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Method Article
O atual artigo descreve a geração e caracterização metabólica de ratos alimentados com dieta de alto teor de gordura como um modelo de obesidade e resistência à insulina induzida pela dieta. Possui ainda mais protocolos detalhados para executar o teste de tolerância à glicose oral e o teste de tolerância à insulina, monitoramento de alterações de todo o organismo de glicose metabolismo na vivo.
A obesidade representa o mais importante fator de risco único na patogênese do diabetes tipo 2, uma doença que se caracteriza por uma resistência à captação de glicose estimulada por insulina e uma descompensação bruta do metabolismo da glicose sistémica. Apesar dos progressos consideráveis na compreensão do metabolismo da glicose, os mecanismos moleculares da sua regulação na saúde e na doença permanecem sob-investigado, enquanto novas abordagens para prevenir e tratar o diabetes são urgentemente necessárias. Níveis de dieta derivada de glicose estimula a secreção pancreática de insulina, que serve como o principal regulador dos processos anabólicos celulares durante o estado alimentado e, assim, equilibra a glicose no sangue para manter o status de energia sistêmica. Sobrealimentação disparadores meta-inflamação crônica, que leva a alterações na insulina periférica associada do receptor a sinalização e assim reduz a sensibilidade à eliminação de glicose mediada por insulina. Esses eventos, finalmente, resultam na glicemia de jejum elevada e níveis de insulina, bem como uma redução na tolerância à glicose, que por sua vez, servem como importantes indicadores da resistência à insulina. Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e caracterização metabólica de dieta hiperlipídica (HFD)-alimentou ratos como modelo usado com frequência de resistência à insulina induzida pela dieta. Podemos ilustrar em detalhes o teste de tolerância à glicose oral (OGTT), que monitora a disposição periférica de uma secreção de carga e insulina glicose administrada por via oral ao longo do tempo. Além disso, apresentamos um protocolo para o teste de tolerância à insulina (ITT) monitorar a ação da insulina de corpo inteiro. Juntos, esses métodos e suas aplicações a jusante representam ferramentas poderosas para caracterizar o fenótipo metabólico geral de ratos, bem como avaliar especificamente alterações no metabolismo da glicose. Eles podem ser especialmente úteis no campo de pesquisa amplo de resistência à insulina, diabetes e obesidade para fornecer uma melhor compreensão da patogênese, bem como para testar os efeitos de intervenções terapêuticas.
No mundo desenvolvido, obesidade e diabetes atingiu dimensões epidemias devido à inatividade física e o consumo excessivo de alimentos processados, efeitos que são impulsionados pela rápida urbanização, industrialização, bem como a globalização. Embora pesquisas sobre resistência à insulina e é co-morbidades, tais como dislipidemia e aterosclerose, ganhou destaque durante as últimas décadas, os mecanismos biológicos complexos que regulam o metabolismo na saúde e na doença permanecem incompleta Entendido e ainda há uma necessidade urgente de novas modalidades de tratamento prevenir e tratar essas doenças1.
Insulina e é counter-regulatory hormônio glucagon servem como os principais reguladores do balanço de oferta e macronutrientes energia celular, mantendo assim também de concentrações de glicose de sangue sistêmico adequado2. Glicose em si atua como um dos principais estimuladores da secreção de insulina pelas células β do pâncreas, enquanto outros macronutrientes, fatores humorais bem como entrada neural mais modificar essa resposta. Insulina, consequentemente, desencadeia os processos anabólicos do estado federal facilitando a difusão de glicose no sangue em excesso em músculos e células de gordura e mais ativando glicólise, bem como proteínas ou síntese de ácidos graxos, respectivamente. Além disso, insulina suprime a saída de glicose hepática, inibindo a gliconeogênese. Consumo de energia em excesso crônico e meta-inflamação levar a hiperinsulinemia e a resistência de insulin periférica devido a para baixo-regulamento da expressão do receptor de insulina, bem como alterações nas vias de sinalização a jusante, resultando assim em prejudicada sensibilidade à eliminação de glicose mediada por insulina, bem como a insuficiente inibição da produção hepática de glicose3,4,5,de6.
Uma vasta gama de modelos animais com indução experimental, nutricional ou genética da doença tem sido provado para ser excelentes ferramentas para estudar os mecanismos moleculares da resistência à insulina e várias formas de diabetes, bem como seus acompanhamento doenças7 . Um exemplo é o modelo amplamente utilizado e bem estabelecida HFD-induzido do rato, que é caracterizado pelo rápido ganho de peso devido ao aumento da ingestão dietético em combinação com redução da eficiência metabólica, resultando em insulina resistência8, 9. tanto em modelos animais e humanos, uma elevação em jejum níveis sanguíneos glicose e insulina, bem como uma tolerância prejudicada à administração de glicose são utilizados indicadores de resistência à insulina e outras alterações sistêmicas de glicose metabolismo. Monitoramento glicose e insulina os níveis de sangue no estado basal ou após estimulação, portanto, são leituras facilmente acessíveis.
O presente protocolo descreve a geração de HFD-alimentou ratos, bem como dois métodos usados com frequência, o teste de tolerância à glicose oral (OGTT) e teste de resistência a insulina (ITT), que são úteis para caracterizar o fenótipo metabólico e investigar alterações no metabolismo da glicose. Descrevemos o OGTT detalhadamente, que avalia a eliminação de uma secreção de carga e insulina glicose administrada por via oral ao longo do tempo. Além disso, nós fornecemos instruções sobre como conduzir a ITT para investigar a insulina-ação do corpo inteiro ao monitorar a concentração de glicose do sangue em resposta a um bolus de insulina. Os protocolos descritos neste artigo são bem estabelecidos e têm sido usados em vários estudos10,11,12. Além de pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso, nós fornecemos orientações para delineamento experimental e análise de dados, bem como dicas úteis evitar possíveis armadilhas. Os protocolos descritos neste documento podem ser ferramentas muito poderosas para investigar a influência da genéticas, farmacológicas, dietéticas e outros fatores ambientais sobre o metabolismo de glicose de corpo inteiro e em seus distúrbios associados como resistência à insulina. Estimulação com glicose ou insulina, além de uma variedade de outros compostos pode ser utilizada para estimulação dependendo da finalidade da pesquisa individual. Embora fora do escopo deste manuscrito, muitas outras aplicações a jusante podem ser executadas sobre as amostras de sangue desenhada, como a análise dos valores de sangue além de glicose e insulina (por exemplo, lipídios e lipoproteínas perfis) bem como detalhadas análise dos marcadores metabólicos (por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) quantitativa em tempo real, análise ocidental do Borrão e ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA)). Ainda mais a citometria de fluxo e fluorescência ativado celular classificação (FACS) podem ser aplicadas para investigar os efeitos nas populações distintas única célula, enquanto transcriptomic, proteómica e metabolómica abordagens também podem ser utilizadas para análise não segmentado.
No geral, nós fornecemos um protocolo simples para gerar um modelo de rato induzida por HFD, enquanto descrevia ainda mais duas abordagens poderosas para estudar alterações metabólicas de todo o corpo, o OGTT e a ITT, que pode ser ferramentas úteis para estudar a patogênese da doença e desenvolvimento de novas terapias, especialmente no campo do metabolismo associadas a doenças como resistência à insulina e diabetes.
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da universidade médica de Viena e cuidado Animal e realizados de acordo com a Federação de Europeu laboratório Animal ciência associações (FELASA). Por favor, note que todos os procedimentos descritos no presente protocolo só devem ser realizados após a aprovação governamental e institucional, bem como pelo pessoal que são tecnicamente eficientes.
1. HFD-alimentou ratos
Nota: Manter todos os camundongos C57BL/6J em um ciclo de luz/escuro de 12-h com acesso gratuito à comida e água.
2. OGTT
Nota: Se os pontos de tempo de amostragem de sangue são escolhidos durante OGTT a cada 15 min, o experimento deve ser realizado com um máximo de 15 ratos em paralelo, a fim de ter pelo menos 1 min-tempo de manuseio por rato.
3. ITT
Nota: As mesmas precauções descritas para OGTT (manipulação de camundongos, sangue, glicosímetro e uso vaselina) também deve ser aplicada ao realizar a ITT. Por exemplo, todas as injeções devem ser efectuadas 15 min em intervalos de 1 min se 15 ratos são testados em paralelo. Para a ITT, subsequente coleta de amostras de sangue com tubos capilares é opcional.
A Figura 1 ilustra um cronograma esquemático para fenotipagem metabólico de ratos em dietas. Com uma idade de aproximadamente 6 semanas, os ratos devem ser colocados em um HFD, enquanto um LFD-grupo pode servir como grupo controle. Importante, peso corporal deve ser determinado semanalmente para observar se há um esperado aumento no peso corporal. Qualquer tipo de stress (por exemplo, ruído ou comportamento agressivo masculino) pode interferir no...
Com a alta prevalência de diabetes e doenças associadas na população do mundo, há uma forte exigência de pesquisa abordando o mecanismo molecular, prevenção e tratamento da doença de19. O protocolo apresentado descreve métodos bem estabelecidos para a geração de ratos HFD, um robusto modelo animal usado para investigação metabólica, bem como a condução do OGTT e ITT, que são potentes ferramentas para a avaliação de alterações metabólicas de corpo inteiro tais como resistênc...
Os autores não têm nada para divulgar.
Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo médico científico do prefeito da cidade de Viena e o Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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