Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Zusammenfassung

Ein standard Western Blot-Protokoll wurde für die Analyse möglichst wenige 500 Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen optimiert. Optimierung beinhaltet sorgfältige Handhabung von die Zellprobe, Begrenzung der Transfers zwischen Röhren und direkt Lyse der Zellen im Probenpuffer Laemmli.

Zusammenfassung

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selten, mit der Maus Knochenmark enthält nur ~ 25.000 phänotypischen lange term repopulating HSCs. Ein Western Blot Protokoll wurde optimiert und eignet sich für die Analyse einer kleinen Zahl von Hsz (500-15.000 Zellen). Phänotypische HSCs wurden gereinigt, genau gezählt und direkt in Laemmli Probenpuffer lysiert. Lysates mit gleicher Anzahl von Zellen analysiert wurden durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), und der Fleck war vorbereitet und nach standard Western Blot-Protokolle bearbeitet. Mithilfe dieses Protokolls 2.000-5.000 HSCs routinemäßig analysiert werden können, und in einigen Fällen Daten erhalten Sie von nur 500 Zellen, im Vergleich zu den 20.000 bis 40.000 Zellen in den meisten Publikationen berichtet. Dieses Protokoll sollte generell für andere hämatopoetischen Zellen, und ermöglicht die routinemäßige Analyse einer kleinen Zahl von Zellen unter Verwendung von standard-Labor-Verfahren.

Einleitung

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selbst erneuernde Zellen, die zu allen Blut Linien führen können. Sie sind relativ seltene Zellen im Knochenmark, biochemische Analysen schwierig zu rendern. Geeignet für die Analyse von seltenen Zellen, wie Durchflusszytometrie, Ansätze wurden äußerst nützlich zur Quantifizierung der relativer Mengen der Zelle oberflächenmarker und intrazelluläre Proteine. Aber die Analyse von intrazellulären Proteinen erfordert den Einsatz von Zelle Permeabilisierung Verfahren zur Antikörper-Zugriff zu ermöglichen, und nicht alle Zelle Oberfläche Epitope überleben diese Verfahren^1,2. Darüber hinaus Antikörper, die Unterscheidung zwischen verschiedenen Isoformen oder das Dekolleté Proteinprodukte sind oft nicht für Durchflusszytometrie zur Verfügung, und daher die Ermittler noch setzen auf Western Blots für bestimmte Arten von Analysen.

Western-Blot Analyse der Zelle Lysates ist ein Routineverfahren in den meisten Labors. Zellen können unter heimischen Bedingungen, die die Epitope der Zelle Oberfläche Moleküle zu bewahren gereinigt werden, und anschließend Zelle Lysates vorbereitet und analysiert werden können. Jedoch kann die Analyse von Proteinen in seltenen Primärzelle, die Populationen von Western blot erforderlich euthanizing große Zahl von Tieren genügend Zellen zu erhalten. Durch kleine Anpassungen in mehreren Schritten, konnte einen konventionellen westlichen befleckenden Protokoll Proteine in relativ kleinen Stückzahlen HSCs (500-15.000, abhängig von dem Protein des Interesses) zu erkennen. Die Anpassungen beinhalten genau zählen der Zellen, Umgang mit sorgfältig die Zelle Pellet, Reduzierung der Übertragung von Zellen zwischen Rohren Zellverlust, zu minimieren und Lyse einer definierten Anzahl von Zellen mit einer konzentrierten Belastung mit Proteasom Puffern und Phosphatase-Inhibitoren. Viele veröffentlichten Berichte enthalten Western Blots erhalten mit 20.000 oder mehr HSCs^3,4,5,6,7; Dieses einfache Verfahren reduziert die Anzahl der Zellen und Versuchstiere erforderlich, um entsprechende Daten von zwischen 4 und 40 Falte zu produzieren. Das Protokoll soll Ergebnisse pro Zelle und nicht um eine interne Kontrolle zu normalisieren. Dies ermöglicht eine Erfassung der allgemeine Rückgang der Protein-Ebene, die übersehen werden können, wenn Daten in eine interne Kontrolle normalisiert werden. Die Bedeutung der Normalisierung auf einer Basis pro Zelle wurde für die Analyse von Gen Ausdruck Daten⁸beschrieben, und das gleiche Prinzip gilt für die Quantifizierung der Proteine durch Western-Blot. Dieses optimierte Protokoll sollte nützlich für alle, die zu geringe Anzahl Zellen analysieren.

Protokoll

Alle Verfahren müssen im Einklang mit institutionellen Tiernutzung und Pflege-Richtlinien durchgeführt werden. Das Verfahren wurde entwickelt für die Analyse von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSCs und HPs), aber für die Analyse von anderen Zellpopulationen angepasst werden kann.

1. Flow Cytometry Isolation der murinen HSCs und HPs

1. Murine Knochenmarkzellen zu ernten, wie in der Literatur⁶beschrieben.
   Hinweis: In die in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellten Daten, Knochenmark von Mäusen C57BL/6J geerntet wurde.
2. Führen Sie Linie Erschöpfung der Knochenmarkzellen mit einem Maus-Linie Erschöpfung Kit, nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen die Zelle oberflächenmarker von Interesse wie beschrieben⁷. In den Experimenten, die in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt werden Antikörper gegen Sca-1, Kit, Flt3 und Abstammung (Lin) Marker Mac1, Gr1, CD3e, B220 und Ter119 verwendet.
4. Sortieren von 2.000-20.000 Lin^– Sca1⁺⁺ Flt3 Kit^– Zellen (HSCs) oder Lin^–Sca1^–Kit⁺ Zellen (HPs) in 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen mit 0,1 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % fetalen Rind Serum (FBS).
   Hinweis: Für die Daten, die in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt, wurden Zellen mit einem Flow Cytometer mit einer Düse 70 µM sortiert. Die maximale Auffangvolumen beträgt 1,4 mL.

2. die Probenvorbereitung

Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig. Die Probe sehr sorgfältig verarbeitet. Beim Entfernen des Überstands vorsichtig nicht zu stören das Pellet Zelle sein.

1. Zentrifuge die 1,5 mL Röhrchen mit sortierten Zellen in eine schwingende Eimer-Rotor bei 4 ° C, 500 X g, für 5 min. entfernen Sie alle, aber rund 100 µL des Überstands aus der Zelle pellet sehr sanft mit einer Pipette und ein 20 µL pipettieren Tipp. Stören Sie das Pellet nicht.
   1. Wenn die Probe weniger als 5.000 Zellen enthält, und das Gesamtvolumen der sortierte Probe weniger als 0,2 mL beträgt, übertragen Sie die Zellen zunächst auf geringe Bindung 0,2 mL PCR-Röhrchen vor der Zentrifugation.
   2. Wenn die Probe enthält weniger als 5.000 Zellen und Volumen beträgt mehr als 0,2 mL, die Zellen spin-down mit einer Zentrifuge bei 4 ° C, 500 X g für 5 min, und entfernen Sie alle 200 µL des Überstands. Wieder aussetzen der gebeizte Zellen in die restlichen 200 µL überstand, dann übertragen die Zellen, die 0,2 mL PCR-Röhrchen und spin-down wieder. Entfernen Sie alle aber 20-30 µL aus der Pellets nach der zweiten Runde und auszusetzen Sie Zellen wieder.
2. Aufschwemmen der Zellen im linken überstand in die Röhre. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche PBS in 2 % FBS/PBS (Sie können auch 2 % Rinderserumalbumin (BSA) / PBS oder PBS allein) zu einer Konzentration von 5 X10⁴ bis 5 x 10⁵ Zellen/mL.
   Hinweis: Verwendung die Zelle zählt erfassten zytometrie einzuschätzen, das Volumen, um die Zellen zu unterbrechen.
3. Verwenden Sie 2 bis 5 µL der neu suspendierten Zellen, um eine genaue Zellkonzentration mit einem automatisierten Zelle Zähler (nach Herstellerangaben) oder eine Hemocytometer⁹bestimmen.
4. Ein Volumen von neu suspendierten Zellen, in denen die gewünschte Anzahl von Zellen, die neue 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. Für das Experiment in Abbildung 1wurden 2.000, 1.000, 500 HSCs oder HPs übertragen. Die gewünschte Anzahl von Zellen hängt von der Stärke des Signals durch die Western-Blot und empirisch ermittelt. Führen Sie die Übertragung mit 20 µL oder 100 µL Eppendorf PIPETTENSPITZE.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen in eine schwingende Eimer-Rotor bei 4 ° C, 500 X g für 5 min.
6. Um 100 x Stammlösungen zu generieren, lösen Sie Proteasom und Phosphatase Inhibitoren in DMSO nach den Anweisungen des Herstellers auf.
7. Bereiten Sie 2 X Laemmli Probenpuffer durch die 4 X Laemmli Probenpuffer des Herstellers mit einer äquivalenten Menge an destilliertem Wasser verdünnen. Fügen Sie eine entsprechende Menge an die 100 X Aktien von Proteasom und Phosphatase-Inhibitoren, eine Endkonzentration von 2 X Inhibitoren in 2 X Laemmli Probenpuffer zu erhalten.
   Hinweis: Die 2 X Laemmli Probenpuffer kann im Voraus gebucht werden, aber die Proteasom und Phosphatase-Inhibitoren sollte unmittelbar vor dem Hinzufügen der 2 X Laemmli Probenpuffer (plus Inhibitoren), die Zelle Pellet zur lyse der Zellen, wie beschrieben im folgenden Schritt hinzugefügt werden.
8. Sorgfältig entfernen Sie einen Teil des Überstands aus der Zelle Pellet und der überstand noch in die Röhre mit der Pellet-Zelle, fügen Sie ein gleiches Volumen von 2 X Laemmli Probenpuffer plus Proteasom und Phosphatase-Hemmer, eine Endkonzentration von 500 zu erreichen Zellen/µL in 1 X Laemmli Probenpuffer.
   Hinweis: zum Beispiel, wenn 2.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 20 µL zu übertragen, um ein Rohr in Schritt 2.5, nach dem Zentrifugieren der Zellen (Schritt 2.6) sollten Sie 18 µL des Überstands von Pellets, entfernen und 2 µL des Überstandes, die ausgeführt wird fügen Sie zum gleichen Volumen (2 µL hinzu) 2 x Laemmli Probenpuffer, eine Endkonzentration von 500 Zellen/µL in 1 X Laemmli Probenpuffer zu erreichen.
9. Aufschwemmen der Pellet um so schnell wie möglich die lysate zu generieren. An dieser Stelle die Proben können sofort durch SDS-PAGE Gelen electrophoresed werden, oder kann Snap in Flüssigkeit N₂ eingefroren und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.

(3) Elektrophorese

1. Erhitzen Sie Lysates im Heizblock bei 95 ° C oder in kochendem Wasser für 5 Minuten.
2. 1-40 µL der Lysates (mit von 500 bis 20.000 Zelle äquivalente) durch SDS-PAGE Gelen bei 100V mit Standardprotokollen¹⁰electrophorese.
   Hinweis: Das Volumen der lysate in das Gel geladen wird bestimmt durch die Anzahl der Zellen benötigt, um das wünschenswerte Signal zu erzeugen, und richtet sich nach der Fülle des Proteins des Interesses und der Qualität des Antikörpers. Die Daten in Abbildung 1 wurden mit 2.000, 1.000 und 500 Zelle äquivalente lysate erhalten. Die Breite des Brunnens sollte im Bereich von 3 mm bis 1,5 mm. 1,5 mm, die Zähne werden können aus einem handelsüblichen Kamm mit breiteren Zähnen mit einer Schere geschnitten werden.

4. transfer und blockieren

Hinweis: Führen Sie ein Western-Blot nach Standardprotokollen¹¹. Die Schritte werden hier kurz beschrieben:

1. Vorbehandeln einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran mit Methanol für 10 s, dann waschen die Membran kurz mit Wasser destilliertem.
2. Übertragen Sie das Protein aus dem SDS-PAGE-Gel an die Membran nach den Anweisungen in der Bedienungsanleitung des Herstellers des Geräts übertragen.
3. Nach der Übertragung, die Membran mit 2 mL 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBST blockieren (PBS mit 0,1 % Tween) über Nacht bei 4 ° C nach Standardprotokollen¹¹.

5. Antikörper Labeling

1. Inkubieren Sie die Membran mit Antikörpern auf einen Shaker über Nacht bei 4 ° C vom Hersteller empfohlene Antikörper-Verdünnungen verwenden.
   Hinweis: In der Tabelle der Materialien, sind Antikörper, die wir für HSCs und HPs und die entsprechenden Antikörper-Verdünnungen überprüft haben, angezeigt. Führen Sie die Antikörper Kennzeichnung mit Standardverfahren⁸.

6. Nachweis

1. Waschen Sie die Membran 3 mal 5 min für jede Wäsche in PBST bei Raumtemperatur.
2. Inkubieren Sie die Membran mit 2 mL verstärkte Chemilumineszenz-Puffer für 1 min bei Raumtemperatur. Erkennen Sie die Signale mit Hilfe eines abbildenden Systems nach Anweisungen, oder Autoradiographie Film und Film-Prozessor des Herstellers.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse von 500-2.000 gereinigten HSCs und HPs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Das β-Aktin-Signal in Abbildung 1 kann aus so wenig wie 500 HSCs erkannt werden und HPs gereinigt aus dem Knochenmark von einem einzigen Mausklick. Beachten Sie, dass die Lysates in 1,5 mm Brunnen laden ein viel stärkeres Signal von 500 HPs als laden in 3,0 mm Brunnen produziert.

Diskussion

Western Blot ist ein verbreitetes Verfahren zur Erkennung von spezifischen Proteinen und die Aktivierung der Signalwege in Geweben oder Zellen. Durch die Einführung von kleinen Anpassungen zu einem häufig verwendeten Verfahren, konnten wir routinemäßig 15 verschiedene Proteine (Table of Materials) in 15.000 HSCs und in einigen Fällen in so wenig wie 500 HSCs erkennen. The Most wichtige Schritte in diesem Protokoll sind: (1) genau zählen die Zellen, 2) minimieren die Anzahl der Transfers zwischen R?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis