Studio In Vivo del metabolismo del glucosio nei topi di dieta-federazione di grassi utilizzando Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT)

Riepilogo

L'articolo attuale descrive la generazione e la caratterizzazione metabolica di topi di dieta-federazione di grassi come modello di resistenza all'insulina indotta da dieta e obesità. È dotato di ulteriori protocolli dettagliati per eseguire il test di tolleranza al glucosio orale e la prova di tolleranza dell'insulina, monitoraggio corpo intero alterazioni del metabolismo del glucosio in vivo.

Abstract

L'obesità rappresenta il singolo fattore di rischio più importante nella patogenesi del diabete di tipo 2, una malattia che è caratterizzata da una resistenza all'assorbimento insulina-stimolato del glucosio e un grave scompenso del metabolismo del glucosio sistemico. Nonostante i notevoli progressi nella comprensione del metabolismo del glucosio, i meccanismi molecolari della relativa regolazione nella salute e nella malattia rimangono sotto-studiato, mentre nuovi approcci per prevenire e curare il diabete sono urgentemente necessari. Dieta derivato glucosio stimola la secrezione pancreatica di insulina, che serve come il principale regolatore dei processi anabolici cellulari durante lo stato alimentato e così saldi di glucosio nel sangue livelli per mantenere lo stato energetico sistemico. Sovralimentazione trigger meta-infiammazione cronica, che conduce alle alterazioni in insulina periferica associata al recettore di segnalazione e così riduce la sensibilità all'insulina-mediato del glucosio. Questi avvenimenti in definitiva frutto in glucosio a digiuno elevato e livelli di insulina come pure una riduzione nella tolleranza al glucosio, che a sua volta servire come importanti indicatori di insulino-resistenza. Qui, presentiamo un protocollo per la generazione e la caratterizzazione metabolica di dieta ad alta percentuale di grassi (HFD)-topi alimentati come un modello di uso frequente dell'insulinoresistenza indotta da dieta. Vi illustriamo in dettaglio il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT), che controlla lo smaltimento periferico di una secrezione di insulina e carico di glucosio somministrato per via orale nel corso del tempo. Inoltre, vi presentiamo un protocollo per la prova di tolleranza dell'insulina (ITT) monitorare l'azione dell'insulina del corpo intero. Insieme, questi metodi e le loro applicazioni a valle rappresentano potenti strumenti per caratterizzare il fenotipo metabolico generale dei topi come pure per quanto riguarda in particolare valutare le alterazioni nel metabolismo del glucosio. Possono essere particolarmente utili nel campo della ricerca ampia di insulino-resistenza, diabete e obesità per fornire una migliore comprensione della patogenesi anche per testare gli effetti degli interventi terapeutici.

Introduzione

Nel mondo sviluppato, l'obesità e il diabete ha raggiunto dimensioni epidemiche a causa di inattività fisica e il consumo eccessivo di alimenti trasformati, effetti che sono guidati da rapida urbanizzazione, industrializzazione, nonché la globalizzazione. Anche se ricerca su insulino-resistenza e di comorbilità, come iperlipidemia e aterosclerosi, ha guadagnato la protuberanza durante gli ultimi decenni, i complessi meccanismi biologici che regolano il metabolismo nella salute e nella malattia rimangono in modo incompleto capito e c'è ancora un urgente bisogno di nuove modalità di trattamento prevenire e curare queste malattie¹.

Insulina e glucagone ormoni contro-regolatori di servire come i principali regolatori dell'equilibrio di alimentazione e dei macronutrienti energia cellulare, mantenendo così anche sangue sistemica adeguata glucosio concentrazioni². Il glucosio stesso agisce come uno degli principali stimolatori della secrezione dell'insulina da β-cellule pancreatiche, mentre altri macronutrienti, fattori umorali come input neurali ulteriormente modificare questa risposta. Insulina di conseguenza innesca i processi anabolici di stato alimentato facilitando la diffusione di glucosio nel sangue in eccesso nelle cellule muscolari e adipose e ulteriormente attivando la glicolisi come pure proteina - o sintesi degli acidi grassi, rispettivamente. Inoltre, l'insulina sopprime la produzione di glucosio epatico inibendo la gluconeogenesi. Consumo di energia in eccesso cronica e meta-infiammazione portano a iperinsulinemia e insulino-resistenza periferico dovuto il giù-regolamento dell'espressione del recettore dell'insulina, nonché alterazioni in vie di segnalazione a valle, così con conseguente alterata sensibilità a disposizione insulina-mediato del glucosio come pure insufficiente inibizione della produzione epatica di glucosio^3,4,5,6.

Una vasta gamma di modelli animali con induzione genetici, nutrizionali o sperimentale della malattia hanno dimostrato di essere ottimi strumenti per studiare i meccanismi molecolari dell'insulino-resistenza e varie forme di diabete come pure le relative malattie accompagnamento⁷ . Un primo esempio è il modello ampiamente usato e ben consolidata del mouse HFD-indotta, che è caratterizzato da aumento di peso a causa di ingestione dietetica aumentata in combinazione con efficienza metabolica ridotta, con conseguente insulino resistenza^{8, 9}. sia in modelli animali ed in esseri umani, un'elevazione nel digiuno del glucosio e dell'insulina nel sangue, così come un'alterata tolleranza alla somministrazione di glucosio sono frequentemente utilizzati indicatori di insulino-resistenza e altre alterazioni sistemiche di glucosio metabolismo. Monitoraggio del glucosio e dell'insulina nel sangue allo stato basale o dopo stimolazione sono pertanto facilmente accessibile letture.

Il presente protocollo descrive la generazione di topi HFD-federazione così come i due metodi utilizzati di frequente, il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e la prova di resistenza di insulina (ITT), che sono utili per caratterizzare il fenotipo metabolico e per studiare alterazioni nel metabolismo del glucosio. Descriviamo il OGTT in dettaglio, che valuta la disposizione di una secrezione di insulina e carico di glucosio somministrato per via orale nel corso del tempo. Inoltre, forniamo le istruzioni su come condurre la ITT per studiare il corpo intero dell'insulina-azione di monitoraggio concentrazione del glucosio nel sangue in risposta ad un bolo di insulina. I protocolli descritti in questo articolo sono ben stabiliti e sono stati utilizzati in molteplici studi^10,11,12. Oltre a lievi modifiche che possono contribuire ad per aumentare il successo, forniamo le linee guida per il disegno sperimentale e analisi dei dati, nonché utili suggerimenti evitare potenziali insidie. I protocolli descritti nel presente documento possono essere strumenti molto potenti per studiare l'influenza della genetici, farmacologici, dietetici e altri fattori ambientali sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo e il suoi disturbi associati come l'insulino-resistenza. Oltre alla stimolazione con glucosio o insulina, una varietà di altri composti può essere utilizzata per la stimolazione a seconda dello scopo della ricerca individuale. Anche se fuori dell'ambito di questo manoscritto, molte altre applicazioni a valle possono essere eseguite su campioni di sangue prelevato, come l'analisi dei valori di sangue diverso da quello del glucosio e dell'insulina (ad es., lipidico e lipoproteico profili) così come dettagliate analisi di marcatori metabolici (ad es., da tempo reale quantitativa Polymerase Chain Reaction (PCR), l'analisi Western blot ed Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Ulteriormente il flusso cytometry e fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) può essere applicato per studiare gli effetti in popolazioni distinte delle cellule singole, mentre trascrittomica, proteomica e metabolomica approcci possono anche essere utilizzati per l'analisi non mirati.

In generale, forniamo un semplice protocollo per generare un modello di topo HFD-indotta, mentre ulteriormente descrive due approcci potenti per studiare alterazioni metaboliche del corpo intero, il OGTT e ITT, che possono essere strumenti utili per lo studio della patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie, soprattutto nel campo della malattie metabolismo-associate come l'insulino-resistenza e diabete.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso dell'Università medica di Vienna e cura degli animali e condotti secondo la Federazione di europeo laboratorio animale scienza associazioni (FELASA). Siete pregati di notare che tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite solo dopo approvazione istituzionale e governativa, così come dal personale che sono tecnicamente abile.

1. HFD-federazione topi

Nota: Mantenere tutti i topi C57BL/6J su un ciclo di luce/buio di 12 h con accesso gratuito per cibo e acqua.

1. A 6 settimane dell'età, luogo topi per 8-12 settimane su un HFD (40-60% di calorie grasse) per indurre l'obesità, mentre il gruppo di controllo magro di alimentazione una dieta a basso contenuto di grassi (LFD) (10% calorie grasse).
2. Determinare il peso corporeo dei topi su una base settimanale. Le curve di peso dovrebbero mostrare modelli simili in entrambi i gruppi, con una pendenza superiore nel gruppo HFD-federazione.

2. OGTT

Nota: Se punti tempo campionamento di sangue sono stati scelti durante il OGTT ogni 15 min, l'esperimento deve eseguito con un massimo di 15 topi in parallelo, al fine di avere almeno 1 min movimentazione-tempo per topo.

1. Preparati il giorno prima OGTT
   1. Trasferire i topi in una gabbia con biancheria fresca e veloce durante la notte prima del test (14 h), garantendo nel contempo che i topi hanno accesso all'acqua potabile (per esempio, rimuovere il cibo alle 18:00 per un tempo di avvio sulla mattina successiva alle 8:00).
      Nota: Topi digiuno durante la notte è l'approccio standard, tuttavia un veloce più breve (5-6 h) è più fisiologico per topi (Vedi discussione per dettagli).
2. Preparati il giorno dell'esperimento (ma prima dell'esperimento)
   1. Preparare 10 mL di soluzione glucosata al 20% (sciogliere D-(+)-glucosio in acqua distillata).
      Nota: Tutti i reagenti che vengono somministrati agli animali devono essere grado farmacologico e sterile.
   2. Preparare una piastra a 96 pozzetti per la raccolta di plasma, riempiendo un pozzetto per ogni punto del tempo di campionamento e ogni topo, con 5 µ l NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 in 0,9% NaCl, deposito presso RT). Durante l'esperimento, è necessario memorizzare questa piastra sul ghiaccio.
      Nota: Vedere complementare Figura 1 per un elenco dettagliato.
3. Misurare il peso corporeo di tutti i topi e le loro code con un pennarello indelebile al fine di rendere i topi facilmente distinguibili (ad esempio, mouse 1 = 1 dash, trattini del mouse 2 = 2, ecc.).
4. Misurazione della glicemia e il prelievo di sangue (Figura 2)
   1. Accuratamente tagliato fuori 1-2 mm della punta della coda utilizzando delle forbici affilate ("variante A" nella Figura 2). Sempre asciugare la prima goccia di sangue per evitare emolisi o contaminazione con tessuto fluido prima del prelievo di campioni di sangue nuovo per la determinazione del glucosio nel sangue. Disegnare un campione di sangue piccolo (~ 3 µ l) per misurare il livello di glucosio del sangue basale (= punto di tempo 0) con il glucometro.
      Attenzione: Controllare e regolare il numero di carica delle strisce su un glucometro.
      Nota: Come un metodo di campionamento del sangue alternativi, nick vena caudale laterale di un mouse con un bisturi affilato ("variante B" nella Figura 2). Vena caudale laterale avviene solitamente circa un terzo lungo la lunghezza della coda dalla punta della coda, lo spostamento verso la base della coda per campioni multipli. È consigliato l'uso di una crema anestetica locale. Interrompere il flusso di sangue applicando pressione con le dita sui tessuti molli per almeno 30 s prima che l'animale venga restituito alla sua gabbia.
   2. Raccogliere un campione di sangue (circa 30 µ l) utilizzando un tubo capillare fresco (mantenere il tubo capillare in posizione orizzontale). Svuotare il tubo capillare, utilizzando una pipetta mettendo la punta della pipetta nella parte superiore dell'estremità del tubo capillare e attentamente spingendo il sangue raccolto in un pozzetto della piastra 96 pozzetti, evitando bolle d'aria. Ripetere questa procedura per tutti i topi - uno alla volta.
      Nota: Come un'alternativa per la raccolta del sangue tramite un tubo capillare, utilizzare una pipetta regolata al volume corretto (ad esempio, 30 µ l) per raccogliere il sangue, o raccogliere una goccia di sangue dalla coda sul film di paraffina e dispensare e nella soluzione di EDTA. Rigorosamente evitare il contatto della gelatina di petrolio con sangue o glucometer strisce reattive, come può influenzare le misurazioni successive di glucosio e di insulina.
      Attenzione: L'OGTT è molto stressante per topi: topi magri possono perde circa il 15% del loro peso corporeo durante il digiuno notturno. Inoltre, il prelievo di sangue a intervalli di tempo differenti conduce ad una notevole perdita di sangue. Per il prelievo di sangue più facile, è possibile massaggiare accuratamente la vista con vaselina.
      Nota: Le linee guida istituzionali possono limitare la quantità ammissibile di campioni di sangue prelevati entro un periodo prefissato. I volumi di campionamento e punti temporali devono essere regolata per non superare i valori massimi consentiti. Il peso corporeo dei topi deve essere utilizzato per calcolare il totale ritiro consentito di sangue.
5. Calcolare il volume richiesto di soluzione di glucosio basata sul peso corporeo (1 g glucosio/kg peso corporeo; questo può essere aumentato fino a 3 g/kg) deve essere somministrato mediante sonda gastrica orale per ogni mouse. Ad esempio, un mouse con un peso corporeo di 30 g avrebbe bisogno di 150 µ l di una soluzione di glucosio di 20% per l'amministrazione di 30 mg di glucosio.
   Nota: Per la dose di glucosio in base al peso del mouse è la procedura standard. Se sono disponibili dati di composizione del corpo, la dose di glucosio OGTT dovrebbe essere calcolato sulla base la magra massa corporea (Vedi discussione per dettagli).
6. Somministrazione di glucosio
   1. Preparare tutto quelloche è necessaria durante l'intero esperimento in anticipo (timer, esperimento di foglio di registrazione, glucosio monitor e strisce, capillari, siringhe, soluzione di glucosio, piastra a 96 pozzetti, bisturi, calcolatrice, equilibrio, pennarello indelebile, carte del banco, un pipetta con una punta e guanti).
   2. Per applicazione di glucosio, trattenga il mouse afferrando saldamente per la collottola. Applicare abbastanza fermezza alla pelle intorno al collo per impedire la torsione fuori la trattenga il mouse e correttamente inclinare la testa all'indietro. Assicurarsi inoltre che il mouse può respirare correttamente.
      Nota: Una volta avviato Gestione del glucosio, buona gestione di tempo è molto importante.
   3. Accuratamente di somministrare la soluzione di glucosio (basata su passo 2.5) direttamente nello stomaco con un ago d'alimentazione. Diretto con cautela l'ago d'alimentazione attraverso la bocca verso l'esofago. Consentire il mouse di ingoiare l'ago: l'ago interamente sprofonda nell'esofago/stomaco inferiore del mouse. Quindi iniettare la soluzione di glucosio (Figura 3a).
      1. Se si riscontra qualsiasi resistenza o se l'animale lotta immediatamente, ritirare l'ago e riposizionarlo. Avviare il timer immediatamente dopo la prima sonda gastrica e somministrare glucosio a tutti gli altri topi in intervalli di 1 min.
         Nota: Potrebbe essere utile applicare una goccia di soluzione di glucosio direttamente dall'ago d'alimentazione fino alla foce del mouse, che stimolerà leccare e inghiottire, facilitando così facilitare l'inserimento dell'ago d'alimentazione. Non applicare pressione quando si inserisce l'ago d'alimentazione come questo può ferire seriamente l'animale.
7. Dopo 15 min, misurare i livelli di glucosio nel sangue con il glucometro e inoltre prelevare campioni di sangue (~ 30 µ l) (come descritto in dettaglio nel passaggio 2.4) di ogni mouse nello stesso ordine come sono stati iniettati.
   Nota: La gestione del tempo è molto importante; seguire quanto più possibile utilizzando gli stessi intervalli di tempo per quanto riguarda l'alimentazione mediante sonda gastrica. Lasciate che i topi muoversi liberamente come possibile e limite restrittivo al minimo durante l'intera procedura per ridurre lo stress, che può modificare i risultati. Coda con una mano di latte e raccogliere il sangue con l'altro.
8. Ripetere il passaggio 2.7 a intervalli di tempo selezionati in base ai risultati attesi (ad es., a 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 min dopo somministrazione di glucosio). Se i punti di tempo selezionato sono più lunghi di 120 min, accertarsi che i topi hanno accesso all'acqua potabile. Assicurarsi che i topi abbiano sempre accesso all'acqua potabile. Al termine dell'esperimento, tornare i topi alla loro casa gabbie con cibo e acqua potabile.
   Attenzione: L'OGTT è molto faticoso per i topi. Quindi aspettare almeno 1 settimana prima di eseguire il prossimo test metabolici, quali un ITT.
9. Dopo l'esperimento, centrifugare i campioni di sangue a 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Trasferire il surnatante (plasma) per vuotare i pozzetti della piastra e conservarla a-20 ° C fino all'analisi.
   1. Registrare l'emolisi dei campioni se presente (Vedi sezione 3).
10. Determinare i livelli di insulina del plasma usando una ELISA disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore del kit.
    Nota: A seconda dello stato di digiuno, così come sul metabolismo dei topi studiati, possono verificarsi difficoltà durante questo test: livelli di insulina di digiuno durante la notte (punto di tempo 0) sono molto basso e quindi vicino al limite di rilevazione. Per evitare questo problema, raddoppiare la quantità di volume plasmatico raccomandato e di conseguenza dimezzare il risultato del test ELISA. D'altra parte, se topi raggiungono il picco di insulina durante OGTT, soprattutto nei topi HFD-federazione, i livelli di insulina possono superare il limite di rilevabilità: diluire il campione (ad esempio, 10 volte con 0,9% NaCl) e ripetere il test ELISA. Emolisi in campioni di plasma possono causare la degradazione dell'insulina, con conseguente diminuzione dei valori di lettura. La degradazione dipende dal tempo, la temperatura e la concentrazione di emoglobina nel campione. Tenere sempre i campioni emolizzati freddo o il ghiaccio per ridurre la degradazione dell'insulina.

3. ITT

Nota: Le stesse cautele previste per OGTT (trattamento dei topi, sangue, glucometer e l'uso di gelatina di petrolio) hanno anche da applicare quando si esegue l'ITT. Ad esempio, tutte le iniezioni devono essere effettuate entro 15 min in intervalli di 1 min se 15 topi sono testati in parallelo. Per le ITT, successiva raccolta di campioni di sangue con tubi capillari è facoltativo.

1. Preparativi prima dell'esperimento
   1. Veloce di topi per almeno 2 h prima dell'iniezione di insulina, garantendo nel contempo che i topi hanno accesso all'acqua potabile (per esempio, rimuovere il cibo alle 8:00, topi di prova 2-5 ore più tardi).
   2. Diluire l'insulina 1:1,000 nello 0,9% NaCl (Stock: insulina di 100 U/mL; lavoro concentrazione 0,1 U/mL) e preparare il 20% di glucosio (D-(+)-soluzione di glucosio disciolto in acqua distillata) devono essere somministrati se i topi diventano ipoglicemici.
      Nota: La ITT viene in genere eseguita dopo una breve veloce per evitare l'ipoglicemia che può altrimenti verificarsi in una notte a digiuno gli animali. Tutti i reagenti che vengono somministrati agli animali devono essere grado farmacologico e sterile.
2. Misurare il peso corporeo dei topi, contrassegnare la coda, tagliare la punta della coda utilizzando delle forbici affilate e misurare i livelli della glicemia basale come descritto in precedenza per l'OGTT al punto 2.4.
3. Iniezione dell'insulina
   1. Per iniettare insulina per via intraperitoneale (0.75 U insulina/kg di peso corporeo, calcolata in anticipo), trattenere il mouse dal metodo collottola.
   2. Utilizzare un fresco, sterile 27 o 30 gauge dell'ago per ogni animale evitare il disagio e il rischio di eventuali infezioni del sito di iniezione.
      Nota: Sterilizzazione della pelle può prolungare la durata della somministrazione di insulina e quindi può causare ulteriori disturbi all'animale. Di conseguenza, non è consigliabile.
   3. Inclinare la testa del mouse verso il basso con una leggera angolazione per esporre il lato ventrale dell'animale. Inserire l'ago sterile con lo smusso e a un angolo di 30 ° nel quadrante inferiore destro dell'addome dell'animale (Figura 3b). Avviare il timer immediatamente dopo il primo mouse viene iniettato.
      Nota: Basso-dose ITTs (0,1 U/kg) può essere eseguita per valutare specificamente la sensibilità dell'insulina epatica. Per quanto riguarda l'OGTT, calcolo del volume di iniezione basato sul peso corporeo è la procedura standard, pur basando la dose sulla magra massa è comodo se sono disponibili dati di composizione del corpo.
4. Misurare i livelli di glucosio nel sangue (ad es., dopo 15, 30, 45, 60 e 90 min) a intervalli di tempo selezionati.
   Nota: Come l'insulina ha un breve intervallo di ~ 10 min in topi¹³, tarda differenze dopo la somministrazione di insulina (per esempio, dopo 2 h) non possono riflettere un effetto diretto dell'azione dell'insulina. Somministrare la soluzione di glucosio 20% nel caso in cui un mouse diventa ipoglicemico (livelli di glucosio inferiore a 35 mg/dL di sangue) ed è a rischio di morire.
5. Dopo il tempo finale punti, rimettere i topi nella loro casa gabbie preparate con abbondanza di cibo e acqua.

Risultati

La figura 1 illustra una tabella schematica tempo per fenotipizzazione metabolica dei topi sulle diete. Ad un'età di circa 6 settimane, topi dovrebbero essere posizionati su un HFD, mentre un gruppo di LFD può servire come gruppo di controllo. D'importanza, peso corporeo deve essere determinato settimanale per osservare se c'è un aumento previsto del peso corporeo. Qualsiasi tipo di stress (ad esempio, rumore o comportamento aggressivo maschile) p...

Discussione

Con l'alta prevalenza di diabete e le malattie associate nella popolazione del mondo, c'è una forte esigenza di ricerca affrontando il meccanismo molecolare, prevenzione e trattamento della malattia¹⁹. Il protocollo presentato descrive metodi consolidati per la generazione di topi HFD, un robusto modello animale utilizzato per ricerca metabolica, come pure la conduzione del OGTT e ITT, che sono potenti strumenti per la valutazione delle alterazioni metaboliche del corpo intero come insulino-resis...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer	Roche	6870228	OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips	Roche	6454038	OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	OGTT
Actrapid - Insulin	Novo Nordisk	417642	ITT
Reusable Feeding Needles	Fine Science Tools	#18061-22	OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes	Braun	9161406V	OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)	Braun	304000	ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)	Braun	4657705	ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible	Braintree Scientific, Inc.	SP0016	OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit	Crystam Chem	90080	OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat	Research Diets Inc	D12492	mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.	Research Diets Inc	D12450B	mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary	Sigma-Aldrich	BR749321	OGTT/ITT
Vaseline - creme	Riviera	P1768677	OGTT/ITT