Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Resumo

Um padrão ocidental que mancha o protocolo foi otimizado para analisar apenas 500 tronco hematopoiético ou células progenitoras. Otimização envolve cuidado, manipulação da amostra celular, limitando as transferências entre os tubos e lise diretamente as células no buffer de Laemmli sample.

Resumo

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células raras, com a medula óssea de rato contendo apenas ~ 25.000 fenotípica longo prazo repopulados a linfócitos. Um protocolo de mancha ocidental foi otimizado e adequado para a análise de um número pequeno de linfócitos (células de 500-15.000). Fenotípicos linfócitos foram purificados, contados com precisão e lysed diretamente no buffer de Laemmli sample. Lisado contendo igual número de células foram analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), e o Borrão foi elaborado e processado seguindo mancha protocolos de padrão ocidental. Usando este protocolo, 2.000-5.000 linfócitos podem ser rotineiramente analisados, e em alguns casos os dados podem ser obtidos de até 500 células, em comparação com as células de 20.000 a 40.000 relatadas na maioria das publicações. Este protocolo deve ser geralmente aplicável a outras células hematopoiéticas e permite a análise de rotina de um número pequeno de células usando os procedimentos padrão do laboratório.

Introdução

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células auto renovadora que podem dar origem a todas as linhagens de sangue. Eles são relativamente raras células na medula óssea, tornando difícil a análises bioquímicas. Abordagens adequadas para a análise de células raras, tais como citometria de fluxo, foram extremamente úteis para quantificar a quantidade relativa de marcadores de superfície celular e proteínas intracelulares. No entanto, a análise de proteínas intracelulares exige o uso de procedimentos de permeabilização celular para permitir o acesso do anticorpo, e nem todos os resumos de superfície de célula sobrevivem nestes procedimentos^1,2. Além disso, os anticorpos que discriminem entre proteínas diferentes isoformas ou clivagem produtos muitas vezes não estão disponíveis para citometria de fluxo, e, portanto, os investigadores ainda dependem de borrões ocidentais para determinados tipos de análises.

Análise ocidental do borrão de lisados celulares é um procedimento de rotina na maioria dos laboratórios. Células podem ser purificadas em condições nativas que preservam os epítopos de moléculas de superfície celular, e posteriormente, lisados celulares podem ser preparados e analisados. No entanto, a análise de proteínas em rara célula primária populações por Western blot pode exigir a eutanásia de um grande número de animais para obter células suficientes. Ao fazer pequenos ajustes para vários passos, um protocolo de mancha ocidental convencional foi capaz de detectar proteínas em um número relativamente pequeno de linfócitos (500-15.000, dependendo da proteína de interesse). Os ajustes incluem contando com precisão as células, manipular cuidadosamente o centrifugado, reduzindo as transferências de células entre os tubos para minimizar a perda de células, e lise um número definido de células com uma carga concentrada de buffer contendo Proteassoma e inibidores da fosfatase. Muitos relatórios publicados incluem borrões ocidentais obtidos com 20.000 ou mais linfócitos^3,4,5,6,7; Este simples procedimento reduzirá o número de células e animais experimentais necessários para produzir dados equivalentes por entre 4 e 40 vezes. O protocolo visa normalizar os resultados em uma base por célula, ao invés de um controle interno. Isto permite a detecção de globais reduções nos níveis de proteína que podem ser ignorados se dados são normalizados para um controle interno. A importância da normalização em uma base por célula foi descrita para a análise de dados de expressão do gene⁸, e o mesmo princípio aplica-se a quantificação de proteínas por Western blot. Este protocolo otimizado deve ser útil para qualquer um que precisar analisar um número pequeno de células.

Protocolo

Todos os procedimentos devem ser efectuados de acordo com orientações de cuidados e uso animal institucional. O procedimento foi desenvolvido para a análise de murino tronco e progenitoras células hematopoiéticas (linfócitos e HPs), mas pode ser adaptado para a análise de outras populações de células.

1. fluxo Cytometry isolamento de linfócitos murino e HPs

1. Colher células-murino da medula óssea, como descrito na literatura⁶.
   Nota: Nos dados apresentados na Figura 1 e Figura 2, foi colhida da medula óssea de camundongos C57BL/6J.
2. Execute o esgotamento da linhagem de células de medula óssea usando um kit de depleção de linhagem de rato, seguindo as instruções do fabricante.
3. Incube as células com anticorpos contra os marcadores de superfície celular de interesse como descrito⁷. As experiências mostradas na Figura 1 e Figura 2, anticorpos para Sca-1, Kit, Flt3 e marcadores de linhagem (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 e Ter119 são usados.
4. Classificar a 2.000-20.000 Lin^– Sca1⁺Kit⁺ Flt3^– células (linfócitos) ou Lin^–Sca1^–células Kit⁺ (HPs) em tubos de Eppendorf 1,5 mL contendo 0,1 mL de fosfato tampão salino (PBS), com 2% de bovino fetal soro (FBS).
   Nota: Para os dados mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células foram classificadas usando um citômetro de fluxo com um bocal de 70 µM. O volume máximo de coleção é 1,4 mL.

2. preparação da amostra

Nota: Este passo é fundamental. Processe a amostra com muito cuidado. Ao remover o sobrenadante, tenha muito cuidado para não perturbar o centrifugado.

1. Tubos de centrífuga a 1,5 mL contendo células classificadas em um rotor de balde balançando a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min. remover todos, mas aproximadamente 100 µ l do sobrenadante da célula da pelota muito delicadamente, usando uma pipeta e uma ponta da pipeta 20 µ l. Não perturbe a pelota.
   1. Se a amostra contém menos de 5.000 células, e o volume total da amostra classificada é inferior a 0,2 mL, transferi as células primeiro para ligação baixa 0,2 mL da polimerase antes da centrifugação.
   2. Se a amostra contém menos de 5.000 células e o volume é mais do que 0,2 mL, girar as células para baixo com uma centrifugação a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min e remover todos, mas 200 µ l do sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas os restantes 200 µ l do sobrenadante, em seguida, transferir as células para os tubos PCR de 0,2 mL e spin para baixo novamente. Remover todas as mas de 20-30 µ l da pelota após a segunda rodada e re-suspender as células.
2. Ressuspender as células em esquerda sobrenadante no tubo. Se necessário, adicionar adicionais PBS em 2% FBS/PBS (você também pode usar 2% albumina de soro bovino (BSA) / PBS, ou PBS sozinho) para obter uma concentração de 5 x10⁴ a 5 x 10⁵ células/mL.
   Nota: Use a célula conta coletados por citometria para estimar o volume usado para suspender as células.
3. Use 2 a 5 µ l de células re-suspensas para determinar uma concentração exata de célula usando um contador de célula automatizada (seguindo as instruções do fabricante) ou um hemocytometer⁹.
4. Transferi um volume de re-suspensão células contendo o número desejado de células para novos tubos de 1,5 mL. Para o experimento na Figura 1, 500, 1.000 ou 2.000 linfócitos ou HPs foram transferidos. O número desejado de células varia de acordo com a força do sinal obtido por Western blot e é determinado empiricamente. Realize a transferência usando um 20 µ l ou 100 ponta da pipeta Eppendorf µ l.
5. Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min.
6. Para gerar 100 x Soluções conservadas em estoque, dissolva inibidores do Proteassoma e fosfatase em DMSO, de acordo com as instruções do fabricante.
7. Prepare o amortecedor da amostra 2 x Laemmli diluindo o amortecedor da amostra 4 x Laemmli fornecido pelo fabricante com uma quantidade equivalente de água destilada. Adicione uma quantidade apropriada do stock de inibidores do Proteassoma e fosfatase para obter uma concentração final de 2 inibidores de x em tampão de amostra x Laemmli 2 100 x.
   Nota: O amortecedor da amostra x Laemmli 2 pode ser feita com antecedência, mas os inibidores do Proteassoma e fosfatase devem ser adicionados imediatamente antes de adicionar o 2 x Laemmli tampão de amostra (mais inibidores) para o centrifugado para lisar as células, conforme descrito na etapa seguinte.
8. Cuidadosamente retire uma porção do líquido sobrenadante do centrifugado e o sobrenadante remanescente no tubo com o centrifugado, adicione igual volume de tampão de amostra x Laemmli 2, além de inibidores do Proteassoma e fosfatase a obter uma concentração final de 500 células / µ l em 1 amortecedor da amostra x Laemmli.
   Nota: por exemplo, se você transferir 2.000 células em um volume total de 20 µ l para um tubo na etapa 2.5, após centrifugação das células (passo 2.6), você deve remover 18 µ l do sobrenadante da pelota e a 2 µ l do sobrenadante que resta adicionar um volume igual (2 µ l) de 2 x Laemmli amortecedor da amostra para obter uma concentração final de 500 células / µ l em 1 amortecedor da amostra x Laemmli.
9. Resuspenda o pellet para gerar o lisado logo que possível. Neste ponto, as amostras podem ser imediatamente electrophoresed através do gel de SDS-PAGE, ou pode ser snap congelado no líquido N₂ e armazenado a-80 ° C para uso futuro.

3. eletroforese

1. Aqueça os lysates em um bloco de calor a 95 ° C ou em água fervendo por 5 min.
2. Electrophorese 1-40 µ l dos lysates (contendo 500 até 20.000 equivalentes de célula) através do gel de SDS-PAGE em 100V usando protocolos padrão¹⁰.
   Nota: O volume de lisado carregado no gel é determinado pelo número de células necessárias para gerar o sinal desejável e dependerá da abundância da proteína de interesse e a qualidade do anticorpo. Os dados na Figura 1 foram obtidos com 2.000, 1.000 e 500 equivalentes de célula de lisado. A largura do poço deve ser na faixa de 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm, os dentes podem ser cortada de um pente comercialmente disponível com dentes mais amplas, com uma tesoura.

4. transferência e bloquear

Nota: Realize um Western blot seguindo protocolos padrão¹¹. As etapas são brevemente descritas aqui:

1. Pré-tratamento de uma membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno com metanol para 10 s, em seguida, lave a membrana brevemente com água destilada.
2. Transferi a proteína do gel SDS-PAGE para a membrana, seguindo as instruções do manual fornecido pelo fabricante do aparelho de transferência.
3. Após transferência, bloquear a membrana com 2 mL de 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBST (PBS com 0.1% Tween) durante a noite a 4 ° C, seguindo protocolos padrão¹¹.

5. anticorpo rotulagem

1. Incube a membrana com anticorpos num agitador durante a noite a 4 ° C, que usando diluições de anticorpo recomendadas pelo vendedor.
   Nota: A tabela de materiais, os anticorpos, que nós validados para linfócitos e HPs e as diluições de anticorpos correspondentes, são mostrados. Execute o anticorpo rotulagem usando procedimentos padrão⁸.

6. detecção

1. Lave a membrana 3 vezes, 5 min para cada lavagem em PBST à temperatura ambiente.
2. Incube a membrana com 2 mL de tampão de quimioluminescência reforçada por 1 min à temperatura ambiente. Detecta os sinais usando um sistema de imagem seguindo instruções, do fabricante ou filme autoradiografia e processador da película.

Resultados

Resultados representativos de 500-2.000 purificada linfócitos e HPs são mostrados na Figura 1 e Figura 2. O sinal de β-actina na Figura 1 pode ser detectado de apenas 500 linfócitos e HPs purificado da medula óssea de um rato. Observe que os lysates de carregamento em poços de 1,5 mm produzido um sinal mais forte de 500 HPs de carregamento em poços de 3,0 mm. A Figura 2

Discussão

Mancha ocidental é uma técnica comum para detecção de proteínas específicas e a ativação das vias de sinalização em tecidos ou células. Através da introdução de pequenos ajustes para um procedimento comumente utilizado, fomos capazes de detectar rotineiramente 15 diferentes proteínas (Tabela de materiais) em 15.000 linfócitos e em alguns casos em até 500 linfócitos. The Most passos críticos no presente protocolo são: 1) com precisão contando as células, 2) minimizando o número de t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis