Исследование в Vivo метаболизма глюкозы в высоким содержанием жиров диеты кормили мышей с использованием тест на переносимость глюкозы в устной (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT)

Резюме

Нынешняя статья описывает поколения и метаболических характеристик как модель диета индуцированного инсулина сопротивления и ожирение высоким содержанием жиров диеты кормили мышей. Далее к услугам подробные протоколы для выполнения тест толерантности устные глюкозы и инсулина тест толерантности, мониторинг всего тела изменения глюкозы метаболизм в естественных условиях.

Аннотация

Ожирение является наиболее важным фактором риска в патогенезе сахарного диабета 2 типа, болезни, которая характеризуется сопротивления инсулина стимулирует глюкозы и валовой декомпенсация метаболизма глюкозы системных. Несмотря на значительный прогресс в понимании метаболизма глюкозы молекулярные механизмы его регулирования в области здравоохранения и болезни остаются под расследование, хотя срочно необходимы новые подходы к профилактике и лечению диабета. Диета, производные глюкозы стимулирует панкреатическую секрецию инсулина, который служит в качестве основной регулятор клеточных анаболических процессов во время кормили- и таким образом балансирует уровень глюкозы в крови уровней для поддержания статуса системного энергии. Хронический overfeeding триггеры мета воспаления, что приводит к изменениям в периферийных инсулина рецептор связанные сигнализации и таким образом уменьшает чувствительность к утилизацию глюкозы, инсулина опосредованной. Эти события в конечном итоге привести к повышенный уровень глюкозы натощак и уровень инсулина, а также снижение толерантности к глюкозе, которые в свою очередь служат важными показателями сопротивления инсулина. Здесь, мы представляем протокол для генерации и метаболических характеристик высоким содержанием жиров диеты (HFD)-кормили мышей как часто используемые модели диета индуцированного инсулина сопротивления. Мы в деталях иллюстрируют устный тест на переносимость глюкозы (ТТГ), который контролирует периферической утилизации перорального глюкозы нагрузки и инсулина секреции с течением времени. Кроме того мы представляем протокол для инсулина терпимости испытания (ITT) для мониторинга действий всего тела инсулина. Вместе эти методы и их нисходящие приложения представляют собой мощные инструменты, чтобы охарактеризовать общие метаболического фенотипа мышей, а также конкретно оценить изменения в метаболизме глюкозы. Они могут быть особенно полезны в области широких исследований сопротивление инсулина, диабета и ожирения для обеспечения лучшего понимания патогенеза, а также чтобы проверить действие терапевтических вмешательств.

Введение

В развитых странах ожирение и диабет достиг эпидемии размеры из-за отсутствия физической активности и избыточного потребления переработанных продуктов питания, последствия, которые вызваны быстрой урбанизации, индустриализации, а также глобализации. Хотя исследования на сопротивление инсулина и сопутствующие заболевания, такие как гиперлипидемии и атеросклероза, приобрела известность в течение последних десятилетий, сложных биологических механизмов, которые регулируют метаболизм в здоровье и болезни остаются неполностью понимать и по-прежнему существует настоятельная необходимость для новых методов лечения для предотвращения и лечения этих заболеваний¹.

Инсулина и его дерегулирующее Гормон глюкагон служат в качестве главных регуляторов клеточной энергии питания и макро баланса, таким образом также поддержание надлежащего системного крови глюкозы концентрации². Глюкоза, сам действует как одним из основных стимуляторов секреции инсулина β-клеток поджелудочной железы, в то время как другие макроэлементы, гуморальных факторов, а также нейронных ввода далее изменить этот ответ. Инсулин следовательно инициирует анаболические процессы ФРС государства путем содействия распространению избыток крови глюкозы в мышечных и жировых клеток и далее активации гликолиза, а также белка - или синтез жирных кислот, соответственно. Кроме того инсулин подавляет вывод глюкозы в печени путем ингибирования глюконеогенеза. Хронический избыток энергии потребления и мета воспаление приводит к гиперинсулинемия и периферийных инсулина сопротивления вниз регуляции экспрессии рецепторов инсулина, а также изменения в течению сигнальных путей, что приводит в нарушение чувствительность к глюкоза, инсулин опосредованной утилизации, а также недостаточно ингибирование печеночных глюкозы производства^3,4,5,6.

Широкий спектр животных моделей с генетической, питания или экспериментальных индукции болезни было доказано быть отличные инструменты для изучения молекулярных механизмов сопротивления инсулина и различных формах диабета, а также его сопутствующих заболеваний⁷ . Ярким примером является широко используемым и хорошо создана HFD-индуцированной мыши модель, которая характеризуется быстрое увеличение веса за счет увеличения рацион в сочетании с сокращением метаболические эффективность, привело инсулина сопротивления^{8, 9}. как в модели животных и людей, высоте голодного уровня в крови глюкозы и инсулина, а также нарушение толерантности глюкозы администрации являются часто используемые показатели сопротивления инсулина и других системных изменений глюкозы метаболизм. Таким образом, мониторинга глюкозы и инсулина в крови на базальную государства или после стимуляции являются легко доступными отсчетов.

Настоящий Протокол излагаются поколения HFD-кормили мышей, а также два часто используемых методов, устный тест на переносимость глюкозы (ТТГ) и инсулин сопротивление испытания (ITT), которые являются полезными для характеризуют метаболического фенотипа и расследования изменения в метаболизме глюкозы. Мы описываем ТТГ в деталях, который оценивает распоряжение перорального глюкозы нагрузки и инсулина секреции с течением времени. Кроме того мы предоставляем инструкции о том, как проводить ITT для расследования всего тела инсулин действия путем мониторинга концентрации глюкозы крови в ответ на болюсного инсулина. Протоколы, описанные в этой статье хорошо известны и были использованы в нескольких исследованиях^10,,1112. Помимо незначительные изменения, которые могут помочь увеличить успех мы предоставляем руководства для экспериментального дизайна и анализа данных, а также полезные советы избежать потенциальных ошибок. Протоколы, описанные здесь, могут быть очень мощные инструменты, чтобы исследовать влияние генетических, фармакологических, пищевых и других экологических факторов на метаболизм глюкозы всего тела и его связанных расстройств, таких как сопротивление инсулина. Помимо стимуляции с глюкозы и инсулина целый ряд других соединений может быть использован для стимуляции в зависимости от назначения отдельных исследований. Хотя за пределами сферы действия этой рукописи, многие другие нисходящие приложения могут выполняться на Рисованные крови, такие как анализ крови значений, отличных от глюкозы и инсулина (например, липидов и липопротеинов профили) а также подробную анализ метаболических маркеров (например, количественные реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), Западный анализ помаркой и твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA)). Далее проточная цитометрия и флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) могут быть применены к исследовать эффекты в популяциях различных одной ячейки, в то время как транскриптомики, протеомических и Метаболомные подходы могут быть использованы для нецелевого анализа.

В целом, мы предоставляем простой протокол для создания модели HFD-индуцированной мыши, описывая далее два мощных подходы к изучению метаболические изменения всего тела, ТТГ и МТС, который может быть полезным инструментом для изучения патогенеза заболевания и Разработка новых методов лечения, особенно в области метаболизма ассоциированных заболеваний, таких как сопротивление инсулина и диабет.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета медицинский университет Вены и проведены согласно Федерации из европейских лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA). Пожалуйста, обратите внимание, что все процедуры, описанные в настоящем протоколе должны выполняться только после утверждения институциональных и государственных, а также сотрудников, которые являются технически опытными.

1. HFD-кормили мышей

Примечание: Сохранить все мышей C57BL/6J на свет/темно цикл 12-h с бесплатным доступом к продовольствию и воде.

1. В возрасте 6 недель, место мышей для 8-12 недель на HFD (40-60% тучных калорий) вызвать ожирение, питаясь худой-группе контроля обезжиренная диета (LFD) (10% тучных калорий).
2. Определите вес тела мышей на еженедельной основе. Вес кривые должны показать похожие шаблоны в обеих группах, с уклоном выше в группе HFD-кормили.

2. ТТГ

Примечание: Если время проб крови выбираются во время ОГТТ каждые 15 мин, эксперимент должны быть выполнены с максимум 15 мышей параллельно, для того чтобы иметь по крайней мере 1 мин-время обработки на мышь.

1. Подготовка на день раньше ТТГ
   1. Перевести мышей в клетке с свежим постельным бельем и быстро их на ночь перед тестированием (14 ч), при одновременном обеспечении мышей имеют доступ к питьевой воде (например, удалите пищу в 6:00 для времени начала на следующее утро в 8:00 утра).
      Примечание: Пост мышей на ночь является стандартный подход, однако короче быстро (5-6 ч) более физиологических для мышей (см. обсуждение для подробной информации).
2. Подготовка в день эксперимента (но до эксперимента)
   1. Подготовка 10 мл 20% раствора глюкозы (растворить D-(+)-глюкозы в дистиллированной воде).
      Примечание: Все реагенты, которые находятся в ведении животных должны быть фармакологического класса и стерильный.
   2. Подготовить 96-луночных тарелку для сбора плазмы, путем заполнения одной скважиной для каждой точки время выборки и каждой мыши, с 5 мкл NaEDTA (0,5 М ЭДТА, pH 8.0 в 0,9% NaCl, хранения на RT). В ходе эксперимента Храните эту пластину на льду.
      Примечание: Смотрите Рисунок 1 дополнительный для подробного контрольного перечня.
3. Мера веса тела всех мышей и пометить их хвосты с постоянным маркером для мыши, легко различимыми (например, мышь 1 = 1 тире тире мыши 2 = 2, и т.д.).
4. Измерение глюкозы и забор крови (рис. 2)
   1. Тщательно Отрежьте кончик хвоста, с помощью острых ножниц («вариант A» на рис. 2) 1-2 мм. Всегда вытирайте первая капля крови, чтобы избежать гемолиз или загрязнения с тканевой жидкости перед новой крови проб для определения глюкозы крови. Нарисуйте небольшой крови (~ 3 мкл) для измерения базальный уровень глюкозы в крови (= время точка 0) с глюкометр.
      ВНИМАНИЕ: Проверьте и отрегулируйте количество тест-полоски на глюкометр заряда.
      Примечание: Как метод выборки альтернативного крови, Ник вен боковой хвост мыши с лезвием острый скальпель («вариант B» на рис. 2). Боковые хвост вен обычно осуществляется примерно одной трети по длине хвост от кончика хвоста, переход к основанию хвоста для нескольких образцов. Рекомендуется использовать крем местной анестезии. Остановить поток крови, применяя давление пальца на мягких тканей для по крайней мере 30 s перед животное возвращается к своей клетке.
   2. Сбор крови (около 30 мкл) с помощью свежих капиллярной трубки (держать горизонтальная капиллярная трубка). Пустой капиллярной трубки с помощью пипетки, поставив наконечник пипетки в верхней части конец капиллярной трубки и тщательно толкая собранной крови в колодец 96-луночных пластины, избегая пузырьков воздуха. Повторите эту процедуру для всех мышей - по одному.
      Примечание: Как альтернативу для сбора крови через капилляр, использовать пипетку, скорректирована в правильный том (например, 30 мкл) для сбора крови, или собирать капли крови от хвоста на фильм парафин и накапайте его в ЭДТА решение. Строго Избегайте контакта вазелин с кровью или глюкометр тест-полоски, как это может повлиять на последующие измерения глюкозы и инсулина.
      Предупреждение: ТТГ очень напряженным для мышей: худой мышей может потерять около 15% от их веса тела в течение ночи быстро. Кроме того забор крови в разное время точках приводит к значительной потере крови. Для проще проб крови, это возможность тщательно массаж mouse-tail с вазелином.
      Примечание: Организационные руководящие принципы может ограничить допустимый объем крови, собранные в течение установленного периода. Чтобы не превышать допустимые максимальные следует скорректировать объемы выборки и timepoints. Вес тела мышей должны использоваться для расчета общего вывода разрешен в крови.
5. Рассчитать необходимый объем раствора глюкозы, основанные на массе тела (1 г глюкозы/кг веса тела, это может быть увеличена до 3 г/кг) в ведении пероральная затравка для каждой мыши. Например мышь с весом тела 30 g потребуется 150 мкл 20% раствора глюкозы для администрирования 30 мг глюкозы.
   Примечание: Чтобы дозы глюкозы на вес мыши является стандартной процедурой. Если доступны данные состава тела, дозы глюкозы ОГТТ должна быть рассчитана на основе мяса массы тела (см. обсуждение для подробной информации).
6. Управление глюкозы
   1. Подготовка everythingthat необходима в течение всего эксперимента заранее (таймер, эксперимент регистрационного листа, глюкозы монитор и полоски, капилляры, шприцы, раствора глюкозы, 96-луночных пластины, скальпель, калькулятор, баланс, Постоянный маркер, скамейке документы, Пипетка с наконечником и перчатки).
   2. Для приложения глюкозы сдерживать мыши, твердо держа шиворот. Нанести на кожу вокруг шеи, чтобы предотвратить скручивания из задержите указатель мыши и должным образом Наклоните голову обратно достаточно твердость. Также убедитесь, что мышь может дышать правильно.
      Примечание: После начала администрация глюкозы, хорошее время Управление является очень важным.
   3. Тщательно управлять раствора глюкозы (основанный на шаг 2,5) непосредственно в желудок с помощью кормления иглы. Осторожно прямой подачи иглы через рот к пищевода. Позволяет мыши, чтобы проглотить иглы: иглы полностью погружается в пищевод/желудка Нижняя мыши. Затем ввести раствор глюкозы (рис. 3a).
      1. Если любое сопротивление или если животное борется немедленно, снять иглу и переместить его. Запустить таймер сразу после первого кормления и администрировать глюкозы для всех других мышей с интервалом 1 мин.
         Примечание: Это может быть полезно применить капли раствора глюкозы непосредственно от кормления иглы в рот мышь, которая будет стимулировать лизать и глотания, способствуя тем самым легче вставки кормления иглы. Не прикладывайте давление при вставке кормления иглы, поскольку это может серьезно ранить животное.
7. После 15 минут измерить уровень глюкозы в крови с глюкометр и дополнительно принять образцы (~ 30 мкл) кровь (как описано в деталях на шаге 2.4) каждой мыши в том же порядке, как они были введены.
   Примечание: Управление временем очень важно; Следуйте по максимально возможной, с использованием тех же интервалов времени для кормления. Пусть мышь двигаться так же свободно, как это возможно и предел ограничения к минимуму во время всей процедуры, уменьшить стресс, который может изменить результаты. Молоко хвост с одной стороны и собирать кровь, с другой.
8. Повторите шаг 2.7 в выбранное время очки в зависимости от ожидаемых результатов (например, на 30, 45, 60, 90, 120, 150 и 180 мин после приема глюкозы). Если точки выбранного времени больше чем 120 мин, убедитесь, что мышей имеют доступ к питьевой воде. Убедитесь, что мышь всегда имеют доступ к питьевой воде. По окончании эксперимента мышей верните их дома клетки оборудованы с продуктов питания и воды.
   Предупреждение: ТТГ очень утомительно для мышей. Поэтому ждать по крайней мере за 1 неделю до выполнения следующего метаболических тестирования, таких как ITT.
9. После эксперимента Центрифугуйте образцы крови на 2500 x g, 30 мин., 4 ° C. Передача супернатант (плазмы) пустые скважин пластины и хранить его при-20 ° C до анализа.
   1. Запись гемолиз образцов, если они присутствуют (см. раздел 3).
10. Определить уровни инсулина плазмы, использование коммерчески доступных ELISA комплекта (см. Таблицу материалов) следуя инструкциям производителя комплекта.
    Примечание: В зависимости от поста государства, а также на метаболизм исследуемых мышей, трудности во время этот assay может произойти: ночь поста инсулин уровнях (время точка 0) очень низкая и поэтому близки к пределу обнаружения. Чтобы избежать этой проблемы, удвоить количество объем рекомендованных плазмы и соответственно сократить вдвое в результате анализа ELISA. С другой стороны, если мышь достичь пика инсулина при ТТГ, особенно в HFD-кормили мышей, уровень инсулина может превышать предел обнаружения: разбавить образца (например, десятикратного с 0,9% NaCl) и повторить анализа ELISA. Гемолиз в образцах плазмы может привести к деградации инсулина, что приводит к уменьшению значения индикации. Деградация, зависит от времени, температуры и концентрации гемоглобина в образце. Всегда держите опаковые образцы холодного или на льду для уменьшения деградации инсулина.

3. ITT

Примечание: Те же меры предосторожности, описанные для ТТГ (обработку мышей, крови, глюкометр и использования вазелин) также должны быть применены при выполнении ITT. Например все инъекции должны осуществляться в течение 15 мин с интервалом 1 мин если 15 мышей тестируются параллельно. Для МТС последующие коллекции образцов крови с капиллярной трубки является необязательным.

1. Подготовка перед эксперимент
   1. Быстрая мышей для по крайней мере за 2 ч до инъекции инсулина, обеспечивая мышей имеют доступ к питьевой воде (например, удаление продуктов питания в 8:00 утра, тест мышей 2-5 h позже).
   2. Разбавить 1:1,000 инсулина в 0,9% NaCl (складе: 100 ед/мл инсулин; рабочие концентрации 0,1 ед/мл) и подготовить 20% глюкозы (D-(+)-раствора глюкозы растворяют в дистиллированной воды) под управлением если мышей стали гипогликемических.
      Примечание: ITT обычно выполняется после того, как короткие быстро, чтобы избегать гипогликемии, которая в противном случае может произойти в одночасье постились животных. Все реагенты, которые находятся в ведении животных должны быть фармакологического класса и стерильный.
2. Мера веса мышей, Марк хвост, вырезать кончик хвоста, с помощью острых ножниц и измерить базальную глюкозы крови, как описано выше для ТТГ в шаге 2.4.
3. Инъекции инсулина
   1. Впрыснуть инсулин внутрибрюшинно (0,75 U инсулин/кг веса тела, рассчитывается заранее), сдерживать мыши методом загривок.
   2. Использовать свежие, стерильные 27 или 30 манометра для каждого животного избежать дискомфорта и риск заражения любого места инъекции.
      Примечание: Стерилизации кожи может продлить продолжительность инсулина администрации и таким образом может вызвать дополнительные помехи для животного. Поэтому не рекомендуется.
   3. Наклоните голову мыши вниз под небольшим углом подвергать вентральной стороне животного. Место стерильной иглой с наклонной вверх и под углом в 30 ° в нижнем правом квадранте живота животного (рис. 3b). Запустите таймер сразу после того, как вводится первая мышь.
      Примечание: Низкие дозы Ситт (0.1 U/кг) могут быть выполнены конкретно оценить чувствительность печеночных инсулина. Что касается ТТГ, расчета объем впрыска, основанные на массе тела является стандартной процедурой, при этом основывая дозы на мышечной массы является предпочтительным, если доступны данные композиции тела.
4. Измерение уровня глюкозы в крови в выбранное время точках (например, после 15, 30, 45, 60 и 90 минут).
   Примечание: Как инсулин короткого перерыва ~ 10 мин в мышей¹³, конце различия после инсулина администрации (например, после 2 h) могут не отражать прямой эффект действия инсулина. Администрирование 20% раствора глюкозы, в случае, если мышь становится гипогликемических (крови глюкозы ниже 35 мг/дл) и находится в опасности смерти.
5. После того, как последний раз указывает, место мышей обратно в свои дома клетки, подготовлены с большим количеством пищи и воды.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует таблица схема времени для метаболического фенотипа мышь на диеты. В возрасте примерно 6 недель мышей должно уделяться HFD, в то время как LFD-группа может служить в качестве контрольной группы. Важно отметить, что вес тела должен опре...

Обсуждение

С высокой распространенности диабета и сопутствующих заболеваний населения в мире существует сильное требование для адресации молекулярный механизм, профилактики и лечения заболеваний¹⁹исследований. Представленные протокол описывает устоявшиеся методы для генерации HF...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer	Roche	6870228	OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips	Roche	6454038	OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	OGTT
Actrapid - Insulin	Novo Nordisk	417642	ITT
Reusable Feeding Needles	Fine Science Tools	#18061-22	OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes	Braun	9161406V	OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)	Braun	304000	ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)	Braun	4657705	ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible	Braintree Scientific, Inc.	SP0016	OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit	Crystam Chem	90080	OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat	Research Diets Inc	D12492	mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.	Research Diets Inc	D12450B	mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary	Sigma-Aldrich	BR749321	OGTT/ITT
Vaseline - creme	Riviera	P1768677	OGTT/ITT