Западных Blotting протокол для небольшого числа гемопоэтических стволовых клеток

Резюме

Стандартный западной blotting протокол был оптимизирован для анализа всего лишь 500 гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. Оптимизация предполагает тщательной обработки ячейки выборки, ограничивая передачу между трубами и непосредственно лизировать клетки в буфер Лэмли образца.

Аннотация

Гемопоэтических стволовых клеток (СКК) являются редкие клетки, с костного мозга мыши, содержащие только ~ 25000 фенотипические долго срок заселив СКК. Западный blotting протокол был оптимизирован и подходит для анализа небольшого числа СКК (500-15 000 клеток). Фенотипические СКК были очищенный, точно подсчитать и непосредственно лизированы в буфер Лэмли образца. Лизатов, содержащие одинаковое количество клеток были проанализированы электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE), и пятно был подготовлен и обрабатываются следующие стандартные западной blotting протоколы. Используя этот протокол, 2000-5000 СКК может регулярно анализируются, и в некоторых случаях данные могут быть получены от всего лишь 500 клеток, по сравнению с 20 000 до 40 000 ячеек, сообщили в большинстве публикаций. Этот протокол должен быть в целом применимы для других гемопоэтических клеток и позволяет рутинной анализа небольшого числа клеток с использованием стандартных лабораторных процедур.

Введение

Гемопоэтические стволовые клетки (СКК) являются самостоятельной возобновление клетки, которые могут привести к крови всех линий. Они являются относительно редкими клеток в костном мозге, затрудняя биохимические анализы. Подходы для анализа редких клеток, таких как проточной цитометрии, оказались чрезвычайно полезными для количественной оценки относительное количество клеток поверхностных маркеров и внутриклеточные белки. Однако анализ внутриклеточных белков требует использования клеток permeabilization процедуры для включения доступа антитела, и не все клетки epitopes поверхности выжить эти процедуры^1,2. Кроме того антитела, которые дискриминацию между различными белками изоформ или расщепления продуктов не часто доступны для проточной цитометрии, и поэтому следователи по-прежнему полагаться на западных помарках для определенных видов анализа.

Вестерн-блот анализ lysates клетки является обычной процедурой в большинстве лабораторий. Клетки могут быть очищены в родной условиях, которые сохраняют epitopes клеток поверхности молекул, и lysates клетки впоследствии могут быть подготовлены и проанализированы. Однако может потребовать анализ белков в редких первичной ячейке населения западной помарки, euthanizing большое количество животных, чтобы получить достаточное количество клеток. Делая небольшие изменения в несколько шагов, обычных западных blotting протокол смог обнаружить белков в относительно небольшом количестве СКК (500-15 000, в зависимости от протеина интереса). Корректировки включают точного подсчета клеток, тщательно обработки клеток Пелле, сокращение передачи ячеек между трубы к минимуму потери клеток, и лизировать определенное количество клеток с концентрированной нагрузки буфера содержащие протеасом и битор фосфатазы. Многие опубликованные отчеты включают в себя западные помарки, полученные с 20 000 или более СКК^3,4,5,6,7; Эта простая процедура позволит сократить количество клеток и экспериментальных животных, необходимых для производства эквивалентных данных между 4 и 40 раз. Протокол призван нормализовать результаты на основе в ячейке, а не для внутреннего контроля. Это позволяет обнаружение общего сокращения уровня белков, которые могут быть пропущены, если данные нормализованы внутреннего контроля. Важность нормализации на основе в ячейку был описан для анализа данных выражение гена⁸, и тот же принцип применяется для количественной оценки белков на западную помарку. Это оптимизированный протокол должны быть полезны для тех, кто нужно анализировать небольшое количество клеток.

протокол

Все процедуры должны выполняться в соответствии с институциональной использование животных и ухода за руководящие принципы. Эта процедура была разработана для анализа мышиных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (СКК и ГЭС), но может быть адаптирована для анализа других клеточных популяций.

1. поток цитометрии изоляции мышиных СКК и ГЭС

1. Урожай клеток костного мозга мышиных, как описано в литературе⁶.
   Примечание: Данные представлены на рисунке 1 и на рисунке 2, костного было собрано от мышей C57BL/6J.
2. Выполняйте истощение линии клеток костного мозга с помощью мыши линии истощения kit, следуя инструкциям производителя.
3. Инкубируйте клетки с антителами против клеток поверхностных маркеров, представляющих интерес как описано⁷. В экспериментах показано на рис.1 и рис.2используются антител к Sca-1, комплект, Flt3 и маркеров родословной (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 и Ter119.
4. Сортировать 2000-20000 Лин^– Sca1⁺⁺ Flt3 Kit^– клетки (СКК) или Линь^–Sca1^–клетки (HPs) Комплект⁺ в 1,5 мл Eppendorf пробирки, содержащие 0,1 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS) с 2% плода говядину сыворотка (ФБС).
   Примечание: Для данных показано на рисунке 1 и на рисунке 2, клетки были отсортированы с помощью потока цитометр с насадкой 70 мкм. Максимальная коллекции объем составляет 1.4 мл.

2. Пробоподготовка

Примечание: Этот шаг очень важен. Процесс образец очень тщательно. При удалении супернатанта, будьте очень осторожны, чтобы не нарушить Пелле ячейки.

1. 1,5 мл пробирок содержащий отсортированный клетки в размахивая ведро ротора при температуре 4 ° C, 500 x g, для 5 минут удалить все, но примерно 100 мкл супернатант из ячейки окатышей, очень аккуратно с помощью пипетки и 20 мкл наконечник пипетки. Не беспокоить гранулы.
   1. Если образец содержит менее 5000 клетки, и общий объем отсортированных образца составляет менее 0,2 мл, передать клетки сначала низкой привязки 0.2 мл ПЦР трубы перед центрифугированием.
   2. Если образец содержит менее 5000 клетки и объём более 0,2 мл, спина клетки вниз с центрифуги на 4 ° C, 500 x g, при 5 мин и удалите все, кроме 200 мкл супернатант. Вновь приостановить гранулированных ячейки в остальные 200 мкл супернатанта, а затем передать 0.2 мл ПЦР пробирок клетки и спин вниз снова. Удалите все но 20-30 мкл из гранул после второго отжима и вновь приостановить клетки.
2. Ресуспензируйте клетки в левом супернатант в трубе. При необходимости добавьте дополнительные PBS в 2% FBS/PBS (вы можете также использовать 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) / PBS, или PBS только) для получения концентрации 5 x10⁴ -5 x 10⁵ кл/мл.
   Примечание: Использование клеток собранные цитометрии для оценки объема используется для приостановки клетки.
3. Используйте 2-5 мкл вновь приостановлено клеток для определения концентрации Точная ячейки, используя счетчик автоматизированных клеток (следуя инструкциям производителя) или Горяева⁹.
4. Передача объем вновь приостановлено клетки, содержащие требуемое количество клеток для новых 1.5 мл пробирок. Для эксперимента на рисунке 12000, 1000, 500 СКК или HPs были переведены. Требуемое количество клеток зависит от силы сигнала, полученные Западная помарка и определяется эмпирически. Выполните передачу с помощью 20 мкл или 100 мкл Eppendorf наконечник пипетки.
5. Центрифуга для ячеек в размахивая ведро ротора на 4 ° C, 500 x g, 5 мин.
6. Для создания 100 x акций решения, Растворите ингибиторы протеасом и фосфатазы в ДМСО согласно инструкциям производителя.
7. Готовить 2 буфер образца x Laemmli путем разбавления 4 x Laemmli образца буфер, предоставленный изготовителем с эквивалентное количество дистиллированной воды. Добавьте необходимое количество акций 100 x протеасом и фосфатазы ингибиторов для получения окончательного концентрацию ингибиторов 2 x 2 x Laemmli пример буфера.
   Примечание: 2 буфер образца x Laemmli могут быть сделаны заранее, но протеасом и фосфатазы ингибиторы должны быть добавлены непосредственно перед добавлением 2 x Laemmli буфер образца (плюс ингибиторы) клетки Пелле Лизируйте клетки, как описано в следующем шаге.
8. Тщательно удалить часть супернатант из клеток Пелле и супернатанта, оставшиеся в трубку с Пелле клеток, добавить равное количество 2 буфер образца x Laemmli плюс протеасом и фосфатазы ингибиторов для достижения конечной концентрации 500 клеток/мкл в 1 буфер образца x Laemmli.
   Примечание: К примеру, если вы переводите 2000 клеток в общем объеме 20 мкл трубку в шаг 2.5, после центрифугирования клетки (шаг 2.6) 18 мкл супернатант следует удалить из Пелле и 2 мкл супернатанта, остается добавьте равным объемом (2 мкл) 2 x буфер Лэмли образца для достижения конечной концентрации 500 клеток/мкл в 1 буфер образца x Laemmli.
9. Ресуспензируйте гранулы для создания lysate как можно скорее. На данный момент образцы могут быть немедленно electrophoresed через гелях SDS-PAGE, или может быть оснастки, замороженные в жидкости N₂ и температуре-80 ° C для использования в будущем.

3. электрофорез

1. Тепло лизатов в блоке тепла на 95 ° C или в кипящей воде в течение 5 мин.
2. Electrophorese 1-40 мкл лизатов (содержащие от 500 до 20 000 клеток эквиваленты) через гелях SDS-PAGE на 100V с использованием стандартных протоколов¹⁰.
   Примечание: Объем lysate загружается в гель определяется количество клеток, необходимых для создания желаемого сигнала и будет зависеть от обилием протеина интереса и качество антитела. С 2000, 1000 и 500 клеток эквиваленты lysate получены данные на рисунке 1 . Ширина скважины должны быть в диапазоне от 3 мм до 1,5 мм. 1,5 мм, зубы могут быть сокращены от коммерчески доступных гребень с широкой зубов с помощью ножниц.

4. Передача и блокировать

Примечание: Выполните следующие стандартные протоколы¹¹западную помарку. Здесь кратко изложены шаги:

1. Предварительной обработки винилидена фторид (PVDF) мембрану с метанолом, для 10 s, а затем вымыть мембраны кратко с дистиллированной водой.
2. Передать белка из геля SDS-PAGE мембраны следуя инструкциям в руководстве, предоставляемых производителем аппарата передачи.
3. После передачи, блокировать мембраны с 2 мл 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBST (PBS с 0.1% анимации) на ночь при 4 ° C, после¹¹стандартных протоколов.

5. антитела маркировки

1. Проинкубируйте мембрану с антител на шейкер на ночь при 4 ° C, с помощью разбавления антитела, рекомендованный поставщик.
   Примечание: В таблице материалов, антитела, которые мы проверены для СКК и ГЭС и соответствующих разведений антитела, показаны. Выполните антитела маркировки с помощью стандартных процедур⁸.

6. определение

1. Промойте мембрану 3 раза, 5 минут для каждого мытья в PBST при комнатной температуре.
2. Проинкубируйте мембрану с 2 мл увеличенная хемолюминесценция буфера 1 мин при комнатной температуре. Обнаруживать сигналы, с помощью изображений системы после инструкции, или авторадиографии фильм и фильм процессор производителя.

Результаты

Представитель результаты от 500-2000 очищенный СКК и ГЭС показаны на рисунке 1 и на рисунке 2. Β-актина сигнал на рисунке 1 можно обнаружить от всего лишь 500 СКК и ГЭС очищенного от костного мозга одним нажатием. Обратите внима?...

Обсуждение

Западный Blotting — это общий метод для обнаружения специфических белков и активации сигнальных путей в ткани или клетки. Путем внесения небольших изменений в часто используемые процедуры, мы смогли регулярно обнаружить 15 различных белков (Таблица материалов) в 15000 СКК и в некото?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis