조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

요약

프로토콜 blotting 표준 서 500 조 혈 줄기 또는 조상 세포로 몇 가지 분석을 위해 최적화 되었다. 최적화 포함 셀 샘플의 처리, 튜브, 사이 전송 제한 및 직접 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 lysing 주의 한다.

초록

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 드문 셀, 오래만 25000 ~ phenotypic 포함 된 마우스 골 수와 함께 다시 채우기 HSCs 용어. 서쪽 더 럽 히 프로토콜 최적화 되었고 HSCs (500-15000 셀)의 작은 숫자의 분석에 적합 합니다. Phenotypic HSCs 정화, 정확 하 게 계산, 고 직접 Laemmli 샘플 버퍼에서 lysed. Lysates 셀의 동등한 숫자를 포함 하는 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석 되었다 오 점 준비 하 고 더럽혀 프로토콜 표준 서에 따라 처리. 이 프로토콜, 2000-5000를 사용 하 여 HSCs는 정기적으로 분석 될 수 있다, 그리고 어떤 경우에 데이터는 몇 가지 대부분의 출판물에 20000 ~ 40, 000 셀에 비해 500 셀으로에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 다른 조 혈 모 세포에 일반적으로 적용 되 고 표준 실험실 절차를 사용 하 여 셀의 작은 숫자의 일상적인 분석을 수 있습니다.

서문

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 모든 혈액 계보를 야기할 수 있는 각자 경신 세포 이다. 그들은 생 화 확 적인 분석을 어려운 렌더링 골 수에서 비교적 드문 셀입니다. 접근 cytometry, 같은 희귀 세포 분석을 위한 적합 한 세포 표면 마커 및 세포내 단백질의 상대적인 양을 측정 하는 데 매우 유용 했습니다. 그러나, 항 체 접근을 사용 하 셀 permeabilization 절차의 사용을 필요로 하는 세포내 단백질의 분석 하 고 모든 세포 표면 epitopes 살아이 절차^1,2. 또한, 다른 단백질 isoforms 또는 분열 제품을 구분 하는 항 체는 종종 cytometry, 사용할 수 없습니다 그리고 그러므로 조사 여전히 의존 서쪽 오 점 특정 유형의 분석.

세포 lysates의 서쪽 오 점 분석은 대부분 실험실에서 일상적인 절차입니다. 세포 세포 표면 분자의 epitopes를 유지 하는 기본 조건에서 순화 될 수 있다 그리고 세포 lysates 수 이후에 준비 하 고 분석 했다. 그러나, 서쪽에 의해 인구 오 점 드문 기본 셀에 단백질의 분석 euthanizing 충분 한 세포를 얻기 위해 동물의 많은 수를 요구할 수 있습니다. 여러 단계로 작은 조정 함으로써, 기존의 서쪽 더 럽 히 프로토콜 HSCs (관심사의 단백질에 따라 500-15000)의 상대적으로 작은 숫자에 단백질을 감지할 수 있었습니다. 조정 포함 셀, 셀 손실 최소화 하기 위해 튜브 사이 세포의 전송을 감소 셀 펠 릿을 신중 하 게 처리를 정확 하 게 계산 하 고 포함 프로테아좀 버퍼 lysing 집중 로드 셀의 정의 수 고 인산 가수분해 효소 억제제입니다. 많은 게시 된 보고서 포함 20000 이상의 HSCs^3,,45,6,7; 얻은 서쪽 오 점 이 간단한 절차는 세포와 실험 동물 4와 40 배 사이 해당 데이터를 생성 하는 데 필요한 수를 줄일 것입니다. 프로토콜은 결과 셀 당 기준 보다는 내부 통제를 정상화 하도록 설계 되었습니다. 내부 컨트롤에 데이터 정규화는 간과 될 수 있는 단백질 수준에서 전반적인 감소의 검색 수 있습니다. 셀 당 기준 표준화의 중요성 유전자 표현 데이터⁸의 분석에 대 한 설명 했다 그리고 동일한 원리 서쪽 오 점 하 여 단백질을 측정에 적용 됩니다. 이 최적화 된 프로토콜은 세포의 작은 숫자를 분석할 필요가 누군가 위해 유용 해야 한다.

프로토콜

모든 절차는 기관 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행 되어야 합니다. 절차 murine 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSCs, HPs)의 분석을 위해 개발 되었다 그러나 다른 세포 인구의 분석을 위해 적응 시킬 수 있다.

1. 교류 Cytometry 절연 Murine HSCs 및 HPs의

1. 문학⁶에 설명 된 대로 murine 골 수 세포를 수확.
   참고: 그림 1 과 그림 2에 표시 하는 데이터에 골 C57BL/6J 쥐에서 수확 했다.
2. 제조업체의 지침에 따라 마우스 리니지 고갈 키트를 사용 하 여 골 수 세포의 계보 소모를 수행 합니다.
3. 설명⁷에 대 한 관심의 세포 표면 마커 항 체와 세포를 품 어. 그림 1 과 그림 2에 나와 실험에서 Sca 1, 키트, Flt3, 및 계보 (Lin) 마커 Mac1, Gr1, CD3e, B220, 그리고 Ter119 항 체 사용 됩니다.
4. 정렬 2000-20000 린^- Sca1⁺⁺ Flt3 키트^- 세포 (HSCs) 또는 Lin^-Sca1^-키트⁺ 셀 (HPs) 0.1 mL의 인산 염을 포함 하는 1.5 mL Eppendorf 관에 버퍼링 2% 태아 소와 염 분 (PBS) 혈 청 (FBS)입니다.
   참고: 그림 1 과 그림 2에 표시 된 데이터에 대 한 셀은 정렬 Flow Cytometer 70 µ M 노즐을 사용 하 여. 최대 컬렉션 볼륨 1.4 mL 이다입니다.

2. 샘플 준비

참고:이 단계는 중요 한. 샘플을 매우 신중 하 게 처리 합니다. 제거는 상쾌한, 될 매우 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.

1. 원심 분리기는 1.5 mL 튜브 4 ° C에서 진동 물통 회전자에서 정렬된 셀을 포함, 500 x g 5 셀에서 상쾌한의 약 100 µ L 제외한 모든 분 제거에 대 한 매우 부드럽게 사용 하는 피 펫 20 µ L 피펫으로 팁 작은. 펠 릿을 방해 하지 마십시오.
   1. 샘플 미만 5, 000 셀이 포함 하는 경우 정렬 된 샘플의 총 볼륨은 0.2 mL 미만 전송 셀 먼저 낮은 바인딩 0.2 mL PCR 튜브 원심 분리 하기 전에.
   2. 샘플 포함 된 경우 5, 000 개 미만의 세포 볼륨은 0.2 mL 이상, 5 분, 4 ° C, 500 x g에서 원심 분리기와 셀 아래로 회전 하 고는 상쾌한의 200 µ L를 제외한 모든 제거. 수송과 셀 상쾌한, 나머지 200 µ L에 다시 중단 다음 0.2 mL PCR 튜브에 세포를 전송 하 고 다시 아래로 회전. 두 번째 스핀 후 펠 릿에서 모든 하지만 20-30 µ L을 제거 하 고 다시 셀을 일시 중단.
2. 튜브에서 표면에 뜨는 왼쪽에 셀 resuspend 필요한 경우, 추가 추가 PBS 2 %FBS에서 / PBS (또한 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 / PBS, 또는 혼자 PBS) 농도 5를 x10⁴ 5 x 10⁵ 셀/mL.
   참고: 셀 계산 사용 cytometry 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 볼륨을 추정 하 여 수집.
3. 다시 일시 중단 된 셀의 2-5 µ L를 사용 하 여 (제조업체의 지침에 따라) 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer⁹를 사용 하 여 정확한 셀 농도 결정.
4. 다시 일시 중단 된 셀 원하는 새로운 1.5 mL 튜브에 세포 수를 포함 하는 볼륨을 전송. 그림1에서 실험, 2000, 1000, 500 HSCs 또는 HPs 전송 했다. 원하는 셀 수는 서쪽 오 점 하 여 얻은 신호 강도 의존 하 고 경험적으로 결정 됩니다. 20 µ L 또는 100 µ L Eppendorf 피 펫 팁을 사용 하 여 전송을 수행 합니다.
5. 5 분 500 x g, 4 ° C에서 진동 물통 회전자에 셀 원심
6. 재고 솔루션 x 100을 생성 하려면 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제를 분해.
7. 증류수의 상응 하는 금액으로는 제조업체에서 제공 하는 4 x Laemmli 샘플 버퍼를 diluting 하 여 2 x Laemmli 샘플 버퍼를 준비 합니다. 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제 2 x Laemmli 샘플 버퍼에 2 x 억제제의 최종 농도를 100 배 재고의 적절 한 금액을 추가 합니다.
   참고: 2 x Laemmli 샘플 버퍼는 사전에 만들 수 있습니다 하지만 프로테아좀 및 인산 가수분해 효소 억제제 다음 단계에 설명 된 대로 2 x Laemmli 샘플 버퍼 (더하기 억제제) 셀 펠 릿에는 세포를 lyse 추가 직전 추가 되어야 합니다.
8. 조심 스럽게 셀 펠 릿에서 그리고 셀 펠 릿으로 튜브에 남아 상쾌한은 상쾌한의 일부를 제거, 2 x Laemmli 샘플 버퍼 플러스 500의 최종 농도 달성 하기 위해 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제의 동일한 볼륨 추가 셀/1 x Laemmli 샘플 버퍼에 µ l
   참고: 예를 들어 셀 (단계 2.6) 펠 릿에서 상쾌한의 18 µ L를 제거 해야 centrifuging 후 단계 2.5에서 튜브와 남아 상쾌한의 2 µ L 2000 셀 20 µ L의 전체 볼륨에 전송 하는 경우 추가의 동일한 볼륨 (2 µ L) 1 x Laemmli 샘플 버퍼에 500 세포 / µ L의 최종 농도 달성 하기 위해 Laemmli 샘플 버퍼 x 2.
9. 최대한 빨리 lysate를 생성 하는 펠 릿 resuspend 이 시점에서, 샘플을 즉시 SDS 페이지 젤를 통해 electrophoresed 수 또는 스냅 액체 N₂ 에서 냉동 고 수 미래 사용을 위한-80 ° C에 저장.

3입니다. 전기 이동 법

1. 95 ° C에서 열 블록 또는 끓는 물에 5 분 동안 lysates 열.
2. SDS 페이지 젤 100V에서 표준 프로토콜¹⁰를 사용 하 여 통해 (20000 셀 해당 최대 500에서 포함) lysates의 1-40 µ L를 electrophorese.
   참고: 젤으로 로드 lysate의 볼륨 바람직한 신호를 생성 하는 데 필요한 셀의 수에 의해 결정 되 고 관심, 그리고 항 체의 품질의 단백질의 풍부에 따라 달라 집니다. 그림 1에서 데이터 2000, 1000, 500 셀 등가물 lysate의 획득 했다. 우물의 폭 3 m m에 1.5 m m. 치아 수는 1.5 m m의 범위에 잘려야 한다 상용 빗에서가 위를 사용 하 여 넓은 이빨을 가진.

4. 전송 및 차단

참고: 서쪽 오 점 표준 프로토콜¹¹다음을 수행 합니다. 단계는 간단히 여기에 설명 된:

1. 10 s, 다음 씻어 짧게 막으로 증류수에 대 한 메탄올을 가진 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인을 pretreat.
2. SDS 페이지 젤에서 전송 장치 제조업체에서 제공 하는 설명서의 지침에 따라 막 단백질을 전송.
3. 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 PBST의 2 개 mL를 막 차단 전송, 다음 (0.1 %PBS 트윈) 표준 프로토콜¹¹다음 4 ° C에서 하룻밤.

5. 항 체 라벨

1. 공급 업체에서 권장 하는 항 체 희석을 사용 하 여 4 ° C에서 하룻밤 통에 항 체를 막 품 어.
   참고: 재료의 테이블에서 항 체, 우리 HSCs HPs와 해당 항 체 희석에 대 한 확인 한, 표시 됩니다. 항 체 라벨 표준 절차⁸를 사용 하 여 수행 합니다.

6입니다. 감지

1. 씻고 막 3 시간, 실 온에서 PBST에 각 세척에 대 일 분.
2. 실 온에서 1 분에 대 한 향상 된 화학 버퍼의 2 개 mL를 막 품 어. 다음 제조업체의 지침, 또는 autoradiography 필름과 필름 프로세서 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.

결과

500-2000 순화 HSCs와 HPs에서 대표적인 결과 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다. 그림 1 에서 β-말라 신호에서 몇 가지 500 HSCs로 검출 될 수 있다 고 HPs 한 마우스의 골 수에서 정화. Note는 3.0 m m 우물에 로드 보다 500 HPs에서 훨씬 더 강력한 신호 생산 로드는 lysates 1.5 m m 우물. 그림 2 은 EIF4G의 ...

토론

서 부 럽 조직 또는 세포에 특정 단백질 및 신호 통로의 활성화를 탐지 하기 위한 일반적인 기술입니다. 작은 조정에 일반적으로 사용 되는 절차를 도입 하 여 정기적으로 15000 HSCs, 그리고 경우에 따라 몇 가지로 500 HSCs 15 다른 단백질 (자료 테이블)을 감지할 수 있었습니다. The most이 프로토콜의 중요 한 단계는: 1) 정확 하 게 계산 셀, 2) 튜브, 사이 전송의 수를 최소화 및 3) lysing Laemmli ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis