Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)

Resumen

El actual artículo describe la generación y caracterización metabólica de ratones alimentados con dieta alta en grasas como un modelo de resistencia a la insulina inducida por la dieta y la obesidad. Además cuenta con protocolos detallados para realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa y la prueba de tolerancia a insulina, monitoreo de todo el cuerpo alteraciones del metabolismo de la glucosa en vivo.

Resumen

La obesidad representa el más importante factor de riesgo en la patogenia de la diabetes tipo 2, una enfermedad que se caracteriza por una resistencia a la captación de glucosa estimulada por insulina y una descompensación grave del metabolismo de la glucosa sistémica. A pesar de progresos considerables en la comprensión del metabolismo de la glucosa, los mecanismos moleculares de la regulación en salud y la enfermedad siguen bajo investigación, mientras que se necesitan urgentemente nuevos enfoques para prevenir y tratar la diabetes. Dieta derivada de la glucosa estimula la secreción pancreática de insulina, que sirve como el principal regulador de los procesos anabólicos celulares durante el estado de alimentación y así equilibra la glucosa en la sangre los niveles para mantener la condición de energía sistémica. Sobrealimentación disparadores meta-inflamación crónica, que conduce a alteraciones en la insulina periférica asociado a receptor de señalización y por lo tanto reduce la sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina. Estos eventos resultan en elevados de glucosa en ayunas y los niveles de insulina así como una reducción en la tolerancia a la glucosa, que a su vez sirven como indicadores importantes de resistencia a la insulina. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y caracterización metabólica de la dieta alta en grasas (HFD)-alimentó ratones como modelo frecuente de resistencia a la insulina inducida por la dieta. Ilustramos detalladamente la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT), que supervisa la disposición periférica de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, presentamos un protocolo para la prueba de tolerancia a insulina (ITT) supervisar la acción de la insulina de todo el cuerpo. Estos métodos y sus aplicaciones posteriores constituyen herramientas poderosas para caracterizar el fenotipo metabólico general de ratones, así como para evaluar específicamente alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Pueden ser especialmente útiles en el campo de investigación amplio de resistencia a la insulina, diabetes y obesidad para proporcionar una mejor comprensión de la patogenia, así como para probar los efectos de las intervenciones terapéuticas.

Introducción

En los países desarrollados, la obesidad y la diabetes alcanzaron dimensiones epidémicas debido a la inactividad física y el consumo excesivo de alimentos procesados, efectos que son conducidos por la rápida urbanización, industrialización y globalización. Aunque investigación en resistencia a la insulina y sus comorbilidades, tales como hiperlipidemia y aterosclerosis, ha ganado importancia en las últimas décadas, los complejos mecanismos biológicos que regulan el metabolismo en la salud y la enfermedad siguen siendo incompleto entendido y todavía hay una necesidad urgente de nuevas modalidades de tratamiento prevenir y tratar estas enfermedades¹.

Insulina y sus hormonas contador-reguladoras glucagón sirven como los principales reguladores del equilibrio oferta y macronutrientes energía celular, manteniendo así también sangre sistémica adecuada glucosa concentraciones². Glucosa sí mismo actúa como uno de los principales estimuladores de la secreción de insulina por células β pancreáticas, mientras que otros macronutrientes, factores humorales como entrada neural más modificar esta respuesta. Insulina, en consecuencia, desencadena los procesos anabólicos del estado fed facilitando la difusión de glucosa en la sangre de exceso en la músculo y células gordas y además activando la glucólisis así como proteínas o síntesis de ácidos grasos, respectivamente. Además, insulina suprime la salida de glucosa hepática inhibiendo la gluconeogénesis. Consumo de energía de exceso crónico y meta-inflamación conducen a hiperinsulinemia y resistencia a la insulina periférica debido a la abajo-regulación de la expresión del receptor de insulina, así como alteraciones en las vías de señalización aguas abajo, lo que resulta en deterioro sensibilidad a la disposición de glucosa mediada por insulina, así como inhibición insuficiente de la glucosa hepática producción^3,4,5,6.

Una amplia gama de modelos animales con inducción genética, nutricional o experimental de la enfermedad han demostrado para ser excelentes herramientas para el estudio de los mecanismos moleculares de resistencia a la insulina y varias formas de diabetes, así como sus enfermedades acompañantes⁷ . Un ejemplo es el modelo de ratón inducido por HFD ampliamente utilizado y bien establecida, que se caracteriza por el rápido aumento de peso debido al aumento de la ingesta dietético en combinación con la menor eficiencia metabólica, resultando en resistencia de insulina^{8, 9}. tanto en modelos animales y humanos, una elevación en sangre glucosa y la insulina niveles en ayunas, así como una tolerancia deteriorada a la administración de glucosa son utilizados indicadores de resistencia a la insulina y otras alteraciones sistémicas de la glucosa metabolismo. Monitoreo glucosa e insulina niveles de sangre en el estado basal o tras estímulo son lecturas de fácil acceso.

El presente Protocolo describe la generación de ratones alimentados con HFD como dos métodos utilizados, la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la prueba de resistencia de insulina (ITT), que son útiles para caracterizar el fenotipo metabólico e investigar alteraciones en el metabolismo de la glucosa. Describimos la OGTT detalladamente, que evalúa la eliminación de una secreción de insulina y carga de glucosa por vía oral con el tiempo. Además, ofrecemos instrucciones sobre cómo llevar a cabo la ITT para investigar la acción de la insulina corporal total mediante el control de la concentración de la glucosa de la sangre en respuesta a un bolo de insulina. Los protocolos descritos en este artículo están bien establecidos y se han utilizado en múltiples estudios^10,11,12. Además de ligeras modificaciones que pueden ayudar a incrementar el éxito, les da las pautas para el diseño experimental y análisis de datos, así como consejos útiles evitar peligros potenciales. Los protocolos descritos pueden ser herramientas muy poderosas para investigar la influencia de la genéticas, farmacológicos, dieta y otros factores ambientales sobre el metabolismo de la glucosa de todo el cuerpo y sus enfermedades asociadas como resistencia a la insulina. Además de la estimulación con glucosa o insulina, puede utilizarse una variedad de otros compuestos para la estimulación según el propósito de la investigación individual. Aunque fuera del alcance de este manuscrito, muchas otras aplicaciones posteriores pueden realizarse en las muestras de sangre dibujada, como el análisis de sangre valores distintos de la glucosa y la insulina (p. ej., lípidos y lipoproteínas perfiles) así como toda Análisis de marcadores metabólicos (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, análisis de Western blot y análisis genitals del Immunosorbent (ELISA)). Citometría de flujo más y fluorescencia activada célula clasificación (FACS) puede aplicarse para investigar los efectos en las poblaciones de la célula distinta, mientras que transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos enfoques también pueden ser utilizados para el análisis no focalizados.

En general, proporcionamos un protocolo simple para generar un modelo de ratón inducido por HFD, mientras más describir dos enfoques de gran alcance para estudiar alteraciones metabólicas de todo el cuerpo, la usa y la ITT, que puede ser herramientas útiles para el estudio de la patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias, especialmente en el campo de enfermedades asociadas por el metabolismo como la resistencia a la insulina y diabetes.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso de la Universidad médica de Viena y llevó a cabo según la Federación de europeo laboratorio animales ciencia asociaciones (personal). Tenga en cuenta que todos los procedimientos descritos en este protocolo sólo deben realizarse después de la aprobación institucional y gubernamental, así como por el personal que es técnicamente competente.

1. HFD-alimentó ratones

Nota: Mantenga todos los ratones C57BL/6J en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a alimentos y agua.

1. En 6 semanas de edad, lugar de ratones para 8-12 semanas en un HFD (40-60% calorías de grasa) para inducir a la obesidad, mientras se alimenta el magro grupo de control una dieta baja en grasa (LFD) (10% calorías de grasa).
2. Determinar el peso corporal de los ratones sobre una base semanal. Las curvas de peso deben muestran patrones similares en ambos grupos, con una pendiente mayor en el grupo HFD-alimentó.

2. USA

Nota: Si los puntos de tiempo de muestreo de sangre son elegidos durante OGTT cada 15 min, el experimento debe realizarse con un máximo de 15 ratones en paralelo, para tener al menos 1 minuto de tiempo de manipulación por ratón.

1. Preparativos en la víspera OGTT
   1. Transferir a los ratones en una jaula con ropa de cama fresca y rápida que durante la noche antes de la prueba (14 h), asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, retirar los alimentos en 18:00 para un tiempo de inicio en la mañana siguiente a las 8:00).
      Nota: Ratones de ayuno durante la noche es el acercamiento estándar, sin embargo un ayuno corto (5-6 h) es más fisiológico para los ratones (véase la discusión para más detalles).
2. Preparaciones en el día del experimento (pero antes del experimento)
   1. Preparar 10 mL de solución glucosa al 20% (disolver D-(+)-glucosa en agua destilada).
      Nota: Todos los reactivos que se administran a los animales deben ser grado farmacológico y estéril.
   2. Preparar una placa de 96 pocillos para colección de plasma, llenando un pozo para cada punto del tiempo de muestreo y cada ratón con 5 μl NaEDTA (0,5 M de EDTA, pH 8.0 en 0.9% NaCl, almacenamiento a temperatura ambiente). Durante el experimento, guarde esta placa de hielo.
      Nota: Ver complementarios figura 1 para una lista detallada.
3. Medir el peso corporal de todos los ratones y su cola la marca con un rotulador permanente para hacer los ratones fácilmente reconocibles (por ejemplo, dash de ratón 1 = 1, guiones de ratón 2 = 2, etc.).
4. Medición de glucosa y tomar muestras de sangre (figura 2)
   1. Cuidadosamente corte 1-2 mm de la punta de la cola con unas tijeras afiladas ("variante A" en la figura 2). Siempre limpie la primera gota de sangre para evitar la hemólisis o contaminación con fluido de tejido antes de tomar muestras de sangre para determinación de glucosa de la sangre. Extraer una pequeña muestra de sangre (aproximadamente 3 μL) para medir el nivel de glucosa en sangre basal (= momento 0) con el glucómetro.
      PRECAUCIÓN: Compruebe y ajuste la cantidad de carga de las tiras reactivas en un glucómetro.
      Nota: Como un método de muestreo alternativo sangre, nick la vena lateral de la cola de un ratón con una hoja de bisturí afilado ("variante B" en la figura 2). La vena lateral de la cola se accede generalmente a aproximadamente un tercio a lo largo de la longitud de la cola de la punta de la cola, moviéndose hacia la base de la cola para muestras múltiples. Se recomienda el uso de una crema de anestesia local. Detener el flujo de sangre aplicando presión con el dedo sobre el tejido blando de al menos 30 s antes de regresa el animal a su jaula.
   2. Recoger una muestra de sangre (alrededor de 30 μL) mediante un tubo capilar fresco (mantener la horizontal del tubo capilar). Vacíe el tubo capilar mediante una pipeta poniendo la punta de la pipeta en la parte superior del extremo del tubo capilar y con cuidado empujar la sangre recogida en un pocillo de la placa de 96 pocillos, evitando burbujas de aire. Repita este procedimiento para todos los ratones - uno a la vez.
      Nota: Como alternativa para recolección de sangre a través de un tubo capilar, utilice una pipeta ajustada al volumen correcto (por ejemplo, 30 μL) para recoger la sangre, o recoger una gota de sangre de la cola en la película de parafina y pipeta lo en la solución de EDTA. Estrictamente evitar el contacto de la jalea de petróleo con sangre o glucómetro Optium, como pueden influir en las mediciones sucesivas de glucosa e insulina.
      PRECAUCIÓN: La OGTT es muy estresante para los ratones: ratones magras pueden perder alrededor de 15% de su peso corporal durante un ayuno nocturno. Además, la muestra de sangre en diferentes puntos temporales conduce a una pérdida considerable de sangre. Para el muestreo de sangre más fácil, es posible Masajear cuidadosamente la mouse-tail con vaselina.
      Nota: Las directrices pueden limitar la cantidad permisible de sangre recogido dentro de un período determinado. Los volúmenes de muestreo y puntos de tiempo deben ajustarse para no exceder los máximos permitidos. El peso corporal de los ratones pueden usarse para calcular el total retiro permitido de la sangre.
5. Calcular el volumen requerido de solución de glucosa basada en peso corporal (1 g glucosa/kg de peso corporal, esta puede incrementarse hasta 3 g/kg) al ser administrado por sonda oral para cada ratón. Por ejemplo, un ratón con un peso de 30 g tendría 150 μL de una solución de glucosa 20% administrar 30 mg de glucosa.
   Nota: A la base de la dosis de glucosa en el peso del ratón es el procedimiento estándar. Si se dispone de datos de la composición corporal, la dosis de glucosa OGTT debe ser calculado basado en la magra masa corporal (ver la discusión para más detalles).
6. Administración de glucosa
   1. Preparación de everythingthat es necesario durante el experimento entero por adelantado (temporizador, hoja de registro del experimento, glucosa monitor y tiras, tubos capilares, jeringas, solución de glucosa, placa de 96 pocillos, bisturí, calculadora, balanza, marcador permanente, papeles de banco, una pipeta con una punta y guantes).
   2. Para el uso de glucosa, refrena el ratón agarrando firmemente por el pescuezo. Aplique suficiente firmeza a la piel alrededor del cuello para evitar que el ratón de una torsión de la refrena y correctamente incline su cabeza hacia atrás. También asegúrese de que el ratón pueda respirar correctamente.
      Nota: Una vez iniciada la administración de glucosa, administración del tiempo es muy importante.
   3. Administrar con cuidado la solución de glucosa (basada en paso 2.5) directamente en el estómago con una aguja de alimentación. Directo con cuidado la aguja de alimentación a través de la boca hacia el esófago. Permitir que el ratón para tragar la aguja: la aguja se hunde totalmente en la parte inferior del esófago/estómago del ratón. Luego inyectar la solución de glucosa (figura 3a).
      1. Si encuentra alguna resistencia, o si el animal lucha inmediatamente, retire la aguja y vuelva a colocarlo. Iniciar el temporizador inmediatamente después de la primera sonda nasogástrica y administrar glucosa a otros ratones en intervalos de 1 minuto.
         Nota: Puede ser útil aplicar una gota de solución de glucosa directamente de la alimentación de la aguja a la boca del ratón, que estimulará la lamer y tragar, facilitando así el facilitar la inserción de la aguja de alimentación. No aplique presión al insertar la aguja de alimentación como esto puede dañar seriamente el animal.
7. Después de 15 minutos, medir niveles de glucosa en sangre con el glucómetro y además tomar muestras de sangre (30 μL) (como se describe en detalle en el paso 2.4) de cada ratón en el mismo orden como fueron inyectados.
   Nota: La gestión del tiempo es muy importante; seguir tan de cerca como sea posible utilizando los mismos intervalos de tiempo en cuanto a la sonda nasogástrica. Que los ratones mover tan libremente como sea posible y el límite de restricción al mínimo durante todo el procedimiento para reducir el estrés, que puede modificar los resultados. Leche la cola con una mano y recoger la sangre con la otra.
8. Repita el paso 2.7 en momentos seleccionados dependiendo de los resultados esperados (p. ej., a 30, 45, 60, 90, 120, 150 y 180 min después de la administración de glucosa). Si los puntos de tiempo son más de 120 min, asegúrese de que los ratones tengan acceso a agua potable. Asegúrese de que los ratones tengan siempre acceso a agua potable. Cuando haya terminado el experimento, retomar los ratones sus jaulas hogar equipados con alimentos y agua.
   PRECAUCIÓN: La OGTT es muy agotador para los ratones. Por lo tanto, esperar al menos 1 semana antes de realizar la siguiente prueba metabólica, como un ITT.
9. Después del experimento, centrifugar las muestras de sangre a 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Transferir el sobrenadante (plasma) para vaciar los pozos de la placa y almacenarlo a-20 ° C hasta su análisis.
   1. Grabar la hemólisis de las muestras si está presente (ver sección 3).
10. Determinar los niveles de la insulina del plasma utilizando un ELISA disponible comercialmente kit (véase la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.
    Nota: Dependiendo del estado de ayuno, así como en el metabolismo de los ratones investigados, pueden surgir dificultades durante este análisis: los niveles de insulina de ayuno durante la noche (momento 0) son muy bajos y por lo tanto cerca del límite de detección. Para evitar este problema, doblar la cantidad de volumen plasmático recomendada y por consiguiente reducir el resultado de la prueba de ELISA. Por otro lado, si ratones alcanzan el pico de insulina durante OGTT, especialmente en los ratones alimentados de HFD, los niveles de insulina pueden exceder el límite de detección: diluir la muestra (por ejemplo, 10 veces con 0.9% NaCl) y repetir el ensayo de ELISA. Hemólisis en muestras de plasma puede conducir a la degradación de la insulina, resultando en una disminución de los valores de lectura. La degradación depende de tiempo, la temperatura y la concentración de hemoglobina en la muestra. Siempre mantenga las muestras hemolizadas fría o con hielo para reducir la degradación de insulina.

3. ITT

Nota: Las mismas precauciones descritas para OGTT (manejo de ratones, sangre, glucómetro y uso de la jalea de petróleo) también deban aplicarse cuando se realiza la ITT. Por ejemplo, todas las inyecciones deben llevarse a cabo dentro de 15 min en intervalos de 1 minuto si 15 ratones son probados en paralelo. Para la ITT, la posterior recogida de muestras de sangre con tubos capilares es opcional.

1. Preparativos antes del experimento
   1. Ayunar a ratones durante al menos 2 h antes de la inyección de insulina, asegurando que los ratones tengan acceso a agua potable (por ejemplo, eliminar alimentos en 8:00, ratones de prueba 2-5 h más tarde).
   2. Diluir 1:1,000 de insulina en 0.9% NaCl (Stock: 100 insulina U/mL; trabajo concentración 0.1 U/mL) y preparar 20% glucosa (D-(+)-solución de glucosa disuelta en agua destilada) administrará si los ratones llegan a ser hipoglucémicos.
      Nota: La ITT se realiza generalmente después de un corto ayuno para evitar la hipoglucemia que puede ocurrir lo contrario en la noche los animales en ayunas. Todos los reactivos que se administran a los animales deben ser grado farmacológico y estéril.
2. Medir el peso corporal de los ratones, marcar la cola, cortar la punta de la cola con unas tijeras afiladas y medir niveles de glucosa en sangre basal como se describe anteriormente para el SOG en el paso 2.4.
3. Inyección de insulina
   1. Para inyectar insulina intraperitoneal (0,75 U insulina/kg de peso corporal, calculada previamente), refrenar el ratón por el método de pescuezo.
   2. Utilizar un estilo fresco, estéril 27 o 30 calibre aguja para cada animal evitar la incomodidad y el riesgo de infección de cualquier sitio de la inyección.
      Nota: La esterilización de la piel puede prolongar la duración de la administración de insulina y así puede causar disturbios adicionales al animal. Por lo tanto, no se recomienda.
   3. Incline la cabeza de ratón hacia abajo en un ángulo ligero para exponer el lado ventral del animal. Coloque la aguja con el bisel hacia arriba y un ángulo de 30 ° en el cuadrante inferior derecho del abdomen del animal (figura 3b). Iniciar el temporizador inmediatamente después de inyecta el primer ratón.
      Nota: Servicio de dosis bajas (0.1 U/kg) puede realizarse para evaluar específicamente la sensibilidad a la insulina hepática. En cuanto a la OGTT, calcular el volumen de inyección basado en el peso corporal es el procedimiento estándar, basándose en la dosis en corporal magra masa es preferible si se dispone de datos de la composición corporal.
4. Los niveles de glucosa en la sangre medida en puntos de tiempo seleccionado (por ejemplo, después de 15, 30, 45, 60 y 90 min).
   Nota: Como la insulina tiene un corto tiempo de ~ 10 min en ratones¹³, diferencias finales después de la administración de insulina (p. ej., después de 2 h) no pueden reflejar un efecto directo de la acción de la insulina. Administrar solución glucosa al 20% en caso de un ratón hipoglicémico (niveles por debajo de 35 mg/dL de glucosa en la sangre) y está en riesgo de morir.
5. Después de la última vez puntos, coloque los ratones en sus jaulas hogar preparados con un montón de comida y agua.

Resultados

La figura 1 muestra un esquema horario para fenotipado metabólico de ratones con una dieta. En una edad de aproximadamente 6 semanas, los ratones deben colocarse en un HFD, mientras que un grupo de LFD puede servir como el grupo de control. Lo importante, peso corporal deberá determinarse semanalmente para observar si hay un aumento esperado en el peso corporal. Cualquier tipo de estrés (p. ej., ruido o comportamiento agresivo del macho) puede int...

Discusión

Con la alta prevalencia de diabetes y enfermedades asociadas en la población mundial, hay una necesidad para la investigación abordando el mecanismo molecular, prevención y tratamiento de la enfermedad¹⁹. El protocolo presentado describe métodos bien establecidos para la generación de ratones HFD, un robusto modelo animal utilizado para la investigación metabólica, así como la conducción de la OGTT y ITT, que son potentes herramientas para la evaluación de las alteraciones metabólicas d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer	Roche	6870228	OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips	Roche	6454038	OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	OGTT
Actrapid - Insulin	Novo Nordisk	417642	ITT
Reusable Feeding Needles	Fine Science Tools	#18061-22	OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes	Braun	9161406V	OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)	Braun	304000	ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)	Braun	4657705	ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible	Braintree Scientific, Inc.	SP0016	OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit	Crystam Chem	90080	OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat	Research Diets Inc	D12492	mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.	Research Diets Inc	D12450B	mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary	Sigma-Aldrich	BR749321	OGTT/ITT
Vaseline - creme	Riviera	P1768677	OGTT/ITT