JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف المقال الحالي الجيل وتوصيف الأيضية للفئران تغذية حمية عالية الدهون كنموذج للمقاومة الأنسولين الناجمة عن النظام الغذائي والسمنة. ويضم كذلك بروتوكولات مفصلة لإجراء اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم، واختبار تحمل الأنسولين، رصد التعديلات كامل الجسم من الجلوكوز الأيض في الجسم الحي.

Abstract

السمنة تمثل أهم عامل خطر واحد في الآلية المرضية لداء السكري من النوع 2، أمراض التي تتسم بمقاومة للإقبال على حفز الأنسولين الجلوكوز و ديكومبينسيشن إجمالي من استقلاب الجلوكوز الجهازية. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في فهم استقلاب الجلوكوز، تظل الآليات الجزيئية للائحته في الصحة والمرض تحت التحقيق، بينما هناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لمنع وعلاج مرض السكري. النظام الغذائي المشتقة الجلوكوز يحفز إفراز البنكرياس للأنسولين، والذي بمثابة الجهة الرئيسية العمليات الابتنائية الخلوية أثناء التغذية-الدولة وأرصدة الجلوكوز في الدم وبالتالي المستويات للحفاظ على مركز الطاقة الشاملة. الإتخام المشغلات ميتا-التهاب مزمن، مما يؤدي إلى تغييرات في الأنسولين المحيطية المرتبطة بمستقبلات الإشارات ومما يقلل من الحساسية للتخلص منها بوساطة الأنسولين الجلوكوز. هذه الأحداث في نهاية المطاف إلى جلوكوز الصيام مرتفعة ومستويات الأنسولين، فضلا عن خفض في تحمل الجلوكوز، الذي بدوره بمثابة مؤشرات هامة لمقاومة الأنسولين. نقدم هنا، على بروتوكول لتوليد وتوصيف الأيضية لحمية عالية الدهون (HFD)-تغذية الفئران كنموذج المستخدمة بشكل متكرر من مقاومة الأنسولين الناجمة عن النظام الغذائي. نحن توضح بالتفصيل اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT)، الذي يرصد الطرفية التخلص من الجلوكوز تدار شفويا إفراز الأنسولين وتحميل على مر الزمن. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول لاختبار تحمل الأنسولين (ITT) لمراقبة عمل الأنسولين الجسم بكامله. معا، هذه الأساليب وتطبيقاتها المصب تمثل أدوات قوية لتميز النمط الظاهري الأيضي العام للفئران، وكذلك فيما يتعلق بتقييم التعديلات في الجلوكوز الأيض على وجه التحديد. قد يكون مفيداً بشكل خاص في مجال بحوث واسعة مقاومة الأنسولين ومرض السكري والسمنة توفير فهم أفضل للآلية المرضية، وكذلك فيما يتعلق باختبار آثار التدخلات العلاجية.

Introduction

في العالم المتقدم، السمنة ومرض السكري وصل إلى أبعاد الوباء بسبب الخمول البدني والاستهلاك الزائد من الأغذية المجهزة، الآثار التي تنجم عن سرعة التحضر والتصنيع، فضلا عن العولمة. ورغم أن البحوث على مقاومة الأنسولين وأنها المراضات المشارك، مثل الدهون وتصلب الشرايين، وقد برزت خلال العقود الأخيرة، الآليات البيولوجية المعقدة التي تنظم الأيض في الصحة والمرض ما زالت غير كامل يفهم ولا تزال هناك حاجة ماسة لطرق العلاج الجديدة لمنع وعلاج هذه الأمراض1.

الأنسولين، وأنها التعاقبية هرمون الجلوكاجون بمثابة المنظمين الرئيسيين الطاقة الخلوية الإمداد و macronutrient التوازن، وبالتالي أيضا الحفاظ على تركيزات الجلوكوز الدم المنهجي السليم2. أعمال الجلوكوز نفسه كواحد من أهم محفزات لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا في البنكرياس، بينما المغذيات الكبيرة الأخرى، وعوامل خلطيه فضلا عن المدخلات العصبية كذلك تعديل هذا الرد. ونتيجة لذلك مشغلات الأنسولين العمليات الابتنائية الدولة بنك الاحتياطي الفيدرالي بتيسير نشر جلوكوز الدم الزائد في العضلات والخلايا الدهنية وزيادة تفعيل تحلل فضلا عن البروتين أو الأحماض الدهنية التوليف، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، يمنع الأنسولين الجلوكوز الكبدي الناتج عن طريق تثبيط gluconeogenesis. استهلاك الطاقة الزائدة المزمنة وميتا-التهاب يؤدي إلى hyperinsulinemia ومقاومة الأنسولين المحيطية بسبب الأسفل التنظيم التعبير مستقبلات الأنسولين، فضلا عن التعديلات في المصب مسارات الإشارات، مما يؤدي إلى ضعف حساسية للتخلص من الجلوكوز بوساطة الأنسولين، فضلا عن تثبيط غير كافية من الجلوكوز الكبدي الإنتاج3،4،،من56.

مجموعة واسعة من نماذج حيوانية مع التعريفي الوراثية أو التغذية أو التجريبية للمرض قد أثبتت أن تكون أدوات ممتازة دراسة الآليات الجزيئية لمقاومة الأنسولين، وأشكال مختلفة من مرض السكري، فضلا عن الأمراض المصاحبة لها7 . مثال هو نموذج الماوس المستخدمة على نطاق واسع والراسخة التي يسببها HFD، التي تتسم بزيادة الوزن السريع بسبب زيادة المدخول الغذائي في تركيبة مع انخفاض كفاءة التمثيل الغذائي، أسفر عن الأنسولين المقاومة8، 9-سواء في النماذج الحيوانية والبشر، وارتفاع في الصوم الدم الجلوكوز والإنسولين المستويات، فضلا عن التسامح البصر إلى إدارة الجلوكوز هي المؤشرات المستخدمة بشكل متكرر من مقاومة الأنسولين وغيرها التعديلات النظامية من الجلوكوز الأيض. رصد الجلوكوز والإنسولين مستويات الدم في الدولة القاعدية أو بعد التحفيز بالتالي قراءات الوصول إليها بسهولة.

ويوجز هذا البروتوكول توليد تغذية HFD الفئران، فضلا عن الأساليب المستخدمة بشكل متكرر اثنين، اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار مقاومة الأنسولين (ITT)، ومفيدة لتحديد خصائص النمط الظاهري الأيضية والتحقيق التعديلات في الجلوكوز الأيض. يصف لنا OGTT بالتفصيل، الذي يقيم التخلص من الجلوكوز تدار شفويا إفراز الأنسولين وتحميل على مر الزمن. علاوة على ذلك، نحن توفر إرشادات حول كيفية إجراء أي تي تي للتحقيق في كامل الجسم الأنسولين للعمل عن طريق رصد تركيز جلوكوز الدم استجابة لبولس الأنسولين. البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة هي الراسخة والتي استخدمت في دراسات متعددة10،،من1112. بالإضافة إلى التعديلات الطفيفة التي قد تساعد على زيادة نجاح، ونحن تقديم مبادئ توجيهية لتصميم التجارب، وتحليل البيانات، فضلا عن تلميحات مفيدة لتجنب المزالق المحتملة. البروتوكولات المبينة في هذا التقرير يمكن أن تكون أدوات قوية جداً للتحقيق في تأثير العوامل البيئية الوراثية والدوائية والغذائية وغيرها على استقلاب الجلوكوز في الجسم كله والاضطرابات المرتبطة به مثل مقاومة الأنسولين. بالإضافة إلى تحفيز مع السكر أو الأنسولين، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من مركبات أخرى للتحفيز استناداً إلى غرض البحث الفردي. على الرغم من خارج نطاق هذه المخطوطة، يمكن تنفيذ العديد من التطبيقات الأخرى المصب على عينات الدم مرسومة، مثل تحليل الدم قيم خلاف الجلوكوز والإنسولين (التشكيلات الجانبيةمثلاًوالدهن والبروتين الدهني) فضلا عن مفصل تحليل علامات الأيضية (مثلاً، بكمية الوقت الحقيقي Polymerase سلسلة من ردود الفعل (PCR) وتحليل لطخة غربية، ومقايسة الممتز Enzyme-Linked (ELISA)). زيادة التدفق الخلوي ويمكن تطبيق Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) للتحقيق في الآثار في السكان خلية مفردة متميزة، في حين ترانسكريبتوميك والبروتين، والنهج metabolomic يمكن استخدامها أيضا لتحليل غير المستهدفة.

عموما، نحن نقدم بروتوكول بسيط لتوليد نموذج المستحثة HFD ماوس، بينما تصف كذلك النهجين قوية لدراسة التعديلات كامل الجسم الأيضية، OGTT وشركة ITT، التي يمكن أن تكون أدوات مفيدة لدراسة منشأ المرض و تطوير علاجات جديدة، لا سيما في مجال أمراض مرتبطة بالتمثيل الغذائي مثل مقاومة الأنسولين ومرض السكري.

Protocol

تم وافق عليها العناية بالحيوان واستخدام اللجنة "جامعة فيينا الطبية" جميع الأساليب الموصوفة هنا وأجرى وفقا للاتحاد من الأوروبية مختبر الحيوان العلوم الجمعيات (فيلاسا). يرجى ملاحظة أن جميع الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول ينبغي أن يقوم إلا بعد موافقة المؤسسية والحكومية وكذلك الموظفين الذين يجيدون من الناحية الفنية.

1-HFD-تغذية الفئران

ملاحظة: الحفاظ على جميع C57BL/6J الفئران على دورة الضوء/الظلام 12-ح مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

  1. في 6 أسابيع من العمر، مكان الفئران لمدة 8-12 أسابيع في HFD (40-60% الدهون السعرات الحرارية) للحث على السمنة، بينما تغذية التحكم--مجموعة العجاف اتباع نظام غذائي منخفض الدهون (LFD) (10% الدهون السعرات الحرارية).
  2. تحديد وزن الجسم من الفئران على أساس أسبوعي. منحنيات الوزن ينبغي أن تظهر أنماط مماثلة في كلا الفريقين، مع منحدر أعلى في المجموعة التي تغذيها HFD.

2-OGTT

ملاحظة: إذا كان يتم اختيار النقاط الزمنية أخذ عينات الدم أثناء OGTT كل 15 دقيقة، التجربة ينبغي إجراء بحد أقصى 15 الفئران في موازاة ذلك، كي يكون على الأقل 1 دقيقة معالجة وقت كل الماوس.

  1. الأعمال التحضيرية في اليوم السابق OGTT
    1. نقل الفئران في قفص مع الفراش الطازجة وسريعة لهم بين عشية وضحاها قبل إجراء الاختبار (ح 14)، مع ضمان أن الفئران يستطيعون الوصول إلى مياه الشرب (مثلاً، إزالة المواد الغذائية في 06:00 م وقت بدء في صباح اليوم التالي الساعة 08:00 ص).
      ملاحظة: هو الفئران الصيام بين عشية وضحاها النهج الموحدة، لكن سريعة أقصر (ح 5-6) فسيولوجية أكثر للفئران (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
  2. الأعمال التحضيرية في اليوم للتجربة (ولكن قبل التجربة)
    1. إعداد 10 مل من محلول الجلوكوز 20 ٪ (حل د-(+)-الجلوكوز في الماء المقطر).
      ملاحظة: جميع الكواشف التي تدار على الحيوانات أن يكون الصف الدوائي وعقيمة.
    2. إعداد لوحة 96-جيدا لجمع البلازما، بسد بئر واحدة لكل نقطة في وقت أخذ العينات وكل الماوس، مع 5 ميليلتر نايدتا (م 0.5 يدتا، pH 8.0 في 0.9% كلوريد الصوديوم، مخزن في RT). وخلال التجربة، تخزين هذه اللوحة على الجليد.
      ملاحظة: انظر التكميلية الرقم 1 لقائمة مفصلة.
  3. قياس وزن الجسم من جميع الفئران ومارك ذيولها مع علامة دائمة بغية جعل الفئران يمكن تمييزها بسهولة (مثلاً، داش الماوس 1 = 1، شرطات الماوس 2 = 2، إلخ).
  4. قياس السكر وأخذ عينات من الدم (الشكل 2)
    1. قطع بعناية في 1-2 مم طرف الذيل استخدام مقص حاد ("البديل ألف" في الشكل 2). دائماً تمحو أول قطره دم لتجنب انحلال الدم أو التلوث بسوائل الأنسجة قبل أخذ عينات دم جديد لتحديد الجلوكوز في الدم. رسم عينة دم صغيرة (~ 3 ميليلتر) لقياس مستوى جلوكوز الدم القاعدية (= الوقت النقطة 0) مع السكر.
      تنبيه: فحص وضبط عدد شرائط الاختبار على السكر تهمة.
      ملاحظة: كطريقة أخذ عينات دم بديلة، نك على المنوال الذيل الأفقي بالماوس مع شفرة مشرط حاد ("البديل باء" في الشكل 2). وعلى المنوال الذيل الأفقي عادة الوصول إلى الثلث تقريبا على طول الذيل من طرف الذيل، تتحرك نحو قاعدة الذيل لعينات متعددة. ينصح باستخدام كريم مخدر موضعي. وقف تدفق الدم عن طريق تطبيق ضغط الإصبع على الأنسجة اللينة لمالا يقل عن 30 ثانية قبل أن يتم إرجاع الحيوان إلى قفصة.
    2. جمع عينة دم (حوالي 30 ميليلتر) باستخدام أنبوب شعري طازجة (إبقاء الأفقي الأنبوبة الشعرية). إفراغ الأنبوب الشعرية باستخدام ماصة وضع طرف الماصة في الجزء العلوي من نهاية الأنبوبة الشعرية ودفع الدم التي تم جمعها بعناية في بئر لصفيحة 96-جيدا، مع تجنب فقاعات الهواء. كرر هذا الإجراء لكل الفئران-في وقت واحد.
      ملاحظة: كبديل لجمع الدم عن طريق أنبوب شعري، استخدام ماصة تعديلها على وحدة التخزين الصحيحة (مثلاً، 30 ميليلتر) لجمع الدم، أو جمع قطره من الدم من الذيل في الفيلم البارافين وبيبيت إلى يدتا-الحل. دقة تجنب اتصال فازلين مع شرائط اختبار الدم أو السكر، كما أنها قد تؤثر على القياسات اللاحقة الجلوكوز والإنسولين.
      تنبيه: OGTT مرهقة جداً بالنسبة للفئران: العجاف الفئران يمكن أن يفقد حوالي 15% وزن الجسم أثناء سريع بين عشية وضحاها. بالإضافة إلى ذلك، وأخذ عينات من الدم في نقاط زمنية مختلفة يؤدي إلى فقدان قدر كبير من الدم. لأخذ عينات من الدم أسهل، فمن الممكن تدليك موسيتايل مع فازلين بعناية.
      ملاحظة: قد تحد من المبادئ التوجيهية المؤسسية المبلغ المسموح به للدم التي تم جمعها ضمن فترة زمنية محددة. وينبغي تعديل أحجام العينات وتيميبوينتس عدم تجاوز الحدود القصوى المسموح بها. ينبغي استخدام وزن الجسم من الفئران لحساب الإجمالي الدم الانسحاب المسموح بها.
  5. حساب حجم المطلوب من الجلوكوز الحل استناداً إلى وزن الجسم (ز 1 الجلوكوز/كغ من وزن الجسم؛ وهذا يمكن أن تكون زيادة تصل إلى 3 غرام/كغ) يديره تزقيمية الشفوي لكل الماوس. على سبيل المثال، سيحتاج ماوس مع وزن جسم من 30 جرام 150 ميليلتر من حل الجلوكوز 20 ٪ لإدارة 30 ملغ جلوكوز.
    ملاحظة: لقاعدة جرعة الجلوكوز على وزن الماوس هو الإجراء القياسي. إذا كانت تتوفر بيانات تكوين الهيئة، جرعة السكر OGTT يجب أن يحسب استناداً إلى الهزيل كتلة الجسم (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
  6. إدارة الجلوكوز
    1. إعداد افيريثينجثات المسبق خلال التجربة كاملة مقدما (الموقت، ورقة سجل التجربة، المحاقن مراقب وشرائط، الشعيرات الدموية، الجلوكوز، حل الجلوكوز، لوحة 96-جيدا، مشرط، الحاسبة، التوازن، علامة دائمة، أوراق البدلاء، "الماصة؛" مع معلومات سرية، والقفازات).
    2. لتطبيق الجلوكوز، كبح جماح الماوس باستيعاب اعتقادا راسخا أنه قبل القفا. تطبيق الحزم الكافي للجلد حول الرقبة للحيلولة دون التواء من كبح جماح الماوس وآماله رأسه إلى الوراء بشكل صحيح. تأكد أيضا من أن يستطيع التنفس الماوس بشكل صحيح.
      ملاحظة: بمجرد بدء إدارة الجلوكوز، إدارة الوقت المناسب مهم جداً.
    3. عناية إدارة الحل الجلوكوز (استناداً إلى الخطوة 2، 5) مباشرة إلى المعدة باستخدام إبرة تغذية. حذر مباشرة إبرة التغذية عن طريق الفم نحو المريء. تسمح الماوس لابتلاع الإبرة: الإبرة المصارف كلياً إلى المريء السفلي/المعدة للماوس. ثم حقن الجلوكوز الحل (الشكل 3a).
      1. إذا تم استيفاء أي مقاومة أو إذا كان الحيوان تناضل فورا، سحب الإبرة وموضعه. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت فور تزقيمية الأولى وإدارة الجلوكوز لجميع الفئران الأخرى في فواصل زمنية 1 دقيقة.
        ملاحظة: قد يكون من المفيد تطبيق قطره حل الجلوكوز مباشرة من إبرة التغذية بفم الماوس، مما يؤدي إلى حفز لعق وبلع، وبالتالي تسهيل الإدراج أسهل من إبرة التغذية. لا يتم تطبيق الضغط عند إدخال إبرة التغذية كهذا قد خطيرة تصيب الحيوان.
  7. بعد 15 دقيقة، قياس مستويات الجلوكوز في الدم بالسكر و بالإضافة إلى ذلك أخذ عينات الدم (~ 30 ميليلتر) (كما هو موضح في التفاصيل في الخطوة 2، 4) لكل الماوس بنفس الترتيب كما أنها كانت حقن.
    ملاحظة: إدارة الوقت مهم جداً؛ اتبع قدر الإمكان باستخدام الفواصل الزمنية نفسها أما تزقيمية مدتها. واسمحوا الفئران التحرك بحرية قدر الإمكان، وتقييد الحد الأقصى إلى الحد أدنى أثناء الإجراء بأكمله للحد من الإجهاد، ويجوز تعديله النتائج. الحليب الذيل مع يد واحدة وجمع الدم مع الآخر.
  8. كرر الخطوة 2.7 نقطة زمنية محددة تبعاً للنتائج المتوقعة (مثلاً، في 30، 45، 60، 90، 120 و 150 و 180 دقيقة بعد إدارة الجلوكوز). إذا كانت النقاط الزمنية المحددة التي أطول من 120 دقيقة، ضمان أن الفئران يستطيعون الوصول إلى مياه الشرب. ضمان أن الفئران دائماً إمكانية الوصول إلى مياه الشرب. عند الانتهاء من التجربة، تعود الفئران إلى اقفاصها منزل مزودة بالمواد الغذائية والمياه.
    تنبيه: OGTT مرهقة جداً للفئران. ولذلك الانتظار قبل إجراء الاختبار التالي الأيضية، مثل ITT 1 أسبوع على الأقل.
  9. وبعد التجربة، الطرد المركزي عينات الدم في 2,500 س ز، و 30 دقيقة، 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية (البلازما) إفراغ آبار بليت وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
    1. تسجيل انحلال الدم عينات إذا كانت موجودة (انظر القسم 3).
  10. تحديد عدة مستويات الأنسولين البلازما باستخدام أليسا متاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة لهذه المجموعة.
    ملاحظة: اعتماداً على حالة الصيام وكذلك على التمثيل الغذائي للفئران التحقيق، صعوبات أثناء هذا الفحص قد تحدث: مستويات الأنسولين الصيام بين عشية وضحاها (النقطة الزمنية 0) هي منخفضة جداً، وذلك ما يقرب من حد الكشف. لتجنب هذه المشكلة، ومضاعفة كمية حجم البلازما الموصى بها وتبعاً لذلك النصف نتيجة لفحص إليزا. من ناحية أخرى، إذا كانت الفئران تصل إلى ذروة الأنسولين أثناء OGTT، لا سيما في الفئران التي تتغذى HFD، مستويات الأنسولين قد تجاوز الحد الكشف: تمييع العينة (مثلاً، إذ مع 0.9% كلوريد الصوديوم) وكرر الفحص إليزا. انحلال الدم في عينات البلازما قد يؤدي إلى تدهور الأنسولين، مما أدى إلى انخفاض قيم قراءات. التدهور يعتمد على الوقت ودرجة الحرارة وتركيز الهيموغلوبين في العينة. دائماً الاحتفاظ بعينات هيموليزيد الباردة أو على الجليد للحد من تدهور الأنسولين.

3-شركة ITT

ملاحظة: لديك نفس الاحتياطات ووصف ل OGTT (المناولة من الفئران، والدم، والسكر، واستخدام فازلين) أيضا ليتم تطبيقها عند إجراء أي تي تي. على سبيل المثال، حقن جميع ينبغي أن تنفذ ضمن 15 دقيقة في فواصل زمنية 1 دقيقة إذا يتم اختبارها الفئران 15 في نفس الوقت. لشركة ITT، جمع عينات الدم بالأنابيب الشعرية اللاحقة اختياري.

  1. التحضير قبل التجربة
    1. الفئران على الأقل 2 ح قبل حقن الأنسولين، مع ضمان أن الفئران يستطيعون الوصول إلى مياه الشرب بسرعة (مثلإزالة الغذاء الساعة 08:00 ص، واختبار الفئران ح 2-5 في وقت لاحق).
    2. تمييع 1:1,000 الأنسولين في 0.9% كلوريد الصوديوم (الأوراق المالية: 100 يو/مليلتر الأنسولين؛ والعامل تركيز 0.1 U/mL) وإعداد الجلوكوز 20 ٪ (د-(+)-حل السكر يذوب في الماء المقطر) تدار إذا أصبحت الفئران سكر الدم.
      ملاحظة: يتم شركة ITT عادة بعد سريعة قصيرة لتجنب نقص السكر في الدم الذي قد يحدث في خلاف ذلك بين عشية وضحاها صام الحيوانات. جميع الكواشف التي تدار على الحيوانات أن يكون الصف الدوائي وعقيمة.
  2. قياس وزن الجسم الفئران ووضع علامة الذيل وقطع ذيل تلميح باستخدام مقص حاد وقياس مستويات الجلوكوز في الدم القاعدية كما هو موضح مسبقاً ل OGTT في الخطوة 2، 4.
  3. حقن الأنسولين
    1. لحقن الأنسولين إينترابيريتونيلي (0.75 يو الأنسولين/كغ من وزن الجسم، محسوبة مسبقاً)، كبح جماح الماوس بواسطة الأسلوب القفا.
    2. استخدام طازجة، عقيمة 27 أو 30 قياس الإبرة لكل الحيوانات لتجنب الانزعاج وخطر الإصابة بأي مكان الحقن.
      ملاحظة: تعقيم الجلد يمكن أن تطيل مدة الإدارة الأنسولين، وهكذا يمكن أن تسبب اضطرابات إضافية للحيوان. لذلك، من المستحسن عدم.
    3. إمالة الرأس الماوس لأسفل بزاوية طفيفة لفضح الجانب البطني للحيوان. ضع إبرة معقمة مع المجسم مشطوف الحواف أعلى وزاوية 30 درجة في الربع العلوي الأيمن من البطن للحيوان (الشكل 3b). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت فورا بعد أن يتم حقن الفأرة الأولى.
      ملاحظة: يتولى جرعة منخفضة (0.1 يو/كغ) يمكن أداؤها على وجه التحديد تقييم حساسية الأنسولين الكبدي. أما بالنسبة OGTT، حساب حجم الحقن استناداً إلى وزن الجسم هو الإجراء القياسي، بينما الجرعة مستندة على الجسم النحيل الشامل المفضل إذا توفرت بيانات تكوين الجسم.
  4. قياس مستويات الجلوكوز في الدم عند نقطة زمنية محددة (مثلاً، بعد 15، 30، 45 و 60 و 90 دقيقة).
    ملاحظة: كما قد الأنسولين نصف وقت قصير من ~ 10 دقيقة في الفئران13، الراحل بعد الإدارة الأنسولين (مثلاً، بعد 2 ح) قد لا تعكس الفروق تأثير مباشر لعمل الأنسولين. إدارة الحل الجلوكوز 20 ٪ في حالة ماوس يصبح سكر الدم (الدم مستويات الجلوكوز أقل من 35 ملغ/دل)، وهو في خطر الموت.
  5. بعد المرة الأخيرة تشير، مكان الفئران إلى اقفاصها المنزل أعدت مع الكثير من المواد الغذائية والمياه.

النتائج

ويبين الشكل 1 جدول الزمني تخطيطي ل phenotyping الأيضية للفئران في الوجبات الغذائية. في سن 6 أسابيع تقريبا، ينبغي أن توضع الفئران في HFD، بينما قد جماعة LFD بمثابة السيطرة على المجموعة. الأهم من ذلك، ينبغي تحديد وزن الجسم أسبوعيا لمراقبة ما إذا كان هناك زيادة متوقعة...

Discussion

مع ارتفاع معدل انتشار مرض السكري والأمراض المرتبطة بها في سكان العالم، هناك حاجة قوية للبحث تناول الآلية الجزيئية والوقاية، والعلاج من المرض19. البروتوكول قدم وصف أساليب راسخة لتوليد HFD الفئران، نموذج حيوان قوية تستخدم لأبحاث التمثيل الغذائي، فضلا عن التوصيل OGTT وشركة ITT، الت?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث "صندوق" عمدة مدينة فيينا والوكالة الألمانية عن für لابوراتوريومسميديزين und كيمي كلينش الطبية العلمية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse strain: C57BL/6JThe Jackson Laboratory664LFD/HFD
Accu Chek Performa - GlucometerRoche6870228OGTT/ITT
Accu Chek Performa - StripsRoche6454038OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solutionSigma-AldrichG8769OGTT
Actrapid - InsulinNovo Nordisk417642ITT
Reusable Feeding NeedlesFine Science Tools#18061-22OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringesBraun9161406VOGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)Braun304000ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)  Braun4657705ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexibleBraintree Scientific, Inc.SP0016OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kitCrystam Chem90080OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fatResearch Diets IncD12492mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.Research Diets IncD12450Bmice on LFD
BRAND micro haematocrit capillarySigma-AldrichBR749321OGTT/ITT
Vaseline - cremeRivieraP1768677OGTT/ITT

References

  1. Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
  2. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
  3. Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
  4. Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
  5. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
  6. Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
  7. Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
  8. Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
  9. Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, S215-S219 (2004).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  11. Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
  12. Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
  13. Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
  14. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
  15. McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
  16. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  17. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
  18. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
  19. Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
  20. Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
  21. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  22. Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
  23. Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
  24. Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
  25. Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
  26. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
  27. Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
  28. Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
  29. Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
  30. Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
  31. Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
  32. Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
  33. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  34. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).
  35. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
  36. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
  37. Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
  38. Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
  39. Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 OGTT ITT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved