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要約

現在の記事では、生成および食事療法誘導されたインシュリン抵抗性および肥満のモデルとして高脂肪食飼育マウスの代謝特性について説明します。さらに、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコース代謝体内の全身の変化の監視を実行する詳細なプロトコルを備えています。

要約

肥満は 2 型糖尿病、インスリン刺激によるグルコース吸収と全身糖代謝の総代償不全への抵抗によって特徴付けられる病気の発症に最も重要な危険因子を表します。グルコース代謝の理解にかなりの進歩にもかかわらず健康と病気その制御の分子機構に残る下調査間小説を防止し、糖尿病の治療への取り組みが急務します。派生のグルコース供給状態の間に細胞の同化プロセスの主レギュレータとして機能し、こうして血糖値のバランスをインスリンの膵臓の分泌を刺激するダイエットは、全身のエネルギー状態を維持するレベルします。慢性過食トリガー メタ-炎症、末梢インスリン受容体関連での変更につながるシグナルとインスリンを介したグルコース処理への感受性を削減します。これらのイベント最終的に結果減少と同様、高い絶食のブドウ糖とインスリン レベルの耐糖能のターンではインスリン抵抗性の重要な指標となります。ここでは、生成と高脂肪食 (HFD) の代謝特性のプロトコルを提案-食事療法誘導されたインシュリン抵抗性の頻繁に使用されるモデルとしてマウスを供給します。経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT)、監視時間をかけて経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の周辺機器の処分の詳細に示します。さらに、インスリン負荷試験 (ITT) 全身のインスリン作用を監視するためのプロトコルを提案する.一緒に、これらのメソッドとその下流の応用は、特に糖代謝の変化を評価するだけでなくマウスの一般的な代謝表現型を特徴付けるための強力なツールを表します。彼らはインスリン抵抗性、糖尿病および肥満治療介入の効果をテストとして同様の病態のより良い理解を提供する広範な研究分野で、特に便利。

概要

先進国の肥満や糖尿病は、物理的な不活動と加工食品の過剰な消費の急速な都市化、工業化、グローバル化によって駆動される効果による流行の寸法を達した。ただし、研究インスリン抵抗性およびそれの併存、高脂血症や動脈硬化、最後の十年の間に卓越性を得たが、健康および病気の代謝を調節する複雑な生物学的メカニズムのまま不完全理解、まだ防ぎ1これらの疾患を治療する新しい治療法のための緊急の必要性があります。

インスリン、およびそれの counter-regulatory ホルモンのグルカゴン細胞のエネルギー供給と栄養素のバランス、適切な全身血ブドウ糖濃度2をまた維持の主レギュレータとして役立ちます。インスリン分泌の主要な刺激の 1 つとして膵 β 細胞によるグルコース自体機能他栄養素、液性因子としてそれ以上の神経入力は、この応答を変更します。インスリンは、筋肉や脂肪細胞に余分な血中グルコースの拡散を促進し、解糖系と同様にタンパク質や脂肪酸合成をそれぞれさらに活性その結果供給状態の同化のプロセスをトリガーします。さらに、インスリンは、糖新生を抑制することによって肝糖放出を抑制します。慢性的な過剰なエネルギー消費やメタ炎症は障害の結果、下流のシグナル伝達経路の変化と同様に、インスリン受容体の発現のダウンレギュレーションにより末梢のインスリン抵抗性と高インスリン血につながる肝糖生産3,4,5,6の不十分な抑制と同様、インスリンを介したグルコース処理する感度。

病の遺伝、栄養、または実験的誘導と動物モデルの広い範囲は、その付随の病気7 と同様、糖尿病の様々 な形態およびインスリン抵抗性の分子機構を研究する優れたツールであると証明されています。.典型的な例は広く使われていると定評の HFD 誘発マウス モデルは、代謝効率が低下、インスリン抵抗8,の結果での組み合わせで食事摂取量増加による急速な体重増加によって特徴付けられる9しますよく使用するインスリン抵抗性の指標とグルコースの他の全身の変化は、グルコースの投与に対する障害耐性だけでなく、両方のモデル動物と人間、空腹時血中グルコースとインスリン濃度の上昇。代謝。したがって、基底状態で、または刺激に監視の血中グルコースとインスリン濃度、簡単にアクセス可能な読み出しです。

この議定書の概要 HFD 給電マウスとして経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン抵抗性試験 (ITT)、代謝の表現型を特徴付けるそして調査するために役立つ 2 つの頻繁に使用されるメソッドの生成糖代謝の変化。詳細は、時間の経過とともに経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の処分を評価で OGTT をについて説明します。さらに、インスリンのボーラスへの応答の血中グルコース濃度を監視することによって全身のインスリン作用を調査する ITT を実施する方法の指示を提供します。この資料で説明されているプロトコルは定評あり複数研究10、11,12で使用されています。成功を高めるを助けるかもしれないわずかな変更、に加えて、我々 は実験デザインとデータ解析と同様有用なヒント潜在的な落とし穴を避けるのためのガイドラインを提供します。ここ記載されているプロトコルは、全身糖代謝とインスリン抵抗性などの関連疾患、遺伝的、薬理学的、食物、および他の環境要因の影響を調査するための非常に強力なツールをすることができます。グルコースとインスリン刺激、他は、個々 の研究の目的によって刺激のためさまざまな他の化合物を使用すること。この原稿のスコープの範囲外が他の多くのダウン ストリーム アプリケーションの詳細なだけでなく、グルコースとインスリン (例えば、脂質およびリポタンパク質プロファイル) 以外の血液の値の分析など、描かれた血液サンプルで実行できます。代謝マーカー (例えば、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、西部のしみの分析、および酵素結合抗体法 (ELISA) による) の分析。さらにフローサイトメトリー、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームのアプローチについても、不特定多数に向けた分析のため利用されるかもしれない一方単一細胞集団の効果を調査する並べ替え蛍光活性化セル (FACS) を適用可能性があります。

全体的に、我々 は全身代謝の変化、分泌、ITT は、病気の発症を勉強するための便利なツールをすることができますを検討する 2 つの強力なアプローチをさらに説明しながら HFD 誘発マウス モデルを生成するための単純なプロトコルを提供し、インスリン抵抗性・糖尿病など代謝疾患の分野を中心に、新しい治療法を開発します。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは動物愛護とウィーンの医学大学の利用委員会によって承認され実施によると、連合の欧州研究所動物科学連合 (FELASA)。制度や政府の承認の後だけでなく、技術的に精通しているスタッフによってのみこのプロトコルで説明したすべての手順は実行されることに注意してください。

1. HFD 給電マウス

注: は、食料と水を無料で 12 h 光/暗いサイクルですべての c57bl/6 j マウスを保持します。

  1. 6 週齢、場所でマウス、肥満を誘発する、HFD (40-60% 脂肪カロリー) の 8-12 週の低脂肪ダイエット (LFD) リーン コントロール グループを供給しながら (10% 脂肪カロリー)。
  2. 週単位でマウスの体重を決定します。ウェイト カーブ HFD 供給グループの高い斜面で、両方のグループで同じようなパターンが表示されます。

2。 OGTT

注: 15 分毎、OGTT 中血液サンプリング タイム ポイントが選択されている場合実験対象となる最大並行して、15 匹のマウスのマウスあたり少なくとも 1 分処理時間を持つために。

  1. OGTT の前日準備
    1. マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら新鮮な寝具と高速 (14 h) をテストする前に夜間にケージにマウスを転送 (例えば、18:00 次の朝 8:00 に開始時刻のために食べ物を削除) します。
      メモ: 断食マウス一晩は標準的なアプローチが短く高速 (5 〜 6 時間) がより生理的マウス (詳細については説明を参照)。
  2. 準備日に実験 (ただし実験開始前)
    1. 20% ブドウ糖液 10 mL を準備 (溶解 d-(+)-グルコース蒸留水で)。
      注: 動物に投与されるすべての試薬は、薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。
    2. 5 μ L で各サンプリング時点の各マウス 1 つの井戸を埋めることでプラズマ コレクションの 96 ウェル プレートを準備 NaEDTA (0.5 M EDTA、pH 8.0 で 0.9% 食塩水、常温保管)。実験では、氷にこのプレートを保存します。
      注: は、補足図 1詳細なチェックリストを参照してください。
  3. すべてのマウスの体重を測定し、マウスは簡単に区別できる (例えばマウス 1 = 1 ダッシュ、マウス 2 = 2 ダッシュのなど) を作るために永久的なマーカーと彼らの尾をマークします。
  4. グルコース測定と採血 (図 2)
    1. 慎重に鋭いはさみ("バリアント"図 2の A) を使用して尻尾の先端の 1-2 mm を切った。常に溶血または血糖値測定のための新しい血液サンプルを取る前に組織液の混入を避けるために血の最初の滴を拭き取ってください。基底血糖値 (= 0 の時点)、glucometer との測定のため、少量の血液サンプル (〜 3 μ L) を描画します。
      注意: を確認し、glucometer のテスト ストリップの充満数を調整します。
      注: 代替血液サンプリング方法として鋭いメスの刃 (図 2には"バリアント B") でマウスの外側尾静脈をニックします。外側尾静脈に多数のサンプル、尾の根元に向かって尻尾先端から尾の長さに沿って約 3 分の 1 は、通常します。局所麻酔クリームの使用をお勧めします。少なくとも 30 の軟部組織に指の圧力を適用することによって血流を停止 s 動物は檻に戻される前に。
    2. 新鮮な毛細管 (キャピラリー チューブの水平維持) を使用して血液サンプル (約 30 μ L) を収集します。ピペットを用いたキャピラリー チューブの端の上部にピペット チップを入れて、慎重に空気の泡を回避しながら 96 ウェル プレートのウェルに集められた血を押すキャピラリー チューブを空にします。すべてのマウスの 1 つずつのこの手順を繰り返します。
      注: キャピラリー チューブを介して血のコレクションのための代替血液を収集し、収集のドロップする (例えば、30 μ L) 適切なボリューム調整ピペットを使用して血液パラフィン フィルムとピペットで尻尾からは EDTA 溶液に。厳密にその後グルコースとインスリンの測定に影響を与える可能性があります血または glucometer テスト ストリップとゼリーに石油の接触を避けます。
      注意: OGTT は非常にマウスのストレス: 無駄のないマウスを失うことが前後の体重の 15% 夜行高速で。さらに、別の時点で採血は血液のかなりの損失につながります。簡単に採血、ワセリンと mouse-tail を慎重にマッサージすることが可能です。
      注: 制度のガイドラインは、一定期間内に集められた血の許容量を制限があります。サンプリング ボリュームと縦長に許可されている最大値を超えないように調整してください。マウスの体重の合計を計算に使用する血液の撤退を許可します。
  5. 体重 (体重 1 g グルコース/kg; 3 g/kg まで増加するこのことができます) に基づくブドウ糖輸液の必要量を計算にすべてのマウスの経口投与による投与されます。たとえば、30 g の体重を持つマウスは、30 mg のグルコースを管理する 20% ブドウ糖溶液を 150 μ l 添加を必要があります。
    注: マウスの重量を基にグルコースの投与量を標準的な手順です。OGTT を計算する必要がありますのブドウ糖の投与量が、リーンに基づく体組成データが利用可能な場合本体質量 (詳細については説明を参照)。
  6. グルコースの投与
    1. 準備に関するすべてのことは、前もって全体の実験中に必要な (タイマー、実験記録シート、グルコース モニターとストリップ、毛細血管、注射器、グルコース溶液、96 ウェル プレート、メス、電卓、バランス、永久的なマーカー、ベンチのペーパー、ピペット チップ、そして手袋をして)。
    2. グルコース アプリケーションのしっかりと首筋を把握することによりマウスを抑制します。マウスの抑制からのねじれを防ぐために正しく戻って頭を傾けると首の周りの皮膚に十分な硬さを適用されます。また、マウスが正しく呼吸できることを確認します。
      注: グルコースの投与を開始すると、良い時間管理は非常に重要です。
    3. 慎重に餌針を使用して胃の中に直接 (2.5 のステップに基づいて) グルコース溶液を管理します。慎重に直接食道に向かって口から給餌針。針を飲み込むには、マウスを許可する: マウスの下の食道/胃に完全、針のシンクします。その後、グルコース溶液 (図 3 a) を挿入します。
      1. どんな抵抗が満たされる動物はすぐに戦う場合や、針を撤回し、それを移動します。最初の強制経口投与後すぐにタイマーを開始および他のすべてのマウスに 1 分間隔でブドウ糖を管理します。
        注: それが舐めていると嚥下、餌針の簡単挿入容易に刺激するマウスの口に餌針から直接ブドウ糖溶液の一滴を適用するあります。これは真剣に動物を傷つける可能性があります、餌針を挿入する場合は、圧力は適用されません。
  7. 15 分後、glucometer と血糖値を測定し、また採血 (〜 30 μ L) (ステップ 2.4 で説明されている詳細) として各マウスの同じ順序で彼らを注入したよう。
    注: 時間管理は非常に重要です。強制経口投与と同じ時間間隔を使用して可能な限り、従ってください。結果を変更可能性があります、ストレスを軽減することと、全体の手順中に制限を最小限に抑制自由に移動マウスをしましょう。片方の手で尻尾を牛乳し、他の血液を収集します。
  8. (例えば30、45、60、90、120、150、およびグルコースの投与後 180 分で) 期待される結果によって選択した時点で 2.7 手順を繰り返します。選択した時間ポイントが 120 分を超える場合、マウスに飲料水へのアクセスがあることを確認します。マウス常に飲料水へのアクセスがあることを確認します。実験を完了したら、マウスを食料と水装備ホーム檻に返します。
    注意: OGTT はマウスに非常に疲れるです。したがって、ITT など次の代謝テストを実行する前に、少なくとも 1 週を待ちます。
  9. 2,500 × g、30 分、4 ° C での血液サンプルを遠心実験の後分析まで、-20 ° C でプレートの井戸を空にして保管して上清 (プラズマ) を転送します。
    1. 存在する場合は、サンプルの溶血を記録 (セクション 3 を参照してください)。
  10. 市販 elisa 法を用いた血漿インスリン キット (材料の表を参照) を決定するキットの製造元の指示に従います。
    注: 空腹の状態に応じてだけでなく、調査のマウスの代謝には、この試金の時に困難が発生する: 夜間空腹時インスリン レベル (時点 0) が非常に低く、したがって検出限界の近くにあります。この問題を回避するには、推奨される血漿量の量を倍増し、ELISA アッセイの結果をそれに応じて半減します。一方でマウス HFD 与えられたマウスで特に OGTT、中にインスリンのピークに達すると場合、インスリン レベルは検出限界を超える可能性があります: サンプルを希釈 (例えば、10 倍 0.9 %nacl)、ELISA アッセイを繰り返します。血漿検体の溶血は、読み取り値の減少、インスリンの低下につながる可能性があります。劣化は、時間、温度、およびサンプルのヘモグロビン濃度に依存します。寒さやインスリンの低下を減らすために氷の上に、溶血サンプルを常に保ちます。

3. ITT

注: OGTT (ワセリン使い glucometer、血マウスの取扱い) について同じ注意は ITT の実行時に適用するまたあります。たとえば、すべての注射行なう 15 分以内で 1 分間隔で並列で 15 匹のマウスをテストする場合。ITT、毛細管での採血の後に収集はオプションです。

  1. 実験前に、の準備
    1. マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら、インスリン注射の前に少なくとも 2 時間マウスを高速 (例えば、8:00 で食品を削除、マウスをテスト 2 5 h 後)。
    2. 0.9% でインスリン縮尺を希薄 NaCl (株式: 100 U/mL インスリン; 作業濃度 0.1 U/mL) 20% ブドウ糖を準備 (d-(+)-グルコース溶液に溶解した蒸留水) マウスが低血糖になった場合に投与します。
      注: 一晩で発生する可能性がありますそれ以外の場合、低血糖を避けるために短い高速動物を絶食後、ITT は、通常実行されます。動物に投与されるすべての試薬が薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。
  2. マウスの体重を測定、尾をマーク、鋭いはさみを使用して尻尾先端をカットし、ステップ 2.4 で OGTT は前述のように基底の血ブドウ糖のレベルを測定します。
  3. インスリン注射
    1. 腹腔内にインスリンを注入する (0.75 U インスリン/kg 体重、事前計算)、首筋法によるマウスを抑制します。
    2. 滅菌の 27 か 30 ゲージの針の不快感と、注射部位の感染のリスクを避けるために各動物のため、新鮮なを使用します。
      注: 皮膚の殺菌インスリン投与の期間を延ばすことができる、動物に付加的な妨害を起こすことができます。したがって、それはお勧めしません。
    3. 動物の腹側を公開するわずかな角度でマウスの頭を傾けてください。動物の腹部 (図 3 b) の右下の象限に滅菌針と 30 ° の角度で傾斜面を配置します。最初のマウスは、注入後すぐに、タイマーを開始します。
      注: 低用量 ITTs (0.1 U/kg) が具体的には肝のインスリン感受性を評価するために行われます。投与量を基づかせている間標準的な手順は、体重に基づいて注入量の計算、OGTT は体組成データが利用可能な場合は無駄のない体の質量が最寄り。
  4. 選択した時点で (例えば15、30、45、60、90 分後) に血糖値を測定します。
    注: インスリン マウス13〜 10 分の短い半時間があり、(例えば2 h 後) インスリン投与後半違い表さない場合がありますインスリン作用の直接影響。マウスは低血糖になる場合に 20% ブドウ糖溶液を管理 (血糖値 35 mg/dL 以下) と死亡のリスクは、します。
  5. 最終的な時間のポイントの後、食料と水をたっぷり用意してホーム ケージに戻ってマウスを配置します。

結果

図 1は、食事療法のマウスの代謝フェノタイピングのスケマティック タイム テーブルを示しています。約 6 週間の年齢で LFD グループは対照群として役立つかもしれない間、HFD のマウスを配置する必要があります。重要なは、体重は、体重増加が予想されるかを観察する毎週決定する必要があります。ストレス (例えば、ノイズまたは積?...

ディスカッション

糖尿病および世界の人口に関連する疾患の有病率高がある分子メカニズム、予防、および19疾患の治療に対処研究強い要件。提案するプロトコルは、世代 HFD マウスの全身代謝変化の評価のための強力なツールは、OGTT と ITT、伝導と同様に代謝の研究に使用される堅牢な動物モデルの確立した方法をについて説明しますなどインスリン抵抗性。本稿で示される方法は、薬理学...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、ウィーン市、Österreichische 協会 für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie の市長の医療科学基金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse strain: C57BL/6JThe Jackson Laboratory664LFD/HFD
Accu Chek Performa - GlucometerRoche6870228OGTT/ITT
Accu Chek Performa - StripsRoche6454038OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solutionSigma-AldrichG8769OGTT
Actrapid - InsulinNovo Nordisk417642ITT
Reusable Feeding NeedlesFine Science Tools#18061-22OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringesBraun9161406VOGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)Braun304000ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)  Braun4657705ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexibleBraintree Scientific, Inc.SP0016OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kitCrystam Chem90080OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fatResearch Diets IncD12492mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.Research Diets IncD12450Bmice on LFD
BRAND micro haematocrit capillarySigma-AldrichBR749321OGTT/ITT
Vaseline - cremeRivieraP1768677OGTT/ITT

参考文献

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131 OGTT ITT

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