA/PBS для 40 мин при комнатной температуре. Антитела являются: (1) курица анти мышь 488 (зеленый), Коза (2) курица анти 594 (красный), (3) осла анти мышь и 647 (далеко красный).
   3. Мыть в подразделах PBS и горе с DAPI-содержащих монтажа средних для окрашивания хроматина.
3. Получения флуоресцентных изображений с помощью Конфокальная лазерная сканирующая головка, придает инвертированным микроскопом.
   1. Excite подготовку с 405, 488, 561 и 647 нм лазеры. Захватить один самолет 512 x 512 пикселей изображения, нажав на линии последовательный, выравнивание кнопки (2 линии в среднем) с помощью 20 X 0.1 NA воздуха и 40 X 1.0 NA масло целей.
   2. Получить по крайней мере десять полей зрения на секцию для анализа и данных для каждого результата (т.е., 10 мощных поля зрения (ВОВЛ) для элемента управления, 10 для стимулировали образца, и т.д., для каждой мыши).
      Примечание: Для получения репрезентативной выборки поля целиком, матричная система может использоваться в котором поле делится на различные разделы и для каждой другой образец, же матрица используется для выбора поля зрения (например, поле можно разделить на 9 разделов, и от центра и 4 углах, принимаются два ВОВЛ).

5. Трехмерной (3-D) Imaging Мец

Примечание: как 3-D структуры, Мец, принимая несколько z стек изображений, которые являются восстановленный, может дать ценную информацию.

1. Раздел образцов легких от парафиновых блоков, на 200 мкм, с помощью vibratome в амплитуде в 1,8 мм, скорость 0,1-0,5 мм/s.
2. Блок легочной ткани с 20% соответствующих сыворотки (10% плода телячьей сыворотки и куриные 10% сыворотки) и затем разрушения в PBS дополнены и 3,75% Тритон-X 100 для 7 ч при комнатной температуре под нежным агитации.
3. Пятна в разделах 16 ч при температуре 4 ° C с соответствующих первичных антител (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 200 мкл томах в microcentrifuge трубы (концентрации антитела, перечислены в Таблице материалах).
4. Вымойте разделы в PBS, 3 раза за 10 мин до инкубации с соответствующими вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 ч.
5. Пятно легких разделы для DAPI (1:5, 000) в растворе для 20 минут, прежде чем Добавление обложки скользит в Микроскоп слайды в PBS.
6. Получить флуоресценции изображения с помощью Перевернутый конфокального микроскопа (40 x 1.3 NA) оснащены 405 нм, 440 Нм, 473 Нм, 543 Нм и 635 нм лазеры.
7. Запись 3-D z стеки 0,54 микрон толщины с оптимальной z секционирование для цели нефти NA 40 x 1.3.
   Примечание: Программное обеспечение, используемое будет варьироваться в зависимости от индивидуальных микроскопа. Пример как программное обеспечение может использоваться для одного Микроскоп приводится в дополнительных файлов 1.

6. Анализ изображений

Примечание: анализ образцов требует использования конкретных изображений программного обеспечения анализа и примеры перечислены в Таблице материалов. Хотя анализ результатов будет зависеть от конкретной программы используется, перечисленные ниже моменты важны.

1. Анализ бал образцы
   1. определить количество макрофагов, выбрав синий канал для DAPI и назначение минимальный размер для ячеек (например, > 18 мкм в диаметре). С помощью соответствующего программного обеспечения, измерять общее количество макрофагов в поля.
   2. Подсчитать количество ячеек, которые имеют функции ВСТРЕТИЛ наличием внеклеточного хроматина, обнаруженных DAPI с одним выражением других маркеров (например, MMP12, PAD2 и H3Cit).
      Примечание: Количество маркеров, которые могут быть проанализированы зависит количество лазеров доступно, но в идеале помимо DAPI, по крайней мере два других маркеры должны быть включены. Другие менее конкретные параметры для ВСТРЕТИЛ выражение (например, количество ячеек с внеклеточного хроматина и расширенного ядро) может быть использован.
   3. Сравнить ВСТРЕТИЛ выражение в BAL образцы (между управления, дыма и дыма/DNase рассматриваться группами), анализировать как минимум 100 бал макрофагов на сэмпл.
   4. Для измерения вторичного антитела и изотипа контролировать уровни флюоресценции; измерить минимум 100 клеток в каждом образце для их флуоресценции. Измерить средний уровень фона флуоресценции для каждого маркера (например, H3Cit) с помощью стандартного программного обеспечения.
   5. Для определения выражения MET, подсчитать количество ячеек с типичной фенотипу (например, внеклеточная хроматина с одним выражением, H3Cit и MMP9) и для каждого MET, измерить уровень флюоресценции маркеров (например, H3Cit и MMP9). Исключить клетки, вырабатывающие Мец, если их окрашивания не был выше управления фон и изотипа.
   6. Для человека бал образцов, анализировать как минимум 100 клеток для каждого образца для процент макрофаги, которые делают Мец. Для мышиных образцов, как клетки меньше и Мец труднее определить, анализировать большее количество клеток для каждой выборки (например, 200 макрофаги).
2. Анализ образцов ткани легких
   1. для определения наличия Мец в легочной ткани, используйте маркер конкретных макрофагов например F4/80.
   2. Определить наличие Мец в легочной ткани с помощью совместного локализации F4/80 в клетках, которые выражают внеклеточного хроматина с другими параметрами, перечисленных в разделе 6.1.
   3. Определяют уровни фона флуоресценции в образцах с вторичные антитела и изотипа элементов управления. Исключить из анализа, что не выше фона Мец.

Результаты

Мец могут быть визуализированы бал образцов, в легочной ткани и в толще секций легких с 3-D изображения. Пример Мец, визуализируется в BAL образец показан на рисунке 1. Морфология Мец будет зависеть от стадии их созревания. Первая особенность обнаружению п?...

Обсуждение

Метод, описанный в данном обзоре основан на который используется для определения присутствия сети¹⁴. Макрофаги являются на сегодняшний день доминирующей ячейки типа в образцах бал, и этот метод коллекции особенно подходит для изучения Мец. Если красные кровяные клетки при?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP