מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Summary

מערבון רגיל סופג פרוטוקול היה אופטימיזציה עבור ניתוח גם 500 hematopoietic גזע או ובתאים בהיקף. אופטימיזציה כרוך זהיר טיפול המדגם תא, הגבלת העברות בין צינורות ו ישירות lysing התאים במאגר מדגם Laemmli.

Abstract

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים נדירה, עם מח העצם העכבר המכיל רק ~ 25,000 פנוטיפי ארוך המונח לאכלס מחדש HSCs. פרוטוקול blotting המערבי היה ממוטבת ומתאים הניתוח של מספר קטן של HSCs (500-15,000 תאים). HSCs פנוטיפי מטוהרים, לספור במדויק, ולא ישירות lysed במאגר מדגם Laemmli. Lysates המכיל מספר שווה של תאים נותחו על ידי נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), האבן החשופה היה מוכן ומעובד בעקבות מערבי רגיל סופג פרוטוקולים. באמצעות פרוטוקול זה, $2,000-5,000 HSCs ניתן לנתח באופן שגרתי, במקרים מסוימים נתונים ניתן להשיג גם 500 תאים, לעומת התאים 20,000 עד 40,000 דיווחו רוב הפרסומים בהיקף. פרוטוקול זה צריך להיות חלים באופן כללי לתאים אחרים hematopoietic, המאפשרת ניתוח שגרתי של מספר קטן של תאים באמצעות הליכים מעבדה סטנדרטיים.

Introduction

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים עצמי המתחדש יכולים להצמיח כל דם שושלות. הם נדירים יחסית תאים במח העצם, עיבוד ביוכימי ניתוחים קשים. גישות מתאימים לניתוח תאים נדירים, כמו cytometry זרימה, היה מאוד שימושי עבור לכימות כמויות יחסיות של סמני פני שטח התא, חלבונים תאיים. עם זאת, הניתוח של חלבונים תאיים מחייבת את השימוש בטכניקות permeabilization תא כדי לאפשר גישה נוגדן, ולשרוד לא כל epitopes משטח תאים אלה הליכים^1,2. בנוסף, נוגדנים מפלים בין מוצרי איזופורמים או ביקוע חלבונים שונים לעיתים קרובות אינם זמינים עבור cytometry זרימה, ולכן החוקרים עדיין מסתמכים על שהכלים המערבי בוודאות סוגים של ניתוחים.

תספיג חלבון ניתוח של תא lysates הוא הליך שגרתי במעבדות רוב. התאים יכולים להיטהר בתנאים מקומיים המשמרים את epitopes של מולקולות על פני התא, תא lysates לאחר מכן ניתן להכין, מנותח. עם זאת, הניתוח של חלבונים בתא יסודי נדיר אוכלוסיות על-ידי המערב כתם תוכל לדרוש המתות חסד מספרים גדולים של בעלי חיים כדי להשיג מספיק תאים. על ידי ביצוע שינויים קטנים במספר שלבים, פרוטוקול blotting המערבית המקובלת היה מסוגל לזהות חלבונים מספר קטן יחסית של HSCs (500-15,000, בהתאם החלבון עניין). ההתאמות כוללים במדויק ספירת תאי, בזהירות הטיפול בגדר תא, הפחתת העברות של תאים בין צינורות כדי למזער את אובדן התא, ו lysing מספר מוגדר של תאים עם טעינה מרוכז מאגר המכיל פרוטאוזום ו מעכבי פוספטאז. דיווחים שפורסמו רבים כוללים שהכלים המערבי שהושג עם 20,000 או יותר HSCs^3,4,5,6,7; נוהל פשוט זה יקטין את מספר התאים ואת חיות ניסוי הדרושה להפקת נתונים שווה ערך לפי בין קיפול 4 ו- 40. הפרוטוקול נועד לנרמל את התוצאות על בסיס לכל תא, במקום של בקרה פנימית. פעולה זו מאפשרת זיהוי של הכללית הפחתות רמות חלבון אשר ניתן להתעלם אם הנתונים הם מנורמל לפקד פנימי. החשיבות של נרמול על בסיס לכל תא תוארה לניתוח של ג'ין ביטוי נתונים⁸, אותו העיקרון חל לכימות חלבונים על ידי תספיג חלבון. פרוטוקול ממוטבת זה צריך להיות שימושי עבור כל מי שזקוק לנתח מספר קטן של תאים.

Protocol

כל ההליכים חייב להתבצע על פי הנחיות טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים. ההליך פותחה עבור הניתוח של מאתר hematopoietic גזע תאים וקדמון (HSCs ו HPs), אך ניתן להתאים לניתוח של אוכלוסיות תאים אחרים.

1. לזרום Cytometry בידוד HSCs מאתר ו HPs

1. קציר תאים במח העצם מאתר כמתואר ב-⁶ספרות.
   הערה: בנתונים המוצגים באיור 1 ו- 2 איור, מח העצם היה נקצרו מ C57BL/6J עכברים.
2. לבצע דלדול שושלת היוחסין של תאים במח העצם באמצעות ערכת דלדול של שושלת היוחסין העכבר ההוראות של היצרן.
3. דגירה התאים עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של התא עניין כמו שמתואר⁷. בניסויים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, הנוגדנים Sca-1, קיט, Flt3 של שושלת (לין) סמנים Mac1 Gr1, CD3e, B220, Ter119 משמשים.
4. למיין 2,000-20,000 לין^– Sca1⁺ערכת⁺ Flt3 תאים^– (HSCs) או לין^–Sca1^–ערכת⁺ תאים (HPs) לתוך צינורות גלאים 1.5 mL המכיל 0.1 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) עם 2% שור עוברית סרום (FBS).
   הערה: עבור הנתונים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, התאים היו מיון באמצעות Cytometer לזרום עם זרבובית 70 מיקרומטר. אמצעי האחסון המרבי אוסף נמצא 1.4 מ.

2. הכנת הדוגמא

הערה: השלב זה קריטי. תהליך הדגימה בזהירות רבה. בעת הסרת את תגובת שיקוע, להיזהר מאוד שלא להפריע בגדר התא.

1. צנטריפוגה 1.5 mL צינורות המכיל תאים ממוינים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, g x 500, עבור 5 דק הסר הכל אלא כ- 100 µL של תגובת שיקוע מהתא הצניפה בעדינות באמצעות פיפטה וטיפ pipet 20 µL. נא לא להפריע בגדר.
   1. אם המדגם מכיל תאים פחות מ-5,000 הנפח הכולל של המדגם ממוינים הוא פחות מ 0.2 מ"ל, להעביר את התאים קודם מחייב נמוכים 0.2 מ"ל המבחנות לפני צנטריפוגה.
   2. אם לדוגמה מכיל תאים פחות מ-5,000 אחסון הוא יותר מ- 0.2 מ"ל, לסובב התאים למטה באמצעות צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות, ולהסיר הכל חוץ µL 200 של תגובת שיקוע. מחדש להשעות את התאים pelleted µL 200 הנותרים של תגובת שיקוע, ולאחר מכן להעביר את התאים המבחנות 0.2 מ"ל, ספין למטה שוב. להסיר µL כל 20-30 אבל בגדר אחרי שהימרת בסיבוב השני והשהה מחדש את התאים.
2. Resuspend לתאים משמאל supernatant בצינור. אם יש צורך, להוסיף PBS נוספים ב- 2% FBS/PBS (ניתן להשתמש גם 2% אלבומין שור (BSA) / PBS, או PBS לבד) בריכוז 5 x10⁴ 5 x 10⁵ תאים/מ ל....
   הערה: שימוש התא נחשב שנאספו על ידי cytometry כדי להעריך את עוצמת הקול משמש להשעות את התאים.
3. להשתמש 2-5 µL של התאים מחדש על תנאי לקביעת ריכוז של התא מדויק באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (בעקבות הוראות היצרן) או hemocytometer⁹.
4. העברת נפח של מתיחה מחדש תאים המכילים מספר תאים צינורות 1.5 mL החדש הרצוי. לניסוי באיור1, הועברו 2,000, 1,000 או 500 HSCs או HPs. מספר התאים הרצוי תלוי עוצמת האות מתקבל על ידי תספיג, והוא נקבע מדעית. ביצוע ההעברה באמצעות µL 20 או 100 µL גלאים פיפטה עצה.
5. Centrifuge התאים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות.
6. כדי להפיק 100 x פתרונות מניות, להמיס מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז ב דימתיל סולפוקסיד בהתאם להוראות היצרן.
7. להכין מאגר מדגם ' x Laemmli 2 ' על-ידי דילול המאגר מדגם x Laemmli 4 המסופקים על ידי היצרן עם כמות שווה של מים מזוקקים. להוסיף את הכמות המתאימה של המניה 100 x של מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז בריכוז הסופי של מעכבי 2 x 2 מאגר מדגם x Laemmli.
   הערה: המאגר 2 מדגם x Laemmli יכול להתבצע מראש, אך מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז אמור להתווסף מיד לפני הוספת את 2 x Laemmli דוגמת המאגר (בתוספת מעכבי) כדי בגדר תא כדי lyse התאים, כמתואר בשלב הבא.
8. בזהירות להסיר חלק תגובת שיקוע בגדר תא, וכדי את תגובת שיקוע שנותרו בצינור עם בגדר תא, להוסיף אמצעי שווה 2 מאגר מדגם x Laemmli בתוספת מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז להשגת ריכוז סופי של 500 תאים/µL במאגר מדגם x Laemmli 1.
   הערה: לדוגמה, אם אתה מעביר 2,000 תאים הנפח הכולל של 20 µL את µL 2 של תגובת שיקוע שנותר צינור 2.5 שלב, לאחר צריך שתוציאו את התאים (שלב 2.6) אתה צריך להסיר µL 18 של תגובת שיקוע של בגדר, וכדי להוסיף אמצעי שווה (2 µL) של 2x Laemmli מאגר מדגם להשגת ריכוז סופי של 500 תאים µL במאגר מדגם x Laemmli 1.
9. Resuspend בגדר כדי ליצור את lysate בהקדם האפשרי. בשלב זה, הדגימות ניתן electrophoresed מיד דרך עמוד מרחביות ג'לים או יכולה להיות snap קפוא נוזלי N₂ המאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

3. אלקטרופורזה

1. מחממים את lysates בתוך גוש חום ב 95 ° C או במים רותחים במשך 5 דקות.
2. Electrophorese 1-40 µL של lysates (מכיל בין 500 עד 20,000 ושווי תא) דרך ג'לים מרחביות-דף-100V באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים¹⁰.
   הערה: הנפח של lysate הטעונות בג'ל נקבע לפי מספר התאים הדרושים כדי ליצור את האות רצוי, יהיה תלוי השפע של החלבון של עניין, האיכות של הנוגדן. הנתונים באיור 1 התקבלו עם 2,000, 1,000 500 תאים המקבילים lysate. הרוחב של הבאר צריך להיות בטווח של 3 מ מ עד 1.5 מ מ. 1.5 מ מ שיניים יכול להיות חתוך מ מסרק זמינים מסחרית עם השיניים רחב יותר באמצעות מספריים.

4. העברת וחסום

הערה: בצע את תספיג בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים¹¹. השלבים מתוארים בקצרה כאן:

1. Pretreat polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור s 10 ולאחר מכן לשטוף הקרום בקצרה עם מים מזוקקים.
2. להעביר את החלבון הג'ל מרחביות-דף קרום ועקוב אחר ההוראות במדריך המסופקים על ידי היצרן של מנגנון העברה.
3. בעקבות העברה, לחסום את הקרום עם 2 מיליליטר 5% שור אלבומין (BSA) ב PBST (PBS עם 0.1% Tween) לילה ב 4 ° C בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים¹¹.

5. נוגדן תיוג

1. דגירה הקרום עם נוגדנים על מטרף בן לילה ב 4 ° C באמצעות נוגדן דילולים המומלץ על ידי הספק.
   הערה: את הטבלה של החומרים, נוגדנים, הבדיקה והאימות עבור HSCs ו HPs ו של דילולים נוגדנים המתאימים, מוצגות. לבצע תיוג נוגדן באמצעות הליכים סטנדרטיים⁸.

6. זיהוי

1. לשטוף את הקרום 3 פעמים, 5 דקות עבור כל כביסה ב PBST בטמפרטורת החדר.
2. דגירה הקרום עם 2 מ של מאגר chemiluminescence משופרת עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. לזהות את הסימנים באמצעות מערכת הדמיה בעקבות הוראות, של היצרן או autoradiography הסרט ומעבד הסרט.

תוצאות

התוצאות נציג מ 500-2000 מטוהרים HSCs ו HPs מוצגים באיור 1 ו- 2 איור. האות β-אקטין באיור 1 ניתן להבחין בין מעטים כמו 500 HSCs וטיהרו HPs ממח העצם של עכבר אחד. שימו לב כי להעמיס את lysates לתוך בארות 1.5 מ מ המיוצר אות חזק הרבה יותר מ- 500 HPs מאשר טעינה...

Discussion

סופג המערבי הוא שיטה מקובלת לגילוי חלבונים ספציפיים והפעלה של איתות המסלולים רקמות או תאים. על ידי הצגת שינויים קטנים הליך נפוץ, היינו מסוגלים לזהות באופן שגרתי חלבונים שונים 15 (טבלה של חומרים) ב- 15,000 HSCs, ובחלק מן המקרים תוך 500 HSCs. The most השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם: ספירת התאים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis