Étude In Vivo du métabolisme du Glucose à haute teneur en graisses régime chez les souris nourries avec épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et Test de tolérance à l’insuline (ITT)

Résumé

L’article décrit la génération et la caractérisation métabolique de chez les souris nourries à la diète riche en gras comme un modèle de résistance à l’insuline induite par le régime alimentaire et l’obésité. Il dispose également des protocoles détaillés pour effectuer l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale et le test de tolérance de l’insuline, suivi des altérations du corps entier de glucose métabolisme in vivo.

Résumé

L’obésité représente le seul facteur de risque plus important dans la pathogenèse du diabète de type 2, une maladie qui se caractérise par une résistance à l’absorption du glucose stimulée par l’insuline et une décompensation brute du métabolisme du glucose systémique. Malgré des progrès considérables dans la compréhension du métabolisme du glucose, les mécanismes moléculaires de sa réglementation en santé et la maladie demeurent sous visé par l’enquête, alors qu’il existe un besoin urgent de nouvelles approches pour prévenir et traiter le diabète. Alimentation dérivée de glucose stimule la sécrétion pancréatique d’insuline, qui sert à l’organisme de réglementation principal de processus anaboliques cellulaires pendant l’État nourri et soldes ainsi la glycémie niveaux pour maintenir le statut énergétique systémique. Suralimentation déclencheurs meta-inflammation chronique, qui entraîne des modifications en insuline périphérique associés aux récepteurs de signalisation et réduit ainsi la sensibilité à la disposition de la glycémie induite par l’insuline. Ces événements aboutirait à glycémie élevée à jeun et de taux d’insuline, mais aussi une réduction de la tolérance au glucose, qui à son tour servir d’indicateurs importants de résistance à l’insuline. Nous présentons ici un protocole pour la production et la caractérisation métabolique d’alimentation riche en graisses (HFD)-nourri des souris comme un modèle souvent utilisé de résistance à l’insuline induite par l’alimentation. Nous illustrons en détail l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO), qui surveille l’élimination périphérique d’une sécrétion glucose administré par voie orale de charge et de l’insuline au fil du temps. En outre, nous présentons un protocole pour l’épreuve d’hyperglycémie provoquée insuline (ITT) de surveiller l’action de l’insuline de l’organisme entier. Ensemble, ces méthodes et leurs applications en aval, représentent des outils puissants pour caractériser le phénotype métabolique général de souris aussi bien quant à évaluer plus précisément les altérations du métabolisme du glucose. Ils peuvent être particulièrement utiles dans le domaine de la recherche large de résistance à l’insuline, le diabète et l’obésité pour fournir une meilleure compréhension de la pathogenèse, aussi bien quant à tester les effets des interventions thérapeutiques.

Introduction

Dans les pays développés, l’obésité et le diabète atteint des dimensions épidémies due à la sédentarité et la consommation excessive d’aliments transformés, les effets qui résultent de l’urbanisation, industrialisation, mais aussi la mondialisation. Bien que les recherches sur la résistance à l’insuline et ses co-morbidités, tels que les hyperlipidémies et l’athérosclérose, a gagné la proéminence pendant les dernières décennies, les mécanismes biologiques complexes qui régulent le métabolisme de la santé et la maladie restent incomplètement compris et il n’y a toujours un besoin urgent de nouvelles modalités de traitement prévenir et traiter ces maladies¹.

L’insuline et du glucagon d’hormone hyperglycémiante c' est servent les principaux régulateurs cellulaires d’alimentation et macronutriments du bilan d’énergie, donc maintenant bon sang systémique glucose concentration². Glucose lui-même agit comme parmi les principaux stimulateurs de sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas, tandis que les autres macronutriments, facteurs humoraux comme entrée neuronale plus modifier cette réponse. L’insuline déclenche par conséquent des processus anaboliques de jeun en facilitant la diffusion des excès de glycémie dans le muscle et les cellules adipeuses et en outre activant la glycolyse comme protéine - ou synthèse des acides gras, respectivement. En outre, l’insuline supprime la production hépatique de glucose en inhibant la néoglucogenèse. Consommation d’énergie excessive chronique et meta-inflammation mènent à une hyperinsulinémie et insulinorésistance périphérique due à la régulation de l’expression des récepteurs de l’insuline ainsi que les modifications dans les voies de signalisation en aval, ce qui a entraîné une déficience sensibilité à la disposition de la glycémie induite par l’insuline ainsi qu’insuffisante inhibition de la production de glucose hépatique^3,4,5,6.

Une large gamme de modèles animaux avec induction génétique, nutritionnelle ou expérimentale de la maladie s’est avéré pour être d’excellents outils pour étudier les mécanismes moléculaires de la résistance à l’insuline et les diverses formes de diabète ainsi que son accompagnement des maladies⁷ . Un exemple typique est le modèle largement utilisé et bien établie de souris induite par le SIH, qui se caractérise par la prise de poids rapide en raison de l’apport alimentaire accrue en combinaison avec l’efficacité métabolique réduite, ce qui entraîne l’insuline résistance^{8, 9}. tant chez des modèles animaux et les humains, une élévation à jeun niveaux de glucose et d’insuline sanguins, ainsi qu’une intolérance à l’administration de glucose sont fréquemment utilisés indicateurs de résistance à l’insuline et d’autres modifications systémiques du glucose métabolisme. Surveillance insuline et glucose sanguin à l’état basal ou après stimulation est donc facilement accessibles lectures.

Le présent protocole décrit la génération de souris nourries HFD ainsi que deux méthodes fréquemment utilisées, l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et l’essai de résistance d’insuline (ITT), qui sont utiles pour caractériser le phénotype métabolique et d’enquêter sur altérations du métabolisme du glucose. Nous décrivons l’HGPO en détail, ce qui permet d’évaluer la disposition d’une sécrétion glucose administré par voie orale de charge et de l’insuline au fil du temps. En outre, nous fournissent des instructions sur la façon de mener l’invitation à soumissionner pour enquêter sur tout le corps-action de l’insuline en surveillant la concentration de glucose en réponse à un bolus d’insuline. Les protocoles décrits dans cet article sont bien établis et ont été utilisées dans plusieurs études^10,11,12. En plus de légères modifications qui peuvent contribuer à accroître le succès, nous fournissons des lignes directrices pour la conception expérimentale et analyse des données, ainsi que des conseils utiles éviter les pièges potentiels. Les protocoles décrits dans les présentes peuvent être des outils très puissants pour étudier l’influence de facteurs génétiques, pharmacologiques, alimentaires et autres sur le métabolisme du glucose tout le corps et sur ses troubles associés comme la résistance à l’insuline. Outre la stimulation avec le glucose ou l’insuline, une variété d’autres composés peut être utilisée pour la stimulation selon le but d’une recherche individuelle. Bien qu’en dehors de la portée de ce manuscrit, de nombreuses autres applications en aval peuvent être effectuées sur les échantillons de sang dessinés, comme l’analyse des valeurs de sang autres que le glucose et d’insuline (par ex., lipides et lipoprotéines profils) ainsi que détaillées analyse des marqueurs métaboliques (par exemple, en temps réel quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR), analyse par Western blot et enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Outre cytométrie en flux et tri cellulaire activé par Fluorescence (FACS) peut être appliquée afin d’étudier les effets chez les populations de cellules simples distinctes, tandis que la transcriptomique, protéomique et métabolomique approches peuvent également être utilisés pour l’analyse non ciblée.

Dans l’ensemble, nous fournissons un protocole simple pour générer un modèle de souris induite par le SIH, tout en décrivant plus deux approches puissants pour étudier les modifications métaboliques dans tout l’organisme, l’HGPO et l’invitation à soumissionner, qui peut être des outils utiles pour étudier la pathogenèse de la maladie et développement de nouvelles thérapies, notamment dans le domaine des maladies associées au métabolisme tels que la résistance à l’insuline et le diabète.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université médicale de Vienne et animalier et réalisées selon la Fédération des européen Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Veuillez noter que toutes les procédures décrites dans le présent protocole doivent être effectuées uniquement après approbation institutionnelle et gouvernementale, ainsi que par le personnel qui est techniquement compétent.

1. HFD-nourris de souris

Remarque : Maintenir toutes les souris C57BL/6J sur un cycle lumière/obscurité de 12 h avec accès gratuit à la nourriture et l’eau.

1. À l’âge de 6 semaines, placez la souris pendant 8 à 12 semaines sur un HFD (40-60 % graisse calories) pour provoquer l’obésité, tout en alimentant le groupe témoin maigre une diète faible en gras (écoute) (10 % graisse calories).
2. Déterminer le poids du corps des souris sur une base hebdomadaire. Les courbes de poids devraient montrer des tendances similaires dans les deux groupes, avec une pente plus élevée dans le groupe nourri HFD.

2. HGPO

Remarque : Si les points de temps pour le prélèvement sanguin sont choisis au cours de l’HGPO à toutes les 15 min, l’expérience devrait être effectuée avec un maximum de 15 souris en parallèle, afin d’avoir au moins 1 min manutention-temps par souris.

1. Préparation la veille de l’HGPO
   1. Transférer les souris dans une cage avec literie douce et rapide durant la nuit avant l’essai (14 h), tout en s’assurant que les souris aient accès à l’eau potable (par exemple, supprimer les aliments à 18:00 pour une heure de début sur le lendemain matin à 08:00).
      NOTE : Jeûne souris pendant la nuit est l’approche standard, cependant un jeûne plus court (5-6 h) est plus physiologique pour la souris (voir pour plus de détails) .
2. Préparations, le jour de l’expérience (mais avant l’expérience)
   1. Préparer 10 mL d’une solution de glucose 20 % (dissoudre D-(+)-Glucose dans de l’eau distillée).
      Remarque : Tous les réactifs qui sont administrés aux animaux doivent être de classe pharmacologique et stérile.
   2. Préparer une plaque à 96 puits pour la collecte de plasma, en remplissant un puits pour chaque point de prélèvement temps et chaque souris, 5 µl NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 à 0,9 % NaCl, stockage à ta). Pendant l’expérience, stocker cette plaque sur la glace.
      Remarque : Voir supplémentaire Figure 1 pour une liste détaillée.
3. Mesurer le poids des souris et marquer leurs queues avec un marqueur permanent afin de rendre les souris faciles à distinguer (p. ex., souris 1 = 1 dash, tirets souris 2 = 2, etc.).
4. Mesure de la glycémie et des prélèvements sanguins (Figure 2)
   1. Découpez soigneusement 1-2 mm de l’extrémité de la queue à l’aide de ciseaux pointus (« variante A » dans la Figure 2). Toujours essuyer la première goutte de sang pour éviter l’hémolyse ou une contamination par tissu liquide avant de prendre des échantillons de sang neuf pour le dosage du glucose sanguin. Obtenir un échantillon de sang petit (~ 3 µL) pour mesurer le niveau de glucose sanguin basal (= point de temps 0) avec le glucomètre.
      ATTENTION : Vérifier et ajuster le nombre de charge de bandelettes de test sur un glucomètre.
      Remarque : Comme une méthode d’échantillonnage de sang alternative, entailler la veine latérale queue d’une souris avec une lame de scalpel tranchant (« variante B » à la Figure 2). La veine caudale latéral est généralement accessible environ un tiers sur toute la longueur de la queue de l’extrémité de la queue, se déplaçant vers la base de la queue pour des échantillons multiples. L’utilisation d’une crème d’anesthésique local est recommandée. Arrêter la circulation sanguine en appliquant une pression du doigt sur les tissus mous au moins 30 s avant que l’animal est renvoyé à sa cage.
   2. Prélever un échantillon de sang (environ 30 µL) à l’aide d’un tube capillaire frais (Gardez le tube capillaire horizontale). Vider le tube capillaire à l’aide d’une pipette en plaçant l’embout de la pipette en haut de l’extrémité du tube capillaire et soigneusement en poussant le sang recueilli dans un puits de la plaque à 96 puits, tout en évitant les bulles d’air. Répétez cette procédure pour toutes les souris - un à la fois.
      Remarque : Comme une alternative pour la collecte de sang par un tube capillaire, utiliser une pipette réglée sur le volume correct (par exemple, 30 µL) pour recueillir le sang, ou de collecter une goutte de sang de la queue sur le film de paraffine et pipette il dans la solution d’EDTA. Strictement éviter le contact de la gelée de pétrole avec des bandelettes de test sanguin ou glucomètre, puisqu’il peut influencer les mesures ultérieures de glucose et d’insuline.
      ATTENTION : L’HGPO est très stressant pour les souris : souris maigres peuvent perdre environ 15 % de leur poids corporel au cours du jeûne d’une nuit. En outre, les prélèvements sanguins à différents moments conduit à une perte considérable de sang. Pour les prélèvements sanguins plus facile, il est possible de masser soigneusement la mouse-tail de vaseline.
      Remarque : Les directives institutionnelles peuvent limiter le montant admissible du sang prélevé dans un délai déterminé. Les volumes de prélèvement d’échantillons et on doit être redressé pour ne pas dépasser les taux maximaux autorisés. Le poids du corps des souris doit être utilisé pour calculer le total retrait autorisé de sang.
5. Calculer le volume nécessaire de solution de glucose selon le poids corporel (1 g de glucose/kg poids corporel, ce qui peut être augmentée jusqu'à 3 g/kg) qui serait administré par gavage pour chaque souris. Par exemple, une souris avec un poids de 30 g faudrait 150 µL d’une solution de glucose 20 % pour l’administration de 30 mg de glucose.
   Remarque : À la base de la dose de glucose sur le poids de la souris est la procédure standard. S’il existent des données de composition de corps, la dose de glucose pour HGPO devrait être calculé basé sur le maigre de la masse corporelle (voir pour plus de détails) .
6. Administration de glucose
   1. Préparer everythingthat est nécessaire pendant l’expérience entière à l’avance (minuterie, fiche d’expérience, glucose moniteur et bandes, capillaires, seringues, solution de glucose, plaque à 96 puits, bistouri, calculatrice, équilibre, marqueur permanent, papiers de banc, un pipette avec une pointe et gants).
   2. Pour l’application de glucose, restreindre la souris en le saisissant fermement par la peau du cou. Appliquer suffisamment de fermeté à la peau autour du cou pour empêcher la torsion de la retenue de la souris et de bien pencher sa tête en arrière. Également de veiller à ce que la souris peut respirer correctement.
      Remarque : Une fois que l’administration de glucose est démarrée, gestion du temps est très importante.
   3. Soigneusement administrer la solution de glucose (basée sur l’étape 2.5) directement dans l’estomac à l’aide d’une aiguille d’alimentation. Prudemment, diriger l’aiguille alimentation par la bouche vers le œsophage. Laissez la souris à avaler l’aiguille : l’aiguille s’enfonce entièrement dans le bas oesophage/estomac de la souris. Puis injecter la solution de glucose (Figure 3 a).
      1. Si une résistance est remplie ou si l’animal se débat immédiatement, retirer l’aiguille et le repositionner. Démarrer la minuterie immédiatement après le premier gavage et administrer glucose à toutes les autres souris à intervalles de 1 min.
         Remarque : Il peut être utile d’appliquer une goutte de solution de glucose directement à partir de l’alimentation de l’aiguille jusqu'à l’embouchure de la souris, ce qui stimulera les lécher et avaler, facilitant ainsi faciliter l’introduction de l’aiguille d’alimentation. N’appliquez pas de pression lors de l’insertion de l’aiguille alimentation car cela peut blesser gravement l’animal.
7. Après 15 min, mesurer le taux de glucose sanguin avec le glucomètre et en outre prendre des échantillons (~ 30 µL) de sang (comme décrit en détail à l’étape 2.4) de chaque souris dans le même ordre qu’ils ont reçu une injection.
   NOTE : La gestion du temps est très importante ; suivre d’aussi près que possible en utilisant les mêmes intervalles de temps en ce qui concerne le gavage. Laissez les souris déplacer aussi librement que possible et à endiguer les limite au minimum pendant toute la procédure pour réduire le stress, qui peut modifier les résultats. Queue d’une main de lait et de recueillir le sang avec l’autre.
8. Répétez l’étape 2.7 aux moments choisis en fonction des résultats escomptés (par exemple, au 30, 45, 60, 90, 120, 150 et 180 min après l’administration de glucose). Si les points de l’heure sélectionnée sont plus de 120 min, veiller à ce que les souris aient accès à l’eau potable. Veiller à ce que les souris ont toujours accès à l’eau potable. Lorsque vous avez terminé avec l’expérience, retourner les souris à leurs domicile cages équipées de nourriture et d’eau.
   ATTENTION : L’HGPO est très épuisant pour les souris. Donc attendre au moins 1 semaine avant d’effectuer le prochain test métabolique, comme une ITT.
9. Après l’expérience, centrifuger les échantillons de sang à 2 500 x g, 30 min, 4 ° C. Transférer le surnageant (plasma) pour vider les puits de la plaque et la stocker à-20 ° C jusqu'à l’analyse.
   1. Enregistrer une hémolyse des échantillons s’il est présent (voir Section 3).
10. Déterminer le taux d’insuline plasmatique à l’aide d’un ELISA commercial nécessaire (voir la Table des matières) suivant les instructions du fabricant de la trousse.
    Remarque : Selon l’état de jeûne, ainsi que sur le métabolisme des souris étudiées, des difficultés au cours de cet essai peuvent survenir : insuline jeûne pendant la nuit les niveaux (instant 0) sont très bas et donc à proximité de la limite de détection. Pour éviter ce problème, doubler la quantité de volume plasmatique recommandée et par conséquent réduire de moitié le résultat du test ELISA. En revanche, si la souris a atteindre le sommet de l’insuline au cours de l’HGPO, surtout chez les souris nourries HFD, le taux d’insuline peut dépasser la limite de détection : diluer l’échantillon (par exemple, 10 fois avec 0,9 % NaCl) et répétez le test ELISA. Hémolyse dans des échantillons de plasma peut conduire à la dégradation de l’insuline, ce qui entraîne une diminution des valeurs d’affichage. La dégradation dépend de la durée, la température et la concentration d’hémoglobine dans l’échantillon. Gardez toujours les échantillons hémolysés froid ou sur la glace pour réduire la dégradation de l’insuline.

3. ITT

NOTE : Les mêmes précautions pour le HGPO (manipulation de la souris, du sang, glucomètre et utilisation de la gelée de pétrole) devraient également s’appliquer lors de l’exécution de l’ITT. Par exemple, toutes les injections doivent être effectuées dans les 15 min à intervalles de 1 min si 15 souris sont testés en parallèle. Pour l’invitation à soumissionner, la collecte ultérieure des échantillons de sang avec tubes capillaires est facultative.

1. Préparatifs avant l’expérience
   1. Rapide des souris pendant au moins 2 h avant l’injection d’insuline, tout en s’assurant que les souris aient accès à l’eau potable (p. ex., retirez les aliments à 08:00, test souris 2-5 h plus tard).
   2. Diluer l’insuline 1 : 1 000 à 0,9 % NaCl (Stock : 100 U/mL d’insuline ; travail concentration 0,1 U/mL) et de préparer les 20 % de glucose (D-(+)-solution de Glucose dissoute dans l’eau distillée) à administrer si les souris deviennent hypoglycémiques.
      NOTE : L’invitation à soumissionner est généralement effectuée après qu’un jeûne court pour éviter l’hypoglycémie qui peut survenir dans le cas contraire dans toute la nuit à jeun animaux. Tous les réactifs qui sont administrés aux animaux doivent être de classe pharmacologique et stérile.
2. Mesurer le poids corporel des souris, marquer la queue, couper l’extrémité de la queue à l’aide de ciseaux pointus et mesurer la glycémie basale comme décrit plus haut pour l’HGPO à l’étape 2.4.
3. Injection d’insuline
   1. Pour injecter de l’insuline par voie intrapéritonéale (0.75 U d’insuline/kg de poids corporel, calculé au préalable), restreindre la souris par la méthode de la peau du cou.
   2. Utiliser une nouvelle, 27 ou 30 stérile aiguille pour chaque animal afin d’éviter l’inconfort et le risque d’une infection du site d’injection de calibre.
      NOTE : Stérilisation de la peau peut prolonger la durée de l’administration d’insuline et donc peut provoquer des perturbations supplémentaires à l’animal. Par conséquent, il n’est pas recommandé.
   3. Inclinez la tête de la souris vers le bas avec un léger angle d’exposer la face ventrale de l’animal. Placer l’aiguille stérile avec le biseau vers le haut et un angle de 30 ° dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen de l’animal (Figure 3 b). Démarrer la minuterie immédiatement après que la première souris est injectée.
      NOTE : Faible dose ITTs (0,1 U/kg) peut être effectuée afin d’évaluer plus précisément la sensibilité d’insuline hépatique. En ce qui concerne l’HGPO, calculer le volume d’injection selon le poids corporel est la procédure standard, tout en fondant la dose sur maigre masse est préférable si les données de composition de corps sont disponibles.
4. Mesurer la glycémie aux moments choisis (par exemple, après 15, 30, 45, 60 et 90 min).
   Remarque : Comme l’insuline a une courte demi-vie de ~ 10 min dans la souris¹³, différences fin après l’administration d’insuline (par exemple, après 2 h) ne reflètent pas un effet direct de l’action de l’insuline. Administrer une solution de glucose 20 % dans le cas où une souris devient hypoglycémie (glycémie inférieure à 35 mg/dL de sang) et est à risque de mourir.
5. Après que le temps final points, replacez les souris dans leur cage maison préparé avec beaucoup de nourriture et d’eau.

Résultats

La figure 1 illustre un calendrier schématique pour Phénotypage métabolique de la souris sur le régime alimentaire. À un âge d’environ 6 semaines, les souris doivent être placés sur un HFD, alors qu’un groupe d’écoute peut servir le groupe témoin. Ce qui est important, poids corporel doit être déterminé chaque semaine pour observer si il y a une augmentation du poids corporel. Tout type de stress (p. ex., bruit ou le comportement a...

Discussion

Avec la forte prévalence du diabète et des maladies associées à la population mondiale, il y a une exigence forte pour une recherche portant sur le mécanisme moléculaire, prévention et traitement de la maladie,¹⁹. Le protocole présenté décrit des méthodes bien établies pour la génération de souris HFD, un modèle animal robuste utilisé pour les recherches métaboliques, ainsi que la conduction de l’HGPO et ITT, qui sont des outils puissants pour l’évaluation des modifications m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer	Roche	6870228	OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips	Roche	6454038	OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	OGTT
Actrapid - Insulin	Novo Nordisk	417642	ITT
Reusable Feeding Needles	Fine Science Tools	#18061-22	OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes	Braun	9161406V	OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)	Braun	304000	ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)	Braun	4657705	ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible	Braintree Scientific, Inc.	SP0016	OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit	Crystam Chem	90080	OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat	Research Diets Inc	D12492	mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.	Research Diets Inc	D12450B	mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary	Sigma-Aldrich	BR749321	OGTT/ITT
Vaseline - creme	Riviera	P1768677	OGTT/ITT