الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Summary

الغربية قياسية النشاف البروتوكول الأمثل لتحليل عدد قليل من 500 الجذعية المكونة للدم أو الخلايا السلف. التحسين يشمل حذراً في التعامل مع العينة الخلية والحد من عمليات نقل بين أنابيب مباشرة ليسينج الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنموذج لايمملي.

Abstract

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) خلايا نادرة، مع الماوس نخاع العظام التي تحتوي على فقط 25,000 ~ المظهرية طويلة الأجل إعادة إسكانها يكونوا هسكس. وكان بروتوكول blotting غربية الأمثل ومناسبة لتحليل إعداد صغيرة من هسكس (500-15,000 الخلايا). هسكس المظهرية تنقيته، وحسابها بدقة، وتفكيك مباشرة في لايملي عينة المخزن المؤقت. ليساتيس التي تحتوي على إعداد متساوية من خلايا تم تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، ووصمة عار وأعد وتجهيزها بعد الغربية القياسية النشاف البروتوكولات. باستخدام هذا البروتوكول، 2,000-5,000 هسكس يمكن تحليلها بصورة روتينية، وفي بعض الحالات يمكن الحصول على بيانات من عدد قليل من الخلايا 500، مقارنة بخلايا 20,000 إلى 40,000 عنها في معظم المنشورات. هذا البروتوكول ينبغي أن ينطبق عموما على الخلايا الأخرى المكونة للدم، ويتيح التحليل الروتيني لإعداد صغيرة من الخلايا باستخدام الإجراءات المختبرية القياسية.

Introduction

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي الذاتي تجديد الخلايا التي يمكن أن تؤدي إلى جميع الدم الأنساب. فهي نادرة نسبيا من الخلايا في نخاع العظام، يجعل من الصعب التحليلات الكيميائية الحيوية. النهج المناسبة لتحليل خلايا نادرة، مثل التدفق الخلوي، كانت مفيدة للغاية لقياس الكميات النسبية من علامات سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا. ومع ذلك، يتطلب تحليل البروتينات داخل الخلايا باستخدام الخلية بيرميبيليزيشن إجراءات لتمكين الوصول إلى جسم، وليس كل الخلايا السطحية [ابيتوبس] البقاء على قيد الحياة هذه الإجراءات^1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، الأجسام المضادة التي تميز بين منتجات بروتين مختلف isoforms أو الانقسام ولا تتوفر غالباً للتدفق الخلوي، وذلك المحققين لا تزال تعتمد على البقع الغربية لبعض أنواع التحليل.

تحليل لطخة غربية للخلية ليساتيس إجراء روتيني في معظم المختبرات. يمكن تنقية الخلايا تحت ظروف الأم التي تحافظ على [ابيتوبس] جزيئات سطح الخلية، ويمكن بعد ذلك أعد ليساتيس الخلية وتحليلها. ومع ذلك، يمكن أن يتطلب تحليل البروتينات في الخلية الأولية نادرة السكان بالغربية لطخة يوثانيزينج إعداد كبيرة من الحيوانات للحصول على ما يكفي من خلايا. بإجراء تعديلات صغيرة على عدة خطوات، كان بروتوكول blotting غربية تقليدية قادرة على الكشف عن البروتينات في عدد قليل نسبيا من هسكس (500-15,000، اعتماداً على بروتين الفائدة). وتشمل التعديلات بدقة عد الخلايا، بدقة التعامل مع الخلية بيليه، الحد من عمليات نقل الخلايا بين أنابيب تقليل الخسائر في الخلية، وليسينج عدد محدد من الخلايا مع تحميل تتركز العازلة التي تحتوي على بروتوزوم و مثبطات الفوسفاتيز. وتشمل العديد من التقارير المنشورة البقع الغربية التي تم الحصول عليها مع 20,000 أو أكثر هسكس^3،،من^45،،من⁶⁷؛ سوف يقلل هذا الإجراء البسيط عدد الخلايا والحيوانات التجريبية اللازمة لإنتاج بيانات مكافئة من بين 4 و 40 ضعفا. البروتوكول يهدف إلى تطبيع النتائج على أساس كل خلية، بدلاً من رقابة داخلية. وهذا يتيح الكشف عن التخفيضات الإجمالية في مستويات البروتين التي يمكن التغاضي عنها إذا هي تطبيع البيانات إلى رقابة داخلية. ووصفت أهمية تطبيع على أساس كل خلية لتحليل البيانات التعبير الجيني⁸، وينطبق نفس المبدأ على تحديد كمية البروتينات بوصمة عار الغربية. هذا البروتوكول الأمثل ينبغي أن يكون مفيداً لأي شخص بحاجة إلى تحليل عدد صغير من الخلايا.

Protocol

يجب أن تتم جميع الإجراءات وفقا لاستخدام الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للرعاية. الإجراءات التي وضعت من أجل تحليل مورين الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسكس و HPs)، ولكن يمكن تكييفها لتحليل السكان خلية أخرى.

1-التدفق الخلوي عزلة هسكس مورين و HPs

1. حصاد خلايا نخاع العظام مورين كما هو موضح في الأدب⁶.
   ملاحظة: في البيانات المعروضة في الشكل 1 و الشكل 2، وكان حصاد نخاع العظام من الفئران C57BL/6J.
2. أداء نسب استنفاد الخلايا نخاع العظام باستخدام مجموعة أدوات استنفاد نسب ماوس، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
3. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة ضد علامات الخلية السطحية للفائدة ك وصف⁷. في هذه التجارب هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2، تستخدم الأجسام المضادة للهيئة-1 كيت، Flt3 وعلامات النسب (لين) Mac1، Gr1، CD3e، B220، و Ter119.
4. فرز 2,000 20,000 لين^– Sca1⁺⁺ Flt3 عدة خلايا^– (HSCs) أو لين^–Sca1^–الخلايا كيت⁺ (هبس) في أنابيب ايبندورف 1.5 مل يحتوي على 0.1 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الأبقار الجنين 2% مصل الدم (FBS).
   ملاحظة: للبيانات المبينة في الشكل 1 و الشكل 2، تم فرز الخلايا استخدام Cytometer التدفق مع فوهة 70 ميكرومتر. حجم جمع الحد الأقصى 1.4 مل.

2. إعداد نموذج

ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة. عملية العينة بعناية فائقة. عند إزالة المادة طافية، يكون حريصا جداً على عدم تعكير بيليه الخلية.

1. أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل الأنابيب التي تحتوي على خلايا تم فرزها في دوار دلو يتأرجح عند 4 درجة مئوية، 500 غرام x، لأدنى 5 إزالة كافة ولكن ما يقرب من 100 ميليلتر من المادة طافية من الخلية بيليه جداً برفق باستخدام ماصة وتلميح بيبيت ميليلتر 20. عدم الإزعاج بيليه.
   1. إذا كانت العينة تحتوي على خلايا أقل من 5,000، وأقل من 0.2 مل من الحجم الإجمالي للعينة تم فرزها، نقل الخلايا أولاً إلى ربط انخفاض 0.2 مل أنابيب PCR قبل الطرد المركزي.
   2. إذا كان النموذج يحتوي على خلايا أقل من 5,000 وحجم أكثر من 0.2 مل، تدور الخلايا إلى الأسفل مع أجهزة الطرد مركزي في 4 درجات مئوية، 500 x ز، لمدة 5 دقائق، وإزالة كافة ولكن 200 ميليلتر من المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا الأعلاف في ميليلتر 200 المتبقية من المادة طافية، ثم نقل الخلايا إلى أنابيب PCR 0.2 مل وتدور إلى أسفل مرة أخرى. إزالة كافة ولكن 20-30 ميليلتر من بيليه بعد الدوران الثاني وتعليق إعادة الخلايا.
2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في اليسار طافية في الأنبوب. إذا لزم الأمر، إضافة برنامج تلفزيوني إضافي بنسبة 2% FBS/برنامج تلفزيوني (يمكنك أيضا استخدام 2% ألبومين المصل البقري (BSA)/برنامج تلفزيوني، أو برنامج تلفزيوني وحدها) للحصول على تركيز 5 x10⁴ إلى 5 × 10⁵ خلايا/مل.
   ملاحظة: استخدام حساب الخلية التي تجمعها الخلوي لتقدير حجم تستخدم لتعليق الخلايا.
3. استخدام ميليلتر 2-5 تعليق إعادة الخلايا لتحديد تركيز خلية دقيقة استخدام عداد الآلي خلية (اتباع إرشادات الشركة المصنعة) أو هيموسيتوميتير⁹.
4. نقل كمية من تعليق إعادة الخلايا التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا إلى 1.5 مل أنابيب جديدة. للتجربة في الشكل 1، نقلوا هسكس أو هبس 2,000، 1000 أو 500. العدد المطلوب من الخلايا تعتمد على قوة الإشارة التي حصل عليها لطخة غربية، ويتحدد تجريبيا. إجراء النقل باستخدام ميليلتر 20 أو 100 ميليلتر ايبندورف ماصة تلميح.
5. الطرد المركزي الخلايا في دوار دلو يتأرجح في 4 درجات مئوية، 500 x ز، لمدة 5 دقائق.
6. لإنشاء 100 × حلول الأسهم، حل مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز في [دمس] وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
7. تحضير x Laemmli 2 عينة المخزن المؤقت بتمييع العازلة عينة x Laemmli 4 المقدمة من الشركة المصنعة مع مبلغ مساو من الماء المقطر. إضافة مبلغ مناسب للمخزون 100 x من مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز للحصول على تركيز نهائي لمثبطات x 2 في المخزن المؤقت لنموذج x Laemmli 2.
   ملاحظة: يمكن إجراء المخزن المؤقت نموذج x Laemmli 2 مسبقاً، ولكن ينبغي إضافة مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز فورا قبل إضافة 2 x Laemmli عينة المخزن المؤقت (بالإضافة إلى مثبطات) لبيليه الخلية الخلايا، وكما هو موضح في الخطوة التالية.
8. إزالة جزء من المادة طافية من بيليه الخلية، وإلى المادة طافية المتبقية في الأنبوب مع بيليه الخلية بعناية، وإضافة وحدة تخزين تساوي 2 x Laemmli عينة المخزن المؤقت بالإضافة إلى مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز لتحقيق تركيز نهائي 500 خلايا/ميليلتر في x Laemmli 1 عينة المخزن المؤقت.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إذا قمت بنقل الخلايا 2,000 في إجمالي حجم 20 ميليلتر لأنبوب في "الخطوة 2، 5"، بعد سينتريفوجينج الخلايا (الخطوة 2.6) يجب عليك إزالة ميليلتر 18 من المادة طافية من بيليه، وميليلتر 2 من المادة طافية المتبقية إضافة وحدة تخزين متساوية (2 ميليلتر) من 2 × لايملي عينة العازلة لتحقيق تركيز نهائي من الخلايا 500/ميليلتر في x Laemmli 1 عينة المخزن المؤقت.
9. ريسوسبيند بيليه لتوليد في أقرب وقت ممكن. عند هذه النقطة، يمكن أن تكون العينات اليكتروفوريسيد فورا من خلال المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-الصفحة، أو يمكن انطباق المجمدة في سائل ن₂ وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

3-التفريد

1. الحرارة ليساتيس في كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية أو في الماء المغلي لمدة 5 دقائق.
2. اليكتروفوريسي 1-40 ميليلتر من ليساتيس (التي تحتوي على من 500 حتى 20,000 خلية مكافئات) من خلال الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية في 100 فولت باستخدام البروتوكولات القياسية¹⁰.
   ملاحظة: وحدة التخزين المحملة في الهلام ليستي يتحدد بعدد الخلايا اللازمة لتوليد إشارة المرغوب فيه، وسوف يعتمد على وفرة البروتين من الفائدة، ونوعية الأجسام المضادة. تم الحصول على البيانات في الشكل 1 مع 2,000، 000 1 و 500 خلية مكافئات من ليساتي. عرض البئر ينبغي في المجموعة من 3 مم إلى 1.5 مم-1.5 ملم يمكن أن تكون الأسنان قص من مشط متاحة تجارياً مع أوسع الأسنان باستخدام مقص.

4-نقل وكتلة

ملاحظة: إجراء وصمة عار غربية عقب البروتوكولات القياسية¹¹. ويرد موجز الخطوات هنا:

1. بريتريت غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن مع الميثانول ل 10 s، ثم أغسل الغشاء بإيجاز مع الماء المقطر.
2. نقل البروتين من جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للغشاء اتباع الإرشادات الموجودة في دليل المستخدم توفيرها من قبل الشركة المصنعة للجهاز على نقل.
3. بعد نقل، كتلة الغشاء مع 2 مل من 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في ببست (برنامج تلفزيوني مع 0.1% توين) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية عقب البروتوكولات القياسية¹¹.

5-جسم وسم

1. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة على شاكر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية استخدام تخفيف الجسم المضاد الذي أوصت به البائع.
   ملاحظة: في "الجدول للمواد"، يتم إظهار الأجسام المضادة، الذي كنا قد صدق هسكس و HPs وتخفيف جسم المقابلة،. أداء جسم العلامات باستخدام إجراءات معيارية⁸.

6-كشف

1. يغسل الغشاء 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل في ببست في درجة حرارة الغرفة.
2. احتضان الغشاء مع 2 مل من المخزن المؤقت تشيميلومينيسسينسي المعززة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كشف الإشارات استخدام نظام تصوير عقب تعليمات، الشركة المصنعة أو الفيلم autoradiography وتحميض أفلام.

النتائج

وتظهر نتائج تمثيلية من 500-000 2 المنقي هسكس و HPs في الشكل 1 و الشكل 2. ويمكن الكشف عن إشارة β-أكتين في الشكل 1 من عدد قليل من 500 هسكس وهبس تنقيته من نخاع العظام واحدة بالماوس. ملاحظة أن تحميل ليساتيس في الآبار 1.5 مم تنتج إشارة أقوى ب...

Discussion

النشاف الغربية تقنية شائعة لكشف البروتينات المحددة وتفعيل مسارات الإشارات في الأنسجة أو الخلايا. عن طريق إدخال تعديلات بسيطة على إجراء استخداماً، كنا قادرين على اكتشاف البروتينات المختلفة 15 (جدول المواد) بشكل روتيني في هسكس 15,000، وفي بعض الحالات في عدد قليل من هسكس 500. The most الخطوا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis