الانضمام للبكتيريا لزراعة الأسطح قياسها في المختبر

Ann G. Matthysse

doi:10.3791/56599

Summary

هي طريقة سهلة لقياس ووصف التصاق البكتيريا إلى النباتات وخاصة الجذور وبراعم، الموضحة في هذه المقالة.

Abstract

هذه المخطوطة وصف أسلوب قياس ربط البكتيرية على أسطح النبات أكسينيك في المجهر الخفيفة، ومن خلال استخدام عدد خلايا قابلة للحياة. المواد النباتية المستخدمة تشمل جذور وبراعم وأوراق وقطع الفواكه. الأساليب الموصوفة رخيصة وسهلة ومناسبة لأحجام عينة صغيرة. يتم قياس ملزمة في المختبر ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الوسائط الحضانة وشروط. ويمكن تحديد تأثير مثبطات. ويمكن أيضا تقييم الحالات التي تعزز وتمنع ملزمة. من الممكن في بعض الحالات التمييز بين ما إذا كان تغيير مختلف الظروف ملزمة أساسا بسبب آثارها على النبات أو البكتيريا.

Introduction

قياس البكتيرية الملزمة لزرع السطوح أصبح هاما في ثلاث حالات متباينة. الحالة الأولى هي النظر في نقل مسببات الأمراض البشرية في مصنع السطوح¹^،^،من²³. والهدف هنا هو لمنع الربط البكتيرية أو لإزالة أو تقتل بكتيريا ملزمة، وبالتالي الحد من انتقال المرض من المواد النباتية. والحالة الثانية هي النظر في ربط مسببات أمراض النبات لزراعة الأسطح⁴. مرة أخرى والهدف هنا هو لمنع الربط أو لإزالة أو تقتل بكتيريا ملزمة، وبالتالي للحد من المرض. والحالة الثالثة هي دراسة الربط من البكتيريا التكافلية أو تشجع على نمو النبات⁵^،⁶. والهدف هنا تعزيز البكتيريا ملزم، وبالتالي إلى زيادة صحة النباتات والمحاصيل غلة.

تقنيات لقياس البكتيرية الملزمة لزرع السطوح الموضحة في هذه المقالة رخيصة وسهلة نسبيا للقيام. المتطلبات الوحيدة هي مجهر والمواد التي توجد عادة في مختبر علم الجراثيم. سونيكاتور حمام مفيد لبعض التقنيات. صممت التقنيات الموضحة لربط التجارب التي أجريت باستخدام أحجام عينة صغيرة نسبيا. قياسات لربط مصنوعة في المختبر، على الرغم من أنه قد يكون من الممكن لتعديل بعض هذه التقنيات لاستخدامها في الدفيئة أو في الميدان.

وقد استخدمت هذه التقنيات لقياس ربط البكتيرية على جذور وبراعم وأوراق قص وقطع الفواكه والطماطم سليمة في المختبر⁷^،^،من⁸⁹^،¹⁰^،¹¹^، ¹²^،¹³^،^،من¹⁴¹⁵. أنها استخدمت أيضا قياس استعمار الجذر للنباتات التي تنمو في التربة أو الرمال في مختبر¹⁶. وقد استخدمت التقنيات مع العديد من أنواع الجراثيم بما في ذلك توميفاسينس المتبعة، الرايزوبيوم سينورهيزوبيوم، الإشريكيّة القولونية، انتيريكا السالمونيلا، و المتألقة Pseudomonas. يمكن الاطلاع على وصف مفيدة لأساليب لتقييم التفاعل بين A. tumefaciens مع الأسطح في مورتون وفوكوا (2012)¹⁷. وفي جميع الحالات كانت أحجام العينات المعنية صغيرة، عموما أقل من النباتات 25-50. التقنيات الموضحة مناسبة للاستخدام مع مسببات الأمراض البشرية التي تحتاج أن تبقى الواردة خلال التجارب.

Protocol

1-إعداد المواد النباتية أكسينيك

تحضير الشتلات التي تزرع في المياه.
1. وضع عدد قليل من البذور (أقل من 30) في 30 أو 50 أو 100 أو 150 مل زجاج الكأس. وقد استخدمنا الطماطم، البرسيم، التمويل نبات، البازلاء، الفول، والتبغ والخس وبذور الجزرة مع هذا البروتوكول.
  ملاحظة: لتحديد يمكن تعقيم البذور كم معا دون التلوث ينتشر من البذور واحد إلى آخر, راجع الخطوة 1.1.2.
2. تغطية البذور مع الإيثانول 80% ودوامه بإيجاز. واسمحوا بذور ينقع لمدة 1 دقيقة.
3. من أجل إيقاف الإيثانول وتغطية البذور بمحلول 50% من الحجم التجاري التبييض (ناكلو) و 0.1% X-100 تريتون في مياه الحنفية. واسمحوا بذور ينقع لمدة 20 دقيقة.
  ملاحظة: إذا كانت البذور كبيرة، مثل بذور الفول، قد يكون من الضروري على إطالة الوقت حوضاً لقتل الفطريات على سطح البذور تماما.
4. من أجل إيقاف هذا الخليط التبييض وتغسل البذور 3 مرات بالماء المعقم. واسمحوا بذور ينقع في الماء لمدة 1 دقيقة لكل غسل.
5. للحصول على شتلات أكسينيك إضافة كمية صغيرة من الماء المعقم بين 5 و 25 مل تبعاً لحجم البذور. صب البذور والماء في طبق بتري معقم لإنبات البذور.
  ملاحظة: يجب أن تغطي الجزء السفلي من الطبق الماء لكن لا تشمل البذور لتشجيع تشكيل الشعر الجذر. أكسينيك يصف ثقافة فيها فقط نوع واحد من الكائن الحالي.
6. احتضان في الظلام حتى تصل الشتلات إلى الحجم المطلوب بين 1 سم و 10 سم (حوالي 5 أيام للطماطم و التمويل (أ) و 1 إلى 3 أيام البرسيم). لبذور أكبر استخدام حاوية معقمة مغطاة بسعة أكثر من 100 مل كصحن زجاج مغطاة بإحباط.
تحديد تواتر تلويث الكثير البذور خاصة مع الكائنات الدقيقة التي تظل قابلة للتطبيق على أو داخل البذور بعد التعقيم السطحية.
ملاحظة: هذا ضروري نظراً لأن البذور أحياناً تحمل الكائنات الحية الدقيقة تحت معطف البذور التي لا يمكن قتل بالسطح-التعقيم. استخدام تواتر البذور الملوثة في الكثير بذور لتحديد كيفية العديد من البذور لتعقيم في وقت واحد بدون مخاطر عالية من المجموعة البذور أصبحت ملوثة نظراً للبذور واحدة مع البكتيريا أو الفطريات التي البقاء على قيد الحياة في العلاج.
1. القيام بخطوات 1.1.1 من خلال 1.1.3.
2. ضع البذور في أجار مغذيات طبق بيتري. حوالي 10-30 البذور في كل طبق تباعد لهم حيث أنه يمكن أن يكون سجل على حدة. ختم الأطباق مع الفيلم الشريط أو الختم.
3. احتضان لمدة 3-5 أيام عند 25 درجة مئوية، سجل كل يوم لثمرة مرئية للكائنات المجهرية من البذور.
تحضير الشتلات التي تزرع في الرمال. يمكن زراعة الشتلات في الرمل لاستخدامها في التجارب التصاق البكتيريا.
1. القيام بخطوات 1.1.1 من خلال 1.1.3.
2. رمال الكوارتز أو البحر في اﻷوتوكﻻف تعقيم. كل من هذه تحتوي على بعض المواد العضوية. إذا كان هذا سيؤثر على التجربة، غسل الرمال التي تغطي مع ضعف حجمها من 0.1 M HCl. المزيج لدقيقة 10 السماح الرمال تسوية، ومن أجل إيقاف السائل. شطف الرمل 3 مرات بالماء، ومرة واحدة مع 80 ٪ الإيثانول تليها اثنين يشطف كميات إضافية من الماء باستخدام البروتوكول نفسه أما بالنسبة 0.1 M HCl. تعقيم الرمل المغسول في اﻷوتوكﻻف.
3. تعقيم الحاويات التي غمر بها في التبييض 50% لمدة 5 دقائق ويشطف منهم 5 مرات بالماء المعقم بغمر. تسمح لهم الجاف وختم الجزء السفلي مع ختم الفيلم. الفيلم كما تم الحصول عليها من الشركة المصنعة عموما خالية من الكائنات الحية الدقيقة في الداخل الجانب الذي ينبغي أن توضع في مواجهة داخل الحاوية.
4. مزيج من الرمال العقيمة مع الماء المعقم ما يكفي الرطب فإنه يكفي أن العصي الرمال معا. المبلغ الذي سيعتمد على الرمال الجافة كيف. 10-35% حجم الرمال عادة كافية. ضع الرمل الرطب في حاوية السماح بالعمق الكافي لطول جذور المساحة اللازمة والكافية فوق الرمال للنمو في تبادل لإطلاق النار. المسافات الدقيقة التي تعتمد على الأنواع ومجموعة متنوعة من النباتات المستخدمة.
5. بذور النباتات.
  1. جعل حفرة ضحلة في الرمال بقضيب زجاج معقمة عمق الكافي لوضع البذور تحت سطح الرمال (حوالي 1-5 مم). ضع البذور في الحفرة. تغطية بطبقة رقيقة من الرمل. ختم أعلى الحاوية بختم الفيلم لمنع فقدان الماء والمدخل للميكروبات إضافية.
  2. تنمو النباتات في المختبر تحت ضوء أو الاحتباس الحراري في درجة حرارة مناسبة، وطول النهار للأنواع ومجموعة متنوعة من النباتات. للطماطم، استخدام البرسيم، أو التمويل نبات درجة حرارة الغرفة ودورات الضوء/الظلام ح 12.
6. زراعة الشتلات في حفرة في الرمال (1-2 ملم في القطر وعميق ما يكفي أنه سيتم تغطية الجذر بالرمل). جعل الحفرة بقضيب زجاج عقيمة. دليل الجذر بعناية في حفرة استخدام ربط عقيمة الفولاذ المقاوم للصدأ الكروشيه إذا لزم الأمر وملء جانبي الحفرة بالرمل.
وبدلاً من ذلك، تنمو النباتات أكسينيكالي أو في أجار تحتوي على خليط من أملاح مثل أملاح MS. يطلق النار على استخدام أكسينيك النباتات المزروعة في أجار مباشرة. تجنب الجذور التي نمت مع أجار كما أجار العصي على سطح النباتات والبكتيريا. قد يؤدي هذا انطباعا خاطئا لالتصاق البكتيريا على سطح النبات.

2-إعداد المواد النباتية الأخرى

غسل المواد النباتية التي تزرع في الدفيئة بالماء قبل استخدامها تقليل عدد الميكروبات الأصلية. وسوف يكون هناك البكتيريا والفطريات في النباتات. ستكون موجودة في التربة وعلى الجذور، وربما يترك البروتوزوا. الغسيل مع التبييض أو الإيثانول سوف يغير سطح النبات وغير مستحسن.
1. إذا كان بعد الغسيل المياه أعدادا كبيرة من الجراثيم تبقى أو معاملة النباتات مع صابون سائل مخفف أو تمييع بيروكسيد الهيدروجين (0.01 ٪) إزالة أو قتل الميكروبات. هذا عموما أقل إتلاف إلى المصنع من التبييض أو الإيثانول.
كما أن من الصعب إزالة التلوث من المواد النباتية التي تم شراؤها في سوق محلي، اختيار المواد التي لا يبدو أنها خضعت للتخزين الطويل. تجنب أجزاء من المواد التي تظهر البنى أو معطوب.
1. غسله بالماء، وإجراء تخفيضات جديدة على طرفي المواد التي قطعت سابقا قبل استخدامها، ما لم يكن هناك تفاعلات البكتيريا اختبار مع البكتيريا (وحقيقيات النوى) التي سوف تراكمت في مواقع قطع الفائدة. لا تغسل بالتبييض أو الإيثانول كما أنها ستغير سطح النبات.
معالجة المواقع الجرح. وكثيراً ما توفر مواقع الجرح البكتيريا الوصول إلى المناطق الداخلية من المواد النباتية¹⁸.
1. منع أو الحد من مرفق البكتيرية، وتنقل عن طريق الجرح أو قطع المواقع التي تم إنشاؤها في إعداد المواد بغمس حافة قطع في البارافين المذابة أو بواسطة اللوحة الموقع مع البارافين ذاب باستخدام فرشاة صغيرة. لا تستخدم ملعقة أو أي تنفيذ حادة كهذا قد تلحق الضرر الأنسجة.
2. وتنبع ختم ندوب على الفاكهة مثل الطماطم مع البارافين. بعض أنواع البكتيريا سوف تسبح في المنطقة الخاضعة البارافين، لكن أعدادهم ضئيلة عموما.
3. إذا كان دخول البكتيريا إلى مواقع الجرح باهتمام، تقدير المسافة التي يمكن نقل البكتيريا التي يحملها مجاري المياه أو نشر عن طريق مراقبة حركة صبغة إضافتها إلى الحل. مارك البكتيريا متحركة بإدخال جينات ترميز بروتين فلوري مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) إلى لهم وتتبع لهم استخدام مجهر الأسفار الموصوفة في الخطوة 6.1.2¹⁹.

3-إعداد البكتيريا

تنمو البكتيريا. استخدام متوسط الذي يقترب من أوثق الشروط البكتيريا من المحتمل أن تعرضوا لمباشرة قبل تواجه المصنع في العالم الحقيقي خارج المختبر. مصادر الكربون والنيتروجين فضلا عن وجود أيونات، لا سيما divalent الكاتيونات (Ca، Mg، Fe، Mn، والزنك) والفوسفات، ودرجة الحموضة في المتوسط هامة.
1. استخدام الحد الأدنى AB المتوسطة أو مرق لوريا A. tumefaciens وغيرها بكتيريا التربة²⁰. كولاي، التي قد تنشأ في القناة الهضمية، واستخدام مرق لوريا.
2. إضافة مستحثات مثل الإفرازات الجذرية أو المستخلصات النباتية التجارية مثل سويتون أو السكريات مثل السكروز أو إكسيلوسي إلى متوسطة²¹. إذا كانت هذه المواد تستخدم مستحثات، إضافة تركيزات منخفضة، فعلى سبيل المثال 0.01 في المائة. إذا كانت مصادر الكربون المستخدمة، إضافة تركيز أعلى، على سبيل المثال 0.1%.
تعد العدوى البكتيرية. تضعف البكتيريا في الماء المعقم أو في الأجل المتوسط التي ستنفذ الحضانة وإضافتها إلى المواد النباتية. تناقش الخطوات 4.2 و 4.3 التخفيف المناسبة.
1. قم بإزالة وسائط النمو قبل استخدام البكتيريا، الطرد المركزي بتعليق البكتيرية في 10,000 س ز 2 دقيقة، من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند البكتيريا التي فورتيكسينج لهم في الأجل المتوسط نفسها التي ستستخدم للحضانة مع المواد النباتية. هذا الأسلوب قد إزالة أو تقليل عدد أو كمية المواد خارج الخلية والملاحق مثل والانسيابيه وكبسولات وفلاجيلاي، بيلي. إذا كان من المهم أن تظل هذه الهياكل السطحية سليمة، ثم ببساطة تضعف البكتيريا قبل تطعيم لهم أو استخدام الطريقة البديلة الموضحة في الخطوة 3.2.2.
2. كأسلوب بديل لإزالة المتوسطة النمو، جمع البكتيريا في عامل تصفية النيتروسليلوز أو البولي مع حجم مسام 0.2 ميكرون أو أقل. يغسل البكتيريا مع المتوسطة الحضانة وريسوسبيند لهم بهز لطيف أو فورتيكسينج عامل تصفية في حاوية معقمة من المتوسط.

4-التطعيم للبكتيريا

تحديد العدد من البكتيريا على تلقيح فيما يتعلق بالقياس إلى استخدامها لتحديد التصاق البكتيريا وطول فترة الحضانة.
الدراسات المجهرية التي تنطوي على احتضان مرات أقل من 1 يوم تلقيح عدد كبير نسبيا من البكتيريا. إضافة مبلغ قدرة الثقافة للوصول إلى تركيز بكتيرية نهائي لأكثر من 10⁶البكتيريا كل مل. لأوقات أطول في الحضانة إنقاص حجم العدوى البكتيرية.
للدراسات التي سيقاس التصاق البكتيريا بعدد خلايا قابلة للاستمرار، إضافة مبلغ الثقافة للوصول إلى تركيز بكتيرية نهائي من 10³ إلى 10⁶البكتيريا كل مل.
تجنب إضافة العديد من البكتيريا أن بهم الأيض يتغير تركيز الأس الهيدروجيني أو الأكسجين في الأجلين المتوسط والحضانة. مقياس الأس الهيدروجيني باستخدام ورق pH أو قطب. قياس تركيز الأكسجين باستخدام قطب أكسجين.
للنباتات التي تزرع في الرمال، تطعيم بثلاثة طرق ممكنة.
1. تلقيح البذور بالبكتريا قبل الغرس بنقع البذور لمدة 1 دقيقة في تعليق في المياه لحوالي 10⁶ البكتيريا كل مل.
2. تطعيم الجذرية قبل الإنبات شتلات أكسينيك كما هو موضح في القسم 1، وعندما يكون طولها حوالي 1 سم غمس أنه جذر الشتلة أو وضع الشتلة كاملة في تعليق 10⁶البكتيريا كل مل في الماء لمدة 1 دقيقة.
3. تلقيح الرمل بخلط البكتيريا بالرمل قبل الغرس لإعطاء تركيز نهائية لحوالي 10³ البكتيريا كل مل أو سقي الشتلات مع تعليق 10⁶ البكتيريا كل مل بعد الغرس.

5-حضانة البكتيريا مع المواد النباتية

للحضانة في وسائل الإعلام السائلة، احتضان البكتيريا مع المواد النباتية في الماء المعقم أو السكروز والمعدنية أملاح أو زرع الأنسجة الثقافة المتوسطة (مثل 01:10 إضعاف أملاح MS)²²^،²³.
1. استخدام حاوية التي لا تتقيد البكتيريا. في محاولة للحفاظ على سطح النبات مغطاة باستمرار بغمر أو بتحريض لطيف. وقد منع التصاق الانفعالات قوية أو حتى إزالة البكتيريا من سطح النبات.
2. مراقبة المواد النباتية في المجهر الخفيفة بعد الفواصل الزمنية لتحديد متى يتم إيقاف في الحضانة، وإجراء قياسات متفاوتة. دورة وقت للالتصاق غالباً قيمة مع العينات المأخوذة من كل ح 1 إلى 4 أو يوميا اعتماداً على سرعة التفاعل.
لاحتضان في الرمال، تنطبق نفس الاعتبارات المذكورة للحضانة في المتوسط السائل في الخطوة 5، 1.

6-قياس الالتصاق باستخدام الفحص المجهري

إجراء قياسات المجهرية مع بصريات نومارسكي أو مرحلة التباين لسهولة المشاهدة للبكتيريا على الأسطح. ومع ذلك، يمكن استخدام أي مجهر مشرق الميدانية مع تكبير 20 X أو أعلى.
1. استخدام الملاحظة المجهرية لتحديد إذا كانت البكتيريا عشوائياً وزعت أو تقع في مواقع محددة. أيضا التحقق من ما إذا كان أنهم ملزمون منفردة أو في مجموعات. ابحث عن وجود ميكروكولونيس يوحي النمو البكتيرية أو فخ بعد الالتصاق. التحقق من ما إذا كانت البكتيريا ويبدو أن تشكيل بيوفيلم على السطح.
  ملاحظة: بيوفيلم عدد كبير من البكتيريا منضمة إلى السطح ومحاطة مصفوفة خارج الخلية²³^،^،من²⁴²⁵. الهيكل قد تكون متجانسة وموحدة أو بنية أكثر تعقيداً. أساليب لدراسة الأغشية الحيوية المرتبطة بالأسطح النباتية قد وصفت¹⁷.
2. استخدام البكتيريا الموسومة بعلامة نيون. إذا موجودة أخرى البكتيريا والبكتيريا لفائدة يتم تحديدها بواسطة علامة نيون مثل البروتينات الفلورية الخضراء، استخدام مجهر الأسفار لتحديد وجود البكتيريا المعلمة في مجموعات من البكتيريا الأخرى²⁶. للتجارة والنقل، استخدم عامل تصفية مع 490 نيوتن متر الإثارة و 520 nm الانبعاثات.
  1. تحقق من أن علامة نيون لا يؤثر على البكتيريا عن طريق مراقبة التقيد بالمواد أكسينيك خليط متساو البرية نوع البكتيريا والبكتيريا المعلمة من نفس السلالة استخدام البصريات نومارسكي والأسفار. إذا كانت البكتيريا الفلورسنت والظلام مختلطة عشوائياً والحالية بالتساوي ثم العلامة لم تتدخل المقايسة.
تحديد العدد من البكتيريا المرفقة.
ملاحظة: من الصعب جداً تحديد العدد من البكتيريا المرفقة في المجهر. عند الربط على أسطح النبات غير النظامية، من الممكن عموما لا للحصول على قياس كمي. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (لا تناقش في هذه المقالة) يمكن استخدامها لجعل مثل هذه القياسات.
1. عندما البكتيريا مرتبطة بسطح أملس مثل شعر الجذر، عد البكتيريا منضمة إلى حافة الشعر الجذر الواحد مم طول الشعر الجذر. الحرص على استخدام جذر الشعر تقريبا بنفس الحجم والشكل في مقارنة القياسات.
2. لتحديد حجم الكائنات في المجهر، استخدام شريحة تجارية مع علامات قياس على ذلك. مراقبة وتصوير هذه الشريحة في نفس الإعدادات المستخدمة للمواد التجريبية واستخدام الصور الناتجة لتحديد حجم الكائنات في photomicrographs.
إعداد العينة للفحص المجهري.
1. تغسل العينة. نقل العينة إلى قطره من المياه أو الحضانة المتوسطة على شريحة مجهر والاحتفال به مباشرة.
  ملاحظة: هذا له ميزة أنه إذا كان هناك لا النمو البكتيرية أو الموت البكتيرية الفعلية هناك لا يرجح أن تكون العديد من البكتيريا الحرة. أن عدم وجود البكتيريا الحرة كعلامة تحذير أنه قد يكون هناك وفاة البكتيرية أو البكتيرية ملزمة للحاوية التي أجريت في الحضانة. ويرد في الشكل 1تأثير الغسيل العينة.
2. تغسل العينة برفق في وسط المياه أو الحضانة بوضعه في قنينة سائل وعكس القنينة بلطف. ثم وضع العينة على الشريحة المجهر في سائل جديدة للمراقبة.
3. تحميل العينة في سائل استخدام كشف الغطاء العادي وشرائح المجهر.
  1. إذا كانت العينة سميكة وذلك من شأنه أن يجعل انتفاخ تحت بكشف الغطاء، استخدم زلة غطاء بريسابلي. وقد كشوف تغطية هذه حلقة من المطاط أو البلاستيك حول حافة بكشف الغطاء. وضع السائل وعينه في البئر في كشف الغطاء ثم ضع الشريحة في الأعلى واضغط برفق لختم بكشف الغطاء إلى الشريحة. عكس ودراسة.
  2. بدلاً من ذلك استخدام طحالب عد الشريحة وكشف الغطاء بطريقة مماثلة. لاحظ أنه لا يمكن دراسة الشرائح مع هذا العمق عموما مع عدسة الهدف أكبر من 20 X التكبير.

figure-protocol-13969
الشكل 1 : خطوات في إعداد نموذج لتحديد العدد من البكتيريا منضم. A. tumefaciens ملزمة للطماطم جذر الشعر (أ وب وج) وخيوط النايلون (دال وهاء وواو). في العينات التي شنت في المياه دون غسل كل ملزمة البكتيريا (الأسهم السوداء) ويمكن مشاهدة البكتيريا الحرة (الأسهم البيضاء) (A و D). بعد الغسيل تظل البكتيريا منضم ولكن البكتيريا الحرة ولكنها لم تعد في الوقت الحاضر (ب) و (ه). بعد sonication البكتيريا ملزمة قد أزيلت من على سطح العينة (C و F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

إذا استخدمت البكتيريا الفلورسنت، فحص العينة بالمجهر بعد إزالة الرمال. جذور النباتات التي تزرع في الرمال لا عموما مناسبة للفحص المجهري جزيئات الرمال تتداخل مع ملاحظة البكتيريا.
1. إزالة النبات من حاوية نمو وفقا للخطوة 7. وضع الجذور في حاوية للمياه وتخلط برفق لإزالة الرمال التي سوف تستقر في الجزء السفلي من الحاوية.
2. إزالة النبات من مياه الغسيل وجبل عينة كما هو الحال في الخطوة 6.3.3.

7-قياس التصاق الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام حساب

تحديد العدد من البكتيريا المرفقة قابلة للتطبيق باستخدام سونيكاتور.
1. إزالة البكتيريا غير منضم. ضع العينة في قنينة بالماء الكافي، غسل المتوسطة المخزن المؤقت أو الحضانة لتغطية المواد النباتية وعكس القنينة عدة مرات.
  1. إذا كان هناك أكثر من 10³ البكتيريا الحرة كل مل في الحضانة الأولى، أداء الغسالات متسلسلة إزالة كل منهم. تحقق في مجهر خفيفة (راجع الخطوة 6.3) لتحديد وجود البكتيريا الحرة.
  2. تغسل حتى يكون هناك انخفاض كبير في العدد من البكتيريا الحرة ولكن تذكر أن هناك توازن بين البكتيريا المنضمة وغير المنضمة، حيث قد ينخفض العدد من البكتيريا الحرة ابدأ إلى الصفر.
2. إزالة النموذج من القنينة في الغسالة مع الملقط أو ملعقة.
3. تحديد العدد من البكتيريا منضم في إينكوبيشنز نباتات في السائل.
  1. تعليق العينة غسلها في قنينة وتغطية ذلك بقياس حجم المياه، والمتوسطة الحضانة، أو المخزن المؤقت للغسيل. استخدام سائل ما يكفي لتغطية العينة. مكان القنينة في سونيكاتور حمام و sonicate عليه لمدة دقيقة واحدة.
  2. إزالة العينة وفحصها تحت المجهر لتحديد ما إذا كانت البكتيريا ملزمة قد أزيلت من المصنع الخفيفة. ويرد في الشكل 1إزالة البكتيريا من عينة من sonication. إذا كان هناك لا تزال ملزمة البكتيريا الموجودة تستمر سونيكاتينج العينة حتى هذا وقت الذي لا تزال لا البكتيريا المنضم على سطح العينة. إذا كان لا يمكن إزالة البكتيريا منضم ب sonication، إضافة رمال الكوارتز العقيمة 1-10 مغ/مل وتكرار sonication والفحص المجهري.
  3. تحديد أن الإجراء سونيكيشن الذي يبدو أكثر فعالية في خطوة 7.1.3.2 لا يقلل من جدوى البكتيريا بتعليق البكتيريا من ثقافة سائل في الحل لاستخدامها ل sonication (إضافة رمال الكوارتز، إذا كان من الضروري). تحديد عدد خلايا قابلة للحياة. Sonicate البكتيريا وتحديد عدد خلايا قابلة للحياة مرة أخرى.
    ملاحظة: إذا كان هناك انخفاض في عدد خلايا قابلة للحياة، قم بتعديل الإجراء بتغيير تكوين الوقت السائل و/أو سونيكيشن حتى العلاج ليس له أي تأثير على عدد خلايا قابلة للحياة.
  4. تحديد أن إضعاف المخزن المؤقت المستخدم لعدد خلايا قابلة للحياة لا يؤثر على بقاء البكتيريا التي قد تم المحتضنة تحت ظروف استخدامها عن طريق مقارنة عدد خلايا قابلة للتطبيق باستخدام المخازن المؤقتة لتمييع مختلفة و/أو المياه.
تحديد العدد من البكتيريا المرفقة قابلة للتطبيق باستخدام التجانس.
1. ضع العينة في قذيفة هاون عقيمة أو خلاط أو أي جهاز آخر التجانس. تغطية ذلك بقياس حجم المياه المعقمة، والمتوسطة الحضانة، أو غسل العازلة²⁷. استخدام وحدة تخزين كافية لتغطية العينة. خلاط استخدام 100 مل.
2. طحن العينة حتى أنه هو تجانس جيدا. فحص درجة الحموضة بعد التجانس ومن المؤكد أن حمض صدر من الأنسجة النباتية لم يتسبب في انخفاض حاد في درجة الحموضة أدناه 7. إذا انخفض الرقم الهيدروجيني باستخدام المخزن مؤقت مثل العازلة الفوسفات في السائل التجانس للحفاظ على درجة الحموضة.
3. تحديد عدد خلايا قابلة للحياة.
علامة استخدام البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية.
1. في الحالات التي يوجد فيها أكثر من نوع واحد من البكتيريا، علامة السلالات البكتيرية استخدام عفوية المقاومة للمضادات الحيوية (عادة والريفامبيسين وحمض الناليديكسيك).
  1. تحديد مستوى المضادات الحيوية استخدامها. في حالة توفر الثقافات للكائنات الحية الأخرى ومن المتوقع أن يكون حاضرا في الاحتضان، لوحة هذه الثقافات التي نمت في ظل ظروف الحضانة المقصود مع النباتات في اللوحات التي تحتوي على مجموعة من تركيزات المختار المضادات الحيوية. تحديد أدنى تركيز تسمح بنمو أي من هذه الكائنات. وهذا هو أدنى تركيز التي سيتعين اختبار البكتيريا تكون مقاومة المضادات الحيوية.
  2. الحصول على طفرات مقاومة للمضادات الحيوية العفوية. تنمو ثقافة من البكتيريا في المتوسط الغنية لسجل المتأخرة أو مرحلة ثابتة. لوحة 0.1 مل مخفف على صفيحة تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة بتركيز مناسب. تحديد التركيزات استخدامها كما هو موضح في الخطوة 7.3.1.1. إبقاء وتنقية البكتيريا التي تنمو وبالتالي فهي مقاومة للمضادات الحيوية.
  3. تحديد أن مقاومة المضادات الحيوية لا تقلل من نمو البكتيريا بالقيام بمنحنى نمو في المتوسط السائل من الأصل وسلالات مقاومة للمضادات الحيوية. تحديد أن البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية تظهر على نفس المستوى من الاستعمار للمواد النباتية أكسينيك كسلالة الأم، إذا كان ذلك ممكناً.
تحديد العدد من البكتيريا قادرة على البقاء منضمة إلى النباتات التي تزرع في الرمال.
1. قم بإزالة المصنع من الحاويات والرمال. لإزالة النباتات من الحاويات، قم أولاً بإزالة مواد الختم في أعلى وأسفل الحاوية. ضع الحاوية على قطعة من الورق عقيمة وإزالة بلطف كامل الرمل أو التربة والنبات اسطوانة مدبب كبير واحد بلطف يطرق الحاوية على سطح لتخفيف المواد.
  1. إذا لزم الأمر، استخدم ملعقة أو قضيب لتخفيف المواد حول حواف يمر الجزء السفلي من الحاوية.
2. عند الاسطوانة من الرمل أو التربة المحتوية على المصنع مجاني على الورق، تقسيم أسفل الوسط للكشف عن جذر النبات. إذا رغبت في ذلك، أخذ عينات الرمل القرب من حافة الحاوية وكذلك قرب الجذر. قد يكون هذا مفيداً لتحديد انتشار (والتراكم والنمو) من البكتيريا.
3. قياس طول الجذر. التقاط الجذر وإزالة الرمال والبكتيريا التمسك فضفاضة الجذر (المواد rhizosphere) غمس الجذر في قياس حجم المياه أو المخزن المؤقت وتهتز لها بلطف. تحديد عدد خلايا قابلة للحياة من البكتيريا في تعليق الناتجة بالطلاء على وسيلة مناسبة مثل أجار لوريا. وهذا يمثل العدد من البكتيريا فضفاضة المرتبطة بالجذر.
إزالة البكتيريا أحكام ملزمة ب sonication وتحديد أعدادهم كما هو موضح في الخطوة 7، 1.
وبدلاً من ذلك، لتحديد مكان الموقع على الجذر من البكتيريا أحكام ملزمة الجذر غسلها على سطح طبق بتري يحتوي على أجار المغذيات أو وسيلة أخرى مناسبة. مراقبة موقع المستعمرات البكتيرية على الجذر على مدى 3 أيام القادمة باستخدام مجهر تشريح أو المكبرة.
التعبير عن النتائج كعدد من البكتيريا في كل محطة، وكل سم² من المساحة السطحية، كل سم طول الجذر، أو لكل غرام الوزن الطازج للأنسجة. Replicates متعددة في نفس اليوم، وكما تفعل replicates في أيام مختلفة باستخدام مختلف الثقافات البكتيرية والكثير مختلفة من المواد النباتية.

8-تحديد ما إذا كان تأثير شروط الحضانة على الالتصاق سبب استجابة للبكتيريا أو المصنع

استخدام المواد النباتية قتلى أو قتل.
1. الموضوع المصنع المادية لمجموعة متنوعة من المواد الكيميائية أو نسيجية أو العلاجات الأخرى مثل الحرارة لأنه قتل. غسل المواد النباتية جيدا في المياه والحضانة المتوسطة بعد استخدام أي من هذه العلاجات. ثم تطعيم البكتيريا. هذا لن تدمر سطح النبات ولكن سوف يجعلها أيضي نشطة حيث أن فإنه لا يمكن الاستجابة للبكتيريا.
2. قياس التصاق البكتيريا كما هو موضح في الخطوات 6 و/أو 7. أيضا تحديد عدد خلايا قابلة للحياة إضافة إلى الاحتضان مع المواد النباتية في البداية في الحضانة وعدد الخلايا قابلة للتطبيق الحالي في نهاية الحضانة التأكد من أن لا من المواد الكيميائية السامة كانوا حاضرين أثناء الاحتضان.
استخدام المواد غير الحية.
1. استخدام البكتيريا التمسك بالمواد غير الحية تحديد ما إذا كان تأثير ينظر في انضمام البكتيرية المواد النباتية يرجع تأثير على النبات أو البكتيريا. اختيار مادة جماد الذي ربط البكتيريا والذي يشبه في الشكل والحجم للمواد النباتية درس. وتشمل الاحتمالات ورقات تصفية جميع أنواع (السليلوز، النيتروسليلوز، والألياف الزجاجية، والبولي، إلخ.) والمواضيع (النايلون، القطن، البوليستر، والصوف الزجاجي، إلخ.)، الزجاج أو البلاستيك كوفيرسليبس، كوبونات الفولاذ المقاوم للصدأ، والغسيل الكلوي الأغشية.
2. غسل المواد الجماد تماما في الماء والمتوسطة التي ستنفذ الحضانة وتعقيم من قبل استخدام. معظم المواد المذكورة في الخطوة 8.2.1 مستقرة للتعقيم بالتعقيم.
3. احتضان المواد غير الحية تحت الشروط المطلوبة ودرجة كما هو موضح في الخطوات 6 و 7. مثال على استخدام خيوط النايلون لتحديد أن يعزى انخفاض ربط A. tumefaciens إلى جذر الشعر بتركيزات عالية من الكالسيوم (على الأقل جزئيا) إلى تأثير الكالسيوم على البكتيريا ويبين الشكل 4²⁸.

النتائج

A. tumefaciens كولونيزيس السطوح الجذرية. من أجل تحديد ما إذا كان إنتاج السليلوز البكتيري يلعب دوراً في استعمار الجذر، كانت آثار الطفرات البكتيرية التي تمنع توليف السليلوز درست¹⁶. وقد استخدمت التقنيات الموضحة في الخطوات من 1-3 و 7.1. وكانت بذور الطماطم السطح تعقيم ونامي في الماء المعقم. عندما كانت الجذور طويلة 2 سم تقريبا كانوا انخفض في تعليق 10⁵ البكتيريا كل مل وزرعت في تربة المبستر في حاويات. النباتات قد نمت لمدة 14 يوما عند 25 درجة مئوية على أساس ضوء/12 ح 12 ح دورة الظلام. بعد أن أشارت مرات النباتات أزيلت من الحاويات. تغسل الجذور وسونيكاتيد في سونيكاتور حمام لإزالة البكتيريا منضم. وحددت الأرقام البكتيرية استخدام عدد خلايا قابلة للحياة. ويبين الشكل 2 تأثير الطفرات السليلوز-ناقص مختلفة اثنين على قدرة البكتيريا على استعمار جذور الطماطم. على الرغم من أن الانحرافات المعيارية لبعض القياسات عالية كما سجل 0.9₁₀ (مشكلة مشتركة مع هذا النوع من القياس) تخفيض ملزمة لطفرات السليلوز-ناقص يتجلى بوضوح ويمكن أن نخلص إلى أن إنتاج البكتيرية الإيدز السليلوز البكتيريا في استعمار جذور الطماطم.

figure-results-1192
الشكل 2 : جذور الاستعمار نوع البرية وطفرات السليلوز-ناقص من توميفاسينس أ. سجل₁₀العدد الكلي للبكتيريا الواحدة طول الجذر سم المستردة من جذور الطماطم تلقيح مع نوع البرية سلالة A. tumefaciens C58 وطفرات السليلوز-ناقص C58:1 و C58:A60. الأرقام المعروضة هي الوسيلة من الحد أدنى من أربع تجارب منفصلة. أشرطة تبين الانحرافات المعيارية للوسائل. تم تلقيح جذور بغمس لهم في تعليق 10⁵ البكتيريا كل مل لمدة دقيقة واحدة. كانت تزرع النباتات في حاويات وتم إزالة البكتيريا فضفاضة ملتصقة بواسطة الغسيل الجذور في غسل العازلة في قنينة زجاج. تم إزالة البكتيريا محكم ملتصقة باستخدام سونيكاتور حمام وتعليق الناتجة مطلي بتحديد خلية قابلة للتطبيق بحساب¹⁶. وقد تم تعديل هذا الرقم من ماتيس ومكمان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تمت دراسة دور والانسيابيه في ربط كولاي والجراثيم الأخرى إلى براعم البرسيم. وقد تم تتبع بعض حالات تفشي مرض الإسهال بسبب O157:H7 كولاي إلى براعم البرسيم الملوثة. وتم قياس الربط البرية من نوع البكتيريا وطفرات غير قادر على جعل والانسيابيه المختلفة باستخدام الأساليب الموضحة في الخطوات 1-1، 5، 1، و 7.2. وكانت براعم البرسيم سطح تعقيم ونامي لمدة يوم واحد في الماء المعقم عند 25 درجة مئوية في الظلام. براعم الأربعة مع المعاطف البذور المرفقة وضعت في الأطباق البلاستيك المعقمة التي تحتوي على 5 مل الماء. وأضيفت البكتيريا يزرع في مرق لوريا إلى تركيز نهائي لحوالي 5 × 10³ كل مل. كانت المحتضنة براعم الملقحين عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 أيام. تغسل مرتين في 5 مل من الماء المعقم في قنينة من انعكاس قوي براعم وتجانس في الغسيل المخزن المؤقت باستخدام الخالطون زجاج تفلون المحركات. علامة التجارب السابقة باستخدام البكتيريا بلازميد يحمل جينات بروتينات فلورية خضراء أظهر لا البكتيريا المدخلة على الرغم من أن البكتيريا السطحية ولوحظت بسهولة. وترد النتائج في الجدول 1. وتم فحص السلالات اثنين من O157:H7 كولاي . في كل سلالات بدأ إنتاج بولي-β-1، 6-الغلوكورونيك acid(PGA) تقديم مساهمة أكبر لربط كولاي المسببة للأمراض لزراعة الأسطح. حمض colonic أيضا دوراً هاما في الربط. بينما كان الانخفاض في ملزمة في طفرات السليلوز-ناقص كبيرة لم يكن كبيرا مثلما للسكريات اثنين آخرين.

آثار الطفرات في الجينات إنتاج Exopolysaccharide على "ملزمة هاء" القولونية O157:H7 براعم وفتح البذور المعاطف
سلالة بكتيرية	الطفرة أو النمط الوراثي (النمط الظاهري ذات الصلة)	قم بتسجيل رقم₁₀ من البكتيريا ملزمة كل برعم أو البذور معطف
سلالة بكتيرية	الطفرة أو النمط الوراثي (النمط الظاهري ذات الصلة)	براعم البرسيم^ب	فتح البذور المعاطف
86-24	لا شيء (نوع البرية)	4.7 ± 0.6	5.6 ± 0.2
8624N	يهجن (السليلوز-ناقص)	2.9 ± 0.7^ج	3.5 ± 0.6^ج
ج 8624	تنازع (حمض colonic-ناقص)	1.8 ± 0.7^ج	2.4 ± 0.5^ج
ف 8624	بجاك (PGA-ناقص)	< 1.0^ج	1.0 ± 1.0^ج
DEC4A	لا شيء (نوع البرية)	5.6 ± 0.2	6.1 ± 0.3
DEC4AN	يهجن (السليلوز-ناقص)	4.8 ± 0.8^د	4.1 ± 0.8^د
DEC4AC	تنازع (حمض colonic-ناقص)	3.9 ± 0.5^ج	4.8 ± 0.8^د
DEC4AP	بجاك (PGA-ناقص)	< 1.0^ج	1.2 ± 0.7^ج
يعني ± انحراف المعياري من ثلاثة مقاييس للعدد (سجل₁₀) البكتيريا ملزمة بعد 3 أيام كحد أدنى.
تم غسلها براعم ب قبل القياس.
ج تختلف اختلافاً كبيرا من نوع البرية: P < 0.01.
د تختلف اختلافاً كبيرا من نوع البرية: P < 0.05.
لقد تم تعديل هذا الجدول من ماتيس، دوراً وميشرا وتوريس¹⁰.

الجدول 1: آثار الطفرات في الجينات إنتاج اكسوبوليساكتشاريدي على ربط كولاي O157:H7 إلى براعم. بغية تحديد دور مختلف والانسيابيه وليبوبوليساكتشاريدي في التوثيق للممرضة سلالات O157:H7 كولاي إلى براعم البرسيم، ربط مجموعة من طفرات براعم وفتح البذور المعاطف تم بحث استخدام أساليب هو موضح في الخطوة 6. وأظهرت النتائج أن بولي-ß-1, 6-ن-أسيتيل-د-يبدو أن الجلوكوزامين (PGA) ضرورية للربط لبراعم وأن حمض السليلوز وكولانيك المطلوبة لربط الحد الأقصى من O157 كولاي . لقد تم تعديل هذا الجدول من ماتيس، دوراً وميشرا وتوريس¹⁰.

من أجل تحديد ما إذا كان إنتاج المنظمة كافية لتسبب ملزمة البكتيرية لزراعة الأسطح، بلازميد (pMM11) تحمل مشغل المستنسخة ترميز الجينات المطلوبة للشبكة أدخل الإنتاج في اثنين من البكتيريا المختلفة التي من شأنها أن لا عادة ما تكون قادرة على ربط جذور الطماطم¹⁰. أ-توميفاسينس A1045 هي متحولة من سلالة نوع البرية C58 التي يفشل لجعل غلوكان دوري بيتا-1 و 2، وأيضا فشل ربط زراعة الأسطح²⁹. سينورهيزوبيوم الرايزوبيوم 1021 التي تشكل العقيدات الجذرية في البرسيم فشل لربط غير البقوليات بما في ذلك الطماطم¹². واستخدمت لتحديد إذا كانت القدرة على جعل المنظمة عموما زيادة ربط البكتيرية على السطوح الجذرية التقنيات الموضحة في الخطوات 1.1 5.1، 6.3 و 7.1. وكانت بذور الطماطم السطح تعقيم ونامي في الماء المعقم. جذور مقطعة شرائح 1 سم في الطول وتوضع في الماء المعقم وتم تلقيح البكتيريا. هذين النوعين من البكتيريا تنمو بمعدلات مختلفة، وتم قياس ملزمة في أوقات مختلفة للسماح بكميات متساوية تقريبا من النمو البكتيري. بسبب وجود pMM11 بلازميد زيادة كبيرة مماثلة في العدد من البكتيريا منضم من كل الأنواع (الجدول 2)¹⁰. كما لوحظ زيادة كبيرة في الربط في المجهر الخفيفة ولكن الربط كان مختلفاً جداً لهذين النوعين (الشكل 3). A. tumefaciens A1045 ملزمة كالبكتيريا الفردية إلى سطح الجذر. الرايزوبيوم س. ملزمة في مجموعات كبيرة فيها إلا عدد قليل من البكتيريا تم إرفاقه مباشرة في الجذر وكانت تعلق غالبية البكتيريا البكتيريا الأخرى. ويبين هذا المثال أن تحليل أرقام البكتيريا ملزمة دون بما في ذلك الملاحظات المجهرية ببساطة يمكن أن تعطي انطباعا مضللاً عن نتائج تجربة. على الرغم من أن كلتا الطريقتين (عدد خلايا قابلة للحياة والملاحظات المجهرية) تبين أن pMM11 زيادة ربط البكتيرية على جذور الطماطم، نوع الربط الناجمة عن إنتاج المنظمة كانت مختلفة بالنسبة لأنواع الجراثيم اثنين¹⁰.

أثر pMM11 بلازميد على "ربط البكتيريا" على "جذور الطماطم"
سلالة بكتيرية	بلازميد	ربط عدد من البكتيريا الواحدة طول الجذر مم
توميفاسينس أ A1045	لا شيء	0.25 × 10 ± 0.25 × 10³³
	pBBR1mcs (المتجهات)	0.25 × 10 ± 0.25 × 10³³
	pMM11 (توليف الشبكة)	10 × 10³± 0.25 × 10³
الرايزوبيوم 1021 س.^ب	لا شيء	أي الكشف عن
	pBBR1mcs (المتجهات)	أي الكشف عن
	pMM11 (توليف الشبكة)	50 × 10³± 5 × 10³
وتم قياس ربط بكتيرية بعد 2 ساعة
ب ربط البكتيرية كان التدبير بعد 18 ساعة
لقد تم تعديل هذا الجدول من ماتيس، دوراً وميشرا وتوريس¹⁰.

الجدول 2: تأثير بلازميد تحمل جينات لتركيب الشبكة على ربط ألف-توميفاسينس A1045 و الرايزوبيوم س. 1021 شرائح جذور الطماطم. من أجل دراسة قدرة بولي-ß-1, 6-ن-أسيتيل-د-جذور الجلوكوزامين (PGA) لتعزيز ربط البكتيريا النبات، تأثير بلازميد يمنح القدرة على جعل المنظمة (pMM11) لربط اثنين من سلالات من البكتيريا المرتبطة بمصنّع ل وتم بحث جذور الطماطم. وأظهرت أي سلالة من البكتيريا ملزمة كبيرة لجذور الطماطم في غياب بلازميد أو حضور بلازميد دون الجينات ترميز تركيب الشبكة (pBBR1mcs). زيادة إضافة بلازميد يحمل جينات توليف المنظمة ملزمة بكلا النوعين من البكتيريا. لأن توميفاسينس أ- ينمو بشكل أسرع مما كان قياس ملزمة الرايزوبيوم س. بعد ح 2 من الحضانة ل A. tumefaciens وبعد ح 18 س. الرايزوبيوم. التقنيات المستخدمة هي التي ورد وصفها في الخطوة 7. لقد تم تعديل هذا الجدول من ماتيس، دوراً وميشرا وتوريس¹⁰.

figure-results-10423
الشكل 3 : تأثير pMM11 بلازميد يحمل جينات تخليق الحيوي المنظمة على الربط A1045 A. tumefaciens و الرايزوبيوم س. 1021 للشعر الجذر الطماطم. A1045 A. tumefaciens ملزمة للشعر الجذر الطماطم من A)، ب) pMM11 A1045 توميفاسينس أ ، ج) الرايزوبيوم س. 1021، ود) pMM11 الرايزوبيوم س. 1021. على الرغم من أن الزيادة في الربط بين نوعين من أنواع البكتيريا مماثلة تقريبا تفاصيل الربط كما رأينا في المجهر الخفيفة مختلفة تماما. التقنيات المستخدمة هي تلك هو موضح في الخطوة 6. لقد تم تعديل هذا الرقم من ماتيس، دوراً وميشرا وتوريس¹⁰. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

من الممكن في بعض الأحيان لاستخدام الملزمة للأسطح غير البيولوجية للمساعدة في التمييز بين مساهمة البكتيريا والنبات في تفاعل معين. Polysaccharide(UPP) القطب الواحد من A. tumefaciens ثبت لتكون قادرة على التوسط ملزمة البكتيرية لمجموعة متنوعة من كل الأسطح البيولوجية وغير البيولوجية³⁰. ولوحظ أن تمنع الربط من توميفاسينس أ لزراعة الأسطح ب كفر²⁸وساطة الكالسيوم. من أجل تحديد ما إذا كان التثبيط من أيونات الكالسيوم الملزمة البكتيرية لزراعة الأسطح بسبب تأثير على البكتيريا أو على سطح المصنع، تم فحص ربط البكتيريا خيوط النايلون. توضح هذه المقالة التقنيات في الخطوة استخدمت 8.2. وكانت بذور الطماطم السطح تعقيم ونامي في المياه كما هو موضح في الخطوة 1. كانت تزرع في متوسط الحد الأدنى مع السكروز البكتيريا وأضيف إلى جذور الطماطم أو خيوط النايلون بتركيز حوالي 10⁵/mL نهائي كما هو موضح في الخطوة 5، 1. تم بحث تأثير إضافة كاكل₂ على ربط البكتيرية على جذور الطماطم وخيوط النايلون في المجهر. ويبين الشكل 4 تثبيط مماثلة لربط باستخدام أما السطحية مما يوحي بأن تأثير الكالسيوم أساسا على البكتيريا¹⁰الكالسيوم.

figure-results-12538
الشكل 4 : تأثير الكالسيوم على ربط A. tumefaciens الطماطم جذر الشعر وخيوط النايلون. A. tumefaciens كان المحتضنة مع جذور الطماطم (A و B) أو خيوط النايلون (C و D) عن 24 ساعة في 01:10 إضعاف أملاح MS و 01:20 تمييع AB المتوسطة الدنيا، السكروز 0.4% (ألف وجيم) أو في 01:10 إضعاف أملاح MS و 01:20 إضعاف متوسط الحد الأدنى AB ، السكروز 0.4% تحتوي على 60 مم كاكل₂(ب ود)³¹. أعاق كاكل وأضاف₂ ملزمة البكتيرية للجذور وخيوط النايلون مما يوحي بأن التثبيط كان يرجع أساسا إلى تأثير على البكتيريا وليس على سطح النبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

من المهم أن يكون على بينه من جميع الأسطح التي يمكن أن تلتزم بها البكتيريا خلال التجربة. وبالتالي قد يمكن التقليل البكتيريا التي قادرة على الربط بالزجاج إذا فعلت عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام أنابيب زجاجية والماصات. إذا كانت تزرع النباتات في أجار أو التربة وبعض من أجار أو يبقى التربة على النباتات قد ربط البكتيريا للمواد المنضمة إليها بدلاً من النباتات. من ناحية أخرى، الغسيل على سطح النبات، لا سيما في حالة الجذور، يمكن إزالة الطلاء السطحية الطبيعية مثل الأغشية المخاطية وهكذا تغير نتائج اختبارات الالتزام.

من المهم أن تكون على يقين من أن البكتيريا المضافة إلى خليط حضانة البقاء على قيد الحياة خلال التجربة. ومن ثم ينبغي بشكل روتيني عدد خلايا قابلة للحياة من البكتيريا الحرة فضلا عن المرفق. بعض العلاجات أو الطفرات البكتيرية قد خفض معدل النمو البكتيرية أو في الواقع سببا لوفاة جزء صغير من سكان الجرثومي. قد لا يمكن تمييزها بالمجهر البكتيريا الحية والميتة ما لم تستخدم البقع الخاصة. وهناك مجموعة من وصمة مفيدة للبكتيريا يعيش الميت الذي يعتمد على استبعاد الأصباغ من البكتيريا الحية. ومع ذلك، إذا كانت موجودة بعدد سكان مختلطة من الأنواع البكتيرية ثم عدد خلايا قابلة للبقاء من الأنواع ذات الأهمية يرجح أن أسهل طريقة لتحديد ما إذا كان الاحتضان أدى إلى وفاة البكتيرية.

التكوين المتوسط ستؤثر على بقاء البكتيرية والنمو. وستوفر الإفرازات الجذرية والمواد من الجرح وقطع مواقع الركيزة لدعم النمو البكتيري متواضعة. الفوسفات والنتروجين والحديد تميل إلى أن الحد في مثل هذه الظروف. وقد تؤثر divalent الكاتيونات مثل الكالسيوم والمغنيسيوم الالتصاق. وفي بعض الحالات يمكن أن تؤثر مصدر الكربون الالتصاق. أيضا المسائل الأس الهيدروجيني. بشكل عام الرقم الهيدروجيني رهيزوسفيري بين 5.5 و 6.5.

من الضروري أن نكون حذرين في استخدام البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية التي تحمل. أن المضادات الحيوية تستخدم في أغلب الأحيان هي الريفامبيسين وحمض الناليديكسيك. المقاومة لهذه المضادات الحيوية عموما بسبب الطفرات في الجينات الصبغية (بوليميريز الحمض النووي الريبي وجيرسي، على التوالي)، وهكذا لا يمكن بسهولة نقلها إلى سلالة أخرى خلال الاحتضان. لا يؤدي هذا النوع من المقاومة أيضا في تدهور أو تعديل للمضادات الحيوية. لا ينصح بوسم البكتيريا مع علامة تنقلها بلازميد جينات إلا بلازميد لا يمكن نقلها إلى أي بكتيريا أخرى. يجب أن لا مقاومة المضادات الحيوية بسبب تعديل التدهور أو الكيميائي للمضادات الحيوية البكتيريا الحساسة المضادات الحيوية ثم ستكون قادرة على النمو على ألواح المضادات الحيوية إذا كانوا على مقربة من البكتيريا المقاومة.

الطرق الموضحة في هذه الورقة مفيدة لأحجام عينة صغيرة و/أو تجارب فيها العينات تحتاج إلى ترد (على سبيل المثال، التجارب التي تنطوي على مسببات الأمراض البشرية). للعينات ذات الأحجام الكبيرة (فوق 100 غرام من المواد أو النباتات أكثر من 50) ستكون طرق أخرى أو تعديل جذري لهذه الأساليب المطلوبة¹⁰^،^،من¹⁹³²^،^،من¹⁹³³^، ³⁴ ^, ³⁵ ^, ³⁶-أن وجود عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة عدا الأنواع التي تجري دراستها يمكن أن تشكل أيضا مشاكل كبيرة. وتشمل الحلول الممكنة استخدام البكتيريا ملحوظ مع البروتين الفلورسنت أو المقاومة للمضادات الحيوية كما هو موضح في الخطوات 6.1.2 و 7-3. عندما تكون البكتيريا التي تهم الأفراد نادرة في عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ومع ذلك، قد لا تكون كافية للسماح بتقييم لا لبس فيها عدد من البكتيريا قيد الدراسة هذه العلامات.

جميع الأساليب الموصوفة هنا هي الطرق المختبرية على أساس. أنه يلزم إجراء تعديلات طفيفة لدراسات الاحتباس الحراري. التعديلات الرئيسية أكثر من المحتمل أن المطلوبة لإجراء دراسات ميدانية حيث البروتوزوا، والحشرات، وتباين اﻻفتراس والمناخ الأخرى الحيوانية تعقيد توفير شروط محددة لهذه التجارب. في المستقبل هذه الأساليب يمكن أن توسع لتشمل التفاعلات بين اثنين أو أكثر من الكائنات الدقيقة على سطح النبات.

Disclosures

يعلن مقدم البلاغ أن لديها لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

صاحب البلاغ وذلك بفضل سوزان ويتفيلد لإعداد الأرقام ومارتن كميل وهيلاري ساماجايو المساعدة مع بعض التجارب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
light microscope	any	N/A	phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.
seeds	any	N/A	make a note of the seed lot number and the cultivar
bleach	any	N/A
bath sonicator	any scientific supply company	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
nutrient agar	Difco	001-01-8
soytone	Difco	24360
Sand	sea sand Fisher Scientific	S25
sand	Sigma-Aldrich	S9887
conetainers	Stuewe & Sons, Inc.	Ray-Leach cone-tainers	many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow
parafilm	any scientific supply company	N/A
MS salts	Sigma-Aldrich	M5524
parrafin	any	N/A
centrigfuge	any scientific company	N/A	to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed
vortex mixer	any scientific company
micrometer	ACCU-SCOPE Accessories	A3145
Sedgwick-rafter counting cell	Hauser Scientific	HS3800
probe-clip press-seal incubatin chamber	Sigma-Aldrich	Z359483
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501
naladixic acid	Sigma-Aldrich	n8878
Live/dead stain	In Vitrogen Molecular Bioprobes	L7007

References

Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).
Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , (2012).
Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , (2012).
Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252 (2014).
Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article