一种用于小数目造血干细胞的西方印迹协议

摘要

通过对500只造血干细胞或祖细胞进行分析, 优化了标准的西方印迹协议。优化包括仔细处理细胞样本, 限制管道之间的传输, 并直接株溶藻 Laemmli 样本缓冲区中的细胞。

摘要

造血干细胞 (HSCs) 是罕见的细胞, 与小鼠骨髓中仅含有2.5万表型的长期再生 HSCs。对 HSCs (500-1.5万细胞) 的小数目进行了优化, 并适合于对其进行分析。表型 HSCs 纯化, 准确计数, 直接裂解 Laemmli 样品缓冲。用月桂酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 分析了含有等量细胞的裂解物, 并根据标准的西方印迹协议制备并处理了该印迹。使用此协议, 可以对 2000-5000 HSCs 进行例行分析, 在某些情况下, 数据可以从很少500个单元中获得, 而大多数出版物中报告的2万到4万个单元格。本议定书应普遍适用于其他造血细胞, 并能通过标准实验室程序对少量细胞进行常规分析。

引言

造血干细胞 (HSCs) 是自我更新的细胞, 可以引起所有的血血统。它们是骨髓中相对稀少的细胞, 使得生物化学分析变得困难。适合于分析稀有细胞的方法, 如流式细胞术, 对于定量测定细胞表面标记物和胞内蛋白的相对数量非常有用。然而, 细胞内蛋白的分析需要使用细胞通透程序来实现抗体的存取, 而不是所有细胞表面的表位都能存活这些程序^1,2。此外, 在不同的蛋白质亚型或裂解产物之间鉴别的抗体通常不能用于流式细胞术, 因此调查人员仍然依靠西方的印迹进行某些类型的分析。

裂解物细胞的印迹分析是大多数实验室的常规程序。细胞可以在保存细胞表面分子表位的本地条件下纯化, 细胞裂解物随后可以被制备和分析。然而, 用西方印迹对稀有的原代细胞种群中的蛋白质进行分析, 可以要求 euthanizing 大量的动物获得足够的细胞。通过对几个步骤进行小的调整, 传统的西方印迹协议能够检测出相对较小数量的 HSCs (500-1.5万, 取决于感兴趣的蛋白质) 的蛋白质。这些调整包括准确计数细胞, 仔细处理细胞颗粒, 减少细胞间的转移, 以最小化细胞损失, 并株溶藻一个定义数量的细胞与集中加载缓冲包含蛋白酶体和磷酸酶抑制剂。许多发表的报告包括西部污点获得与2万或更多 HSCs^3,4,5,6,7;这个简单的程序将减少在4到40倍之间产生等效数据所需的细胞和实验动物的数量。该协议旨在以每个单元为基础对结果进行规范化, 而不是内部控制。这使得检测蛋白质水平的全面降低, 如果数据被规范化到内部控制, 可以忽略。本文描述了在细胞基础上规范化的重要性, 用于分析基因表达数据⁸, 同样的原理也适用于用西方印迹来定量蛋白质。此优化的协议对于需要分析少量单元格的任何人都是有用的。

研究方案

所有程序必须按照机构动物使用和护理指南执行。该程序是为分析小鼠造血干细胞和祖细胞 (HSCs 和高压), 但可以适应其他细胞群体的分析而制定的。

1. 流式细胞仪分离小鼠 HSCs 和高压的研究

1. 收获小鼠骨髓细胞如描述在文献⁶。
   注: 在图 1和图 2所示的数据中, 骨髓是从 C57BL/6J 小鼠身上采集的。
2. 按照制造商的说明, 使用鼠标沿袭损耗套件执行骨髓细胞的血统耗尽。
3. 用抗体对细胞表面的标记进行孵化, 如⁷所述。在图 1和图 2所示的实验中, 使用了对 Sca-1、试剂盒、Flt3 和沿袭 (林) 标记 Mac1、Gr1、CD3e、B220 和 Ter119 的抗体。
4. 排序 2000-2万林 Sca1⁺Flt3 细胞 (HSCs ) 或林^-Sca1 试剂盒⁺细胞(hp) 1.5 毫升离心管含有0.1 毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与2% 胎牛血清。
   注意: 对于图 1和图 2所示的数据, 细胞使用了一个带有70µM 喷嘴的流式分析仪进行排序。最大采集量为1.4 毫升。

2. 样品准备

注意: 此步骤非常关键。仔细处理样品。清除上清液时, 要小心不要扰乱细胞颗粒。

1. 离心机的1.5 毫升管包含排序的细胞在摆动斗转子在4°c, 500 x g, 5 分钟. 用吸管和100µL 吸管提示从细胞颗粒中取出所有但大约20µL。不要扰乱球团。
   1. 如果样品包含少于5000个细胞, 并且被排序的样品的总容量少于0.2 毫升, 转移细胞首先到低捆绑0.2 毫升 PCR 管在离心之前。
   2. 如果样品包含少于5000个细胞和容量是超过0.2 毫升, 用离心机在4°c, 500 x g, 为5分钟旋转细胞下来, 并且去除所有, 但200µL 的上清。再将剩余的200µL 中的颗粒细胞重新悬浮, 然后将细胞转移到0.2 毫升的 PCR 管中, 再次旋转。在第二次旋转后从颗粒中除去 20-30 µL, 然后重新悬浮细胞。
2. 并用重悬在试管中左上清的细胞。如有必要, 添加额外的 PBS 在2% 的血清/pbs (你也可以使用2% 牛血清白蛋白 (BSA)/pbs, 或 pbs 单独) 获得浓度 5 x10⁴至 5 x 10 细胞/毫升。
   注: 使用细胞计数法收集, 以估计用于悬浮细胞的体积。
3. 使用 2-5 µL 的重新悬浮细胞, 以确定准确的细胞浓度使用自动单元计数器 (按照制造商的指示) 或 hemocytometer⁹。
4. 将含有所需细胞数的重悬浮细胞转移到新的1.5 毫升管中。在图 1, 2000, 1000, 或 500 HSCs 或高压的实验被转移了。所需的细胞数取决于由西方印迹获得的信号的强度, 并根据经验确定。使用20µL 或100µL 离心吸管提示进行转移。
5. 离心机在摆动斗转子中的细胞在4°c, 500 x g, 5 分钟。
6. 根据制造商的指示, 生成100x 库存解决方案, 在亚砜中溶解蛋白酶体和磷酸酶抑制剂。
7. 通过稀释制造商提供的相当于蒸馏水的 4x Laemmli 样品缓冲器, 准备 2x Laemmli 样品缓冲器。添加适量的100x 股蛋白酶体和磷酸酶抑制剂, 以获得最终浓度2x 抑制剂在 2x Laemmli 样本缓冲区。
   注: 2x Laemmli 样本缓冲区可以提前进行, 但蛋白酶体和磷酸酶抑制剂应立即添加, 然后添加 2x Laemmli 样本缓冲区 (加上抑制剂) 的细胞颗粒溶解细胞, 如以下步骤所述。
8. 小心地从细胞颗粒中取出部分清液, 并将其与试管中剩余的上清液结合在一起, 添加等量的 2x Laemmli 样品缓冲器加上蛋白酶体和磷酸酶抑制剂以达到500的最终浓度。单元格/µL 在 1x Laemmli 示例缓冲区中。
   注意: 例如, 如果您在步骤2.5 中将2000个单元的总体积20µL 转移到一个管, 则在离心单元格 (步骤 2.6) 后, 应从颗粒中移除上清的18µL, 并将剩余的上清的2个µL 添加相等容积 (2 µL) 2x Laemmli 样品缓冲器, 以达到500细胞/µL 在 1x Laemmli 样品缓冲器中的最终浓度。
9. 并用重悬颗粒以尽快生成裂解液。在这一点上, 样品可以立即电泳通过 SDS 页凝胶, 或可在液体 N₂冻结, 并存储在-80 °c, 以供将来使用。

3. 电泳

1. 将裂解物在95摄氏度或沸水中加热5分钟。
2. Electrophorese 1-40 µL 的裂解物 (包含从500高达2万细胞当量) 通过 SDS 页凝胶在100V 使用标准协议¹⁰。
   注: 在凝胶中装入的裂解液体积是由产生理想信号所需的细胞数决定的, 并取决于感兴趣的蛋白质的丰度和抗体的质量。图 1中的数据获得了2000、1000和500个细胞当量的裂解物。井的宽度应该在3毫米到1.5 毫米的范围内. 1.5 毫米的牙齿可以用剪刀从商业可用的梳子上剪下来。

4. 转移和阻止

注: 执行¹¹标准协议后的西方污点。下面简要介绍了这些步骤:

1. 预处理氟 (PVDF) 膜与甲醇十年代, 然后简要地洗涤膜与蒸馏水。
2. 按照转移器具制造商提供的说明书中的说明, 将蛋白质从 SDS 页凝胶转移到膜上。
3. 转移后, 2 毫升5% 牛血清白蛋白 (BSA) 在 PBST (PBS 与0.1% 补体) 一夜间在4摄氏度以下标准协议¹¹。

5. 抗体标记

1. 使用供应商推荐的抗体稀释, 在4摄氏度的情况下, 用抗体在一夜床上孵育细胞膜。
   注: 在材料表中, 我们对 HSCs 和高压的抗体以及相应的抗体稀释进行了验证。使用标准程序执行抗体标记⁸。

6. 检测

1. 清洗膜3次, 每 PBST 5 分钟室温下清洗。
2. 室温下用2毫升增强化学发光缓冲剂孵化膜1分钟。根据制造商的说明或显影胶片和胶片处理器, 使用成像系统检测信号。

结果

500-2000 纯化 HSCs 和高压钠灯的代表性结果如图 1和图 2所示。图 1中的β肌动蛋白信号可以从从一只老鼠的骨髓中纯化出来的 500 HSCs 和高压钠灯中检测出来。请注意, 将裂解物装入1.5 毫米井, 产生了比加载到3.0 毫米井更强的500高压信号。图 2是 EIF4G 的西方印迹和 Rps6 (p-Rps6) 的磷酸化, ?...

讨论

西方印迹是一种常见的技术检测特定的蛋白质和激活信号通路的组织或细胞。通过对通常使用的程序进行小的调整, 我们能够例行地检测15种不同的蛋白质 (材料表), 在 1.5万 HSCs, 在某些情况下, 在 500 HSCs。该协议中最关键的步骤是: 1) 精确计数单元格, 2) 最小化管之间的传输数, 3) 株溶藻单元格直接与 Laemmli 样本缓冲区。当株溶藻的细胞颗粒与 Laemmli 样品缓冲, 我们发现, 而不是删除所有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis