Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Özet

Standart bir Western blot Protokolü 500 hematopoetik kök veya progenitör hücre olarak birkaç analiz etmek için optimize edildi. En iyi duruma getirme dikkatli hücre örneği işleme, tüpleri arasında aktarımlarını sınırlama ve doğrudan Laemmli örnek arabellek hücrelerde lysing içerir.

Özet

Hematopoetik kök hücre (HSCs) nadir hücreleri, fare kemik iliği sadece 25.000 ~ fenotipik içeren uzun süreli kullanıma HSCs. Batı blotting iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve HSCs (500-15000 hücreleri) az sayıda analizi için uygun. Fenotipik HSCs saf, doğru sayılır ve Laemmli örnek arabellekte doğrudan lysed. Hücreler eşit sayıda içeren Lysates Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz edildi ve leke hazırlanmıştır ve standart Western blot protokolleri takip işlenir. Bu iletişim kuralı, 2000-5000 kullanarak HSCs düzenli olarak analiz edilebilir ve bazı durumlarda veri olabildiğince az 500 hücreler, çoğu yayınlarda bildirdi 20,000-40,000 hücrelere kıyasla olarak elde edilebilir. Bu iletişim kuralı diğer hematopoetik hücrelerin genel olarak uygulanabilir olmalıdır ve az sayıda hücre standart Laboratuvar yordamları kullanarak rutin çözümleme sağlar.

Giriş

Hematopoetik kök hücre (HSCs) tüm kan soy çıkmasına neden olabilir kendini yenileyerek hücrelerdir. Onlar nispeten nadir biyokimyasal analizler zor işleme kemik iliği hücrelerinde vardır. Akış Sitometresi gibi nadir hücrelerin analiz etmek için uygun yaklaşımlar göreli miktarda hücre yüzey işaretleyicileri ve intraselüler protein miktarının için son derece yararlı olmuştur. Ancak, çözümleme hücre içi proteinlerin hücre permeabilization yordamlar antikor erişimi etkinleştirmek için kullanımı gerektirir ve tüm hücre yüzey epitopları bu yordamları^1,2hayatta. Buna ek olarak, farklı protein izoformlarının veya bölünme ürünleri arasında ayırımcılık antikorlar genellikle akış sitometresi için kullanılabilir değildir ve bu nedenle müfettişler, hala analiz türleri kesin Batı lekesi güvenmek.

Hücre lysates Western blot Analizi çoğu laboratuarlarında rutin bir işlemdir. Hücre epitopları hücre yüzey moleküllerin korumak yerel koşullar altında saf ve hücre lysates daha sonra hazırlanan ve analiz. Ancak, nüfus tarafından Western blot nadir İlköğretim hücredeki protein analizi hayvanlar yeterince hücre elde etmek için çok sayıda ötenazi gerektirebilirsiniz. Birkaç adım için küçük ayarlamalar yaparak, geleneksel Batı blotting Protokolü proteinler HSCs (500-15.000 bağlı olarak faiz protein) nispeten az sayıda tespit edebilir başardı. Doğru bir şekilde dikkatle hücre kaybı, en aza indirmek için borular arasında hücre aktarımlarını azaltma hücre Pelet işleme hücreleri, sayım ayarlamaları dahil ve hücrelerin konsantre bir yükleme ile tanımlanmış bir dizi lysing arabellek içeren proteasome ve fosfataz inhibitörleri. Yayımlanmış raporların çoğu Batı lekesi 20.000 veya daha fazla HSCs^3,4,5,6,7ile elde içerir; Bu basit bir prosedür hücreleri ve deneysel hayvan 4 ve 40 kat arasında tarafından eşdeğer veri üretmek için gereken sayısını azaltır. Protokol sonuçları hücre başına bazında değil, bir iç kontrol normalleştirmek için tasarlanmıştır. Bu veri bir iç kontrol için normalleştirilmiş Eğer göz ardı edilebilir protein düzeyleri olarak genel indirim olarak algılanmasını sağlar. Bir hücre başına bazında normalize önemini gen ifadesi verileri⁸analiz için tanımlanmıştır ve Western blot tarafından protein miktarının aynı ilke geçerlidir. Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı herkes için az sayıda hücre analiz etmek gerek yararlı olmalıdır.

Protokol

Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanım ve bakım kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Yordamı fare hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSCs ve HPs) analizi için geliştirilmiş, ancak diğer hücre popülasyonlarının analiz için adapte edilebilir.

1. akış sitometresi yalıtım HPs ve fare HSCs

1. Fare kemik iliği hücreleri edebiyat⁶' açıklandığı gibi hasat.
   Not: Resim 1 ve Şekil 2sunulan verilerde, kemik iliği C57BL/6J fareler hasat.
2. Soy tükenmesi kemik iliği hücrelerinin üreticinin yönergelerini izleyerek bir fare soy tükenmesi kit kullanarak gerçekleştirin.
3. Hücre yüzey işaretleyicileri ilgi karşı antikor içeren hücreler açıklanan⁷kuluçkaya. Resim 1 resim 2görüldüğü deneylerde antikorlar Sca-1, Kit, Flt3 ve lineage (LIN) işaretleri Mac1, Gr1, CD3e, B220 ve Ter119 için kullanılır.
4. 2.000-20.000 Lin^- Sca1 sıralama⁺Seti⁺ Flt3^- hücreleri (HSCs) veya Lin^-Sca1^-Seti⁺ hücrelere 1,5 mL Eppendorf tüpleri 0.1 mL fosfat içeren (HPs) arabelleğe alınmış serum %2 fetal sığır (PBS) Serum (FBS).
   Not: Resim 1 ve Şekil 2gösterilen veri için akış sitometresi ile 70 µM başlığı kullanarak hücreleri sıralanmış. 1.4 mL en fazla toplama birimdir.

2. numune hazırlama

Not: Bu adım önemlidir. Örnek çok dikkatli bir şekilde işlemek. Süpernatant kaldırırken, hücre Pelet değil rahatsız etmek için dikkatli olun.

1. Santrifüj 1.5 mL tüpler, sallanan bir kova rotor 4 ° C'de sıralanmış hücreleri içeren hücreden süpernatant ile yaklaşık 100 µL hariç hepsi 5 dk. Kaldır 500 x g cips çok nazikçe bir pipet ve 20 µL damlalıklı bahşiş kullanarak. Pelet rahatsız etmeyin.
   1. Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve sıralanmış örnek hacmi az 0.2 mL ise, hücreleri ilk düşük bağlama 0.2 mL PCR tüpleri Santrifüjü önce aktarın.
   2. Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve birim 0.2 mL den fazla ise, spin 5 min için bir santrifüj-4 ° c, 500 x g, ile aşağı hücreleri ve tüm 200 µL süpernatant, kaldırın. Kalan 200 µL süpernatant, in pelleted hücreleri yeniden askıya sonra hücreleri 0.2 mL PCR tüpleri için aktarmak ve spin aşağı tekrar. Tüm ama 20-30 µL Pelet sonra ikinci spin kaldırmak ve hücreleri yeniden askıya alma.
2. Tüp süpernatant sol hücrelerde resuspend. Gerekiyorsa, ek PBS % 2 eklemek FBS/PBS (de %2 sığır serum albumin (BSA) kullanabilirsiniz / PBS veya PBS yalnız) bir konsantrasyon 5 elde etmek için x10⁴ 5 x 10⁵ hücre/ml.
   Not: hücre sayar kullanım hücreler askıya alma için kullanılan birim tahmin etmek için sitometresi tarafından toplanan.
3. 2-5 µL yeniden askıya alınan hücrelerin (üreticinin yönergeleri izleyerek) bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre⁹kullanarak bir doğru hücre konsantrasyonu belirlemek için kullanın.
4. Bir birimi yeniden askıya alınan hücrelerin hücrelere yeni 1,5 mL tüpler için istediğiniz sayıyı içeren aktarın. Şekil 1' deki deneme için 2.000, 1000 veya 500 HSCs veya HPs transfer edildi. Hücreler için istediğiniz sayıyı Western blot tarafından elde edilen sinyal gücüne bağlıdır ve ampirik olarak belirlenir. 20 µL veya 100 µL Eppendorf pipet ucu kullanarak aktarımı gerçekleştirmek.
5. Bir sallanan kova rotor 4 ° c, 500 x g, 5 min için hücrelerde santrifüj kapasitesi.
6. 100 x hisse senedi çözümler üretmek için üreticinin yönergelerine göre proteasome ve fosfataz inhibitörleri olarak DMSO geçiyoruz.
7. 2 x Laemmli örnek arabellek distile su eşit miktarda ile yapılabileceği 4 x Laemmli örnek arabellek sulandrarak hazırlayın. 2 x inhibitörleri 2 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri 100 x stokunun uygun bir miktarda ekleyin.
   Not: 2 x Laemmli örnek arabellek önceden yapılabilir, ama proteasome ve fosfataz inhibitörleri hemen ve 2 x Laemmli örnek arabellek (plus inhibitörleri) hücre Pelet hücreleri, koşullar için açıklandığı gibi eklemeden önce aşağıdaki adımda eklenmelidir.
8. Dikkatli bir şekilde hücre Pelet ve hücre Pelet ile tüp içinde kalan süpernatant için süpernatant bir bölümünü kaldırmak, 2 x Laemmli örnek arabellek artı 500 son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri eşit bir birim ekleme hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği.
   Not: 20 µL toplam hacmi 2.000 hücrelerde Pelet süpernatant ile 18 µL kaldırmalısınız hücreleri (adım 2.6) centrifuging sonra adım 2.5, bir tüp ve kalan süpernatant ile 2 µL aktarırsanız Örneğin, (2 µL) eşit hacmi ekleyin 2 x 500 hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için Laemmli örnek arabellek.
9. Lysate en kısa zamanda üretmek için Pelet resuspend. Bu noktada, örnekleri hemen SDS-sayfa jelleri electrophoresed veya olabilir ek sıvı N₂ içinde donmuş ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.

3. Elektroforez

1. Lysates 95 ° c ısı bloğundaki veya kaynar suda 5 dk için ısı.
2. 1-40 µL (500 kadar 20.000 hücre eşdeğerleri içeren) lysates, kullanarak standart protokolleri¹⁰SDS-sayfa jelleri 100V adlı electrophorese.
   Not: Lysate jel yüklenen hacmi arzu edilen sinyal oluşturmak için gereken hücre sayısı tarafından belirlenir ve ilgi ve antikor kalitesini protein bereket on bağlı olacaktır. Şekil 1 ' deki verileri 2.000, 1000 ve 500 hücre karşılıkları lysate ile elde edilmiştir. Kuyu genişliğini 3 mm için 1,5 mm. 1.5 mm diş olabilir aralığında piyasada bulunan bir tarak makas kullanarak daha geniş dişleri ile kesilmelidir.

4. transfer ve blok

Not: standart protokolleri¹¹takip bir Western blot gerçekleştirin. Belgili tanımlık merdiven burada kısaca özetlenmiştir:

1. Distile su ile 10 s sonra yıkama membran kısa bir süre için bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran metanol ile pretreat.
2. Protein SDS-sayfa jel aktarım cihazları üreticisi tarafından sağlanan el kitabındaki yönergeleri takip membran aktarın.
3. Devri, blok membran ile %5 Sığır serum albumin (BSA) PBST içinde 2 mL (PBS % 0.1 ile ara) standart protokolleri¹¹takip 4 ° C'de gecede.

5. antikor etiketleme

1. Membran ile antikor gecede 4 ° C'de satıcı tarafından önerilen antikor dilutions kullanarak bir shaker üzerinde kuluçkaya.
   Not: Biz HSCs ve HPs ve karşılık gelen antikor dilutions için doğrulanmış, antikorlar malzemeler tablo gösterilir. Standart prosedürler⁸kullanarak antikor etiketleme gerçekleştirin.

6. algılama

1. Membran 3 kez, PBST her makinaya oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
2. Membran ile Oda sıcaklığında 1 min için geliştirilmiş Kemiluminesan tampon 2 mL kuluçkaya. Üreticinin yönergeleri, veya autoradiography film ve film işlemci aşağıdaki bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri algılayabilir.

Sonuçlar

500-2000 arıtılmış HSCs ve HPs temsilcisi sonuçlarını resim 1 ve Şekil 2gösterilir. Şekil 1 ' deki β-aktin sinyal az 500 HSCs üzerinden tespit edilebilir ve bir fare kemik iliği HPs saf. Lysates 1.5 mm kuyu yükleme yükleme 3.0 mm kuyu içine daha çok daha güçlü bir sinyal gönderici 500 HPs üretilen unutmayın. Şekil 2 olduğunu EIF4G bir Western blo...

Tartışmalar

Western blot spesifik proteinlerin ve sinyal yolları aktivasyonu dokular veya hücreleri tespit için ortak bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yordam ufak değişiklikler getirerek, biz düzenli olarak 15 farklı proteinler (Malzemeler tablo) 15.000 HSCs ve bazı durumlarda olabildiğince az 500 HSCs olarak tespit edebildik. The Most bu protokolündeki kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde hücreleri sayma, 2) tüpler arası sayısını en aza indirme ve 3) doğrudan Laemmli ör...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis