ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات

Summary

المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.

Abstract

المعرفة الحالية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)-الاتصالات خلية يترجم إلى الدراسات الكبيرة الثقافة في المختبر (2D) ثنائي الأبعاد حيث يتم عرض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة كطلاء سطح. وهذه النظم الثقافة تشكل تبسيطا للطبيعة المعقدة للأنسجة ECM التي تشمل تشكيل البيوكيميائية وهيكل وخصائص ميكانيكية. لمحاكاة أفضل الاتصالات ECM-خلية تشكيل المكروية القلب، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ديسيلولاريزيشن قلب الجنين كله وأنسجة البطين الأيسر الكبار اكسبلانتس في نفس الوقت للدراسات المقارنة. البروتوكول يجمع بين استخدام مخزن مؤقت ناقص التوتر، مطهر خصائص السطح أنيونى، ومعاملة الدناز دون أي اشتراط للمهارات المتخصصة أو المعدات. تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن عبر عينات الأنسجة من مواضيع عصر مختلف نهج بديل لإجراء دراسات مقارنة. يسمح هذا البروتوكول تحديد الاختلافات الهيكلية فريدة من نوعها عبر الجنين والكبار القلب ECM مش والبيولوجية الخلوية الردود. وعلاوة على ذلك، هذه الوثيقة يوضح منهجية تطبيق أوسع نطاقا يجري تطبيقها بنجاح في أنسجة أخرى والأنواع مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة، كما هو الحال في خزعات الأمعاء البشرية والرئة الماوس.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكة دينامية من الجزيئات التي تنظم العمليات الخلوية الهامة، إلا وهي مصير قرار،^1،انتشار والتفريق². وقد أجريت التحقيق في تفاعلات الخلية-ECM أساسا في ثنائي الأبعاد (2D) في الثقافات الأنابيب المغلفة مع مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تشكل تبسيط خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية الموجودة في فيفو. ديسيلولاريزيشن يولد اللاخلوي بيوسكافولدس ECM 3D تشبه إلى حد كبير الحفاظ على بنية الخلية وتكوين الأنسجة الأصلية والأجهزة^3،4. بالإضافة إلى خدمة السقالات النشطة بيولوجيا لهندسة الأنسجة، الخارجة ديسيلولاريزيد الحيوية ECM 3D كمنصات جديدة لتقييم بيولوجيا الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة هذا التوازي المجراة في البيئة.

تقييم الدور التفاضلية لمكونات ECM أنسجة متميزة وأجهزة والعمر ستستفيد باستخدام بروتوكولات مماثلة لتوليد بيوسكافولدس الأصلية. في القلب، وقمنا بتطوير بروتوكول متعدد الاستخدامات ديسيلولاريزيشن عينات الأجنة والمستمدة من الكبار، كنهج بديل لإجراء دراسات مقارنة المكروية الجهاز. استخدام هذه المنهجية، استولت المكروية القلب الأصلي وأظهرت أن يعزز ECM الجنين غلات تعمير لخلايا القلب⁵. ديسيلولاريزيشن توفير مزيد من تحديد هوية المقيم الاختلافات الهيكلية بين ECM الجنين والكبار على مستوى ترتيب شبكة مصفوفة الصفيحة الطابق السفلي وبيريسيلولار والألياف تكوين⁵. قبل هذا العمل، أبلغ مقارنة وجها لوجه للأنسجة في مختلف مراحل التحور باستخدام نفس النهج ديسيلولاريزيشن فقط للقرد الريسوسي الكليتين وقلوب القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يقدم عدد محدود من الدراسات الأنسجة الجنينية/الجهاز ديسيلولاريزيشن في حد ذاتها^5،،من⁶⁷. وقد تم ذلك باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي كعامل ديسيلولاريزيشن فريدة من نوعها؛ ومع ذلك، استخدمت متميزة الحزب الديمقراطي الصربي تركيزات ديسيلولاريزيشن الجنين والكبار من أنسجة القلب^7،8. الحزب الديمقراطي الصربي هو واحد من المنظفات الأيونية الأكثر فعالية لإزالة المواد النووية وحشوية، وتستخدم على نطاق واسع في ديسيلولاريزيشن لمختلف الأنسجة والعينات^9،من¹⁰. المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من الحزب الديمقراطي الصربي، وفترات طويلة من التعرض لها قد يرتبط تمسخ البروتين، فقدان glycosaminoglycan (الكمامات) واضطراب ييفات الكولاجين^10،11، ومن ثم التوازن بين إزالة الحفاظ عليها وخلية إدارة المحتوى في المؤسسة أمر ضروري. لتطبيق نفس الإجراء على أنسجة قلب الجنين والكبار، يتم تقسيم البروتوكول الموضحة هنا في ثلاث خطوات متتابعة: خلية تفسخ بصدمة ناضح (المخزن المؤقت ناقص التوتر)؛ سولوبيليزاتيون تفاعلات البروتينات الدهنية والبروتين الحمض النووي والبروتين-بروتين (الحزب الديمقراطي الصربي 0.2 ٪)؛ وإزالة المواد النووية (الدناز المعاملة).

لدينا بروتوكول يظهر العديد من المزايا: أنا) إمكانية أي ما يعادل ديسيلولاريزيشن من أنسجة القلب سن معينة من تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن؛ ثانيا) أي متطلبات للأساليب المتخصصة أو المعدات؛ ثالثا) جاهزة التكيف للأنسجة والأنواع الأخرى كما أنها قد طبقت بنجاح مع تعديلات طفيفة في خزعات الأمعاء البشرية¹² والماوس الرئة¹³؛ والأهم من ذلك، رابعا) يمكن معالجة خصائص النشاط الحيوي ECM حين تمكن الجمعية العامة الثقافات مثل 3D أورجانوتيبيك أكثر عن كثب تحاكي ملامح الجزيئية المكروية الأنسجة الأصلية.

Protocol

وقد أقر جميع المنهجيات ووصف i3S لجنة الأخلاقيات الحيوان و Direção دي Geral Veterinária (دجاف)، وهي وفقا للبرلمان توجيه 2010/63/الأوروبي.

1-إعداد الحلول ديسيلولاريزيشن

ملاحظة: ديسيلولاريزيشن جميع الحلول ينبغي تصفيتها من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر والمخزنة لمدة أقصاها 3 أشهر، باستثناء تعيين خلاف ذلك.

1. لبرنامج تلفزيوني س 1: مزيج ز 8 من كلوريد الصوديوم، ز 1.01 Na₂هبو₄ 200 مغ بوكل، و 200 مغ من خ₂ص₄ مع 900 مل مياه (المياه دي). ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.5 وحجم الحل النهائي حتى لتصفية ل. 1، اﻷوتوكﻻف، ومخزن الحل في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. ناقص التوتر من المخزن المؤقت (10 ملم تريس، يدتا 0.1 ٪): حل ز 1.21 من تريسباسي وز 1 يدتا في 900 مل مياه. ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم/HCl وحجم الحل النهائي إلى 1 ل. تصفية وتعقيم قبل اﻷوتوكﻻف وتخزينها في الرايت
3. لحل الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% (0.2% الحزب الديمقراطي الصربي، 10 مم تريس): إضافة 0.6 غ من تريسباسي و 1 غ من دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في 400 مل مياه دي ويقلب عند 60 درجة مئوية حتى انحلال ذائبة كاملة. السماح لإيجاد حل لتهدئة لضبط الرايت الحل الأس الهيدروجيني إلى 7.8 وحجم الحل النهائي إلى 500 مل. تعقيم الحل عن طريق الترشيح.
   ملاحظة: ينبغي إعداد حل الحزب الديمقراطي الصربي قبل الاستخدام. الحل تصفية فقط بعد إكمال حل الحزب الديمقراطي الصربي، وإلا سوف تشبع الجزيئات غير قابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي عامل التصفية، تغيير تركيز الحزب الديمقراطي الصربي النهائي و وبالتالي يؤثر على كفاءة ديسيلولاريزيشن الأنسجة.
4. ناقص التوتر من المخزن المؤقت يغسل (10 ملم تريس): مزيج ز 1.21 من تريسباسي في 900 مل دي المياه. ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.8 والحجم النهائي لتصفية ل. 1 وتعقيمها قبل اﻷوتوكﻻف وتخزينها في الرايت
5. لعلاج الدناز (20 مم تريس، 2 مم مجكل₂, 50 يو/مليلتر الدناز): حل ز 2.42 من تريسباسي و 2 مل من م 1 MgCl₂ في 900 مل مياه دي. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.8 وحجم الحل النهائي إلى 1 ل. تصفية وتعقيم الحل قبل اﻷوتوكﻻف. تخزين الحل في "الرايت إضافة الدناز" أنا (50 ش مل) قبل استخدامها.
6. الدناز أنا الأسهم الحل: إعداد المخزن مؤقت الدناز الذي يحتوي على 50% والغليسيرول، 20 مم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 1 مم مجكل₂، وضبط حجم 10 مل مع المياه دي حل نهائي. في غطاء الاندفاق الصفحي، إضافة الدناز مسحوق إلى المخزن المؤقت الدناز، وتخلط بلطف حتى حل كامل. تعقيم الحل عن طريق 0.22 ميكرومتر التصفية. تحضير مختبرين 1 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية.

2-الأنسجة الحصاد ونعد

1. Euthanize الكبار من الإناث الحوامل في 18 يوما الحمل (E18 الأجنة) عن طريق الخنق₂ CO. القيام العملية قيصرية على الإناث مع مقص جراحية وجمع قرون الرحم آخذة الفئران الجنينية إلى طبق بتري مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 x باستخدام الملقط مسنن اثنين مع أطراف منحنية (الملاقط واحد لكل نهاية القرن).
   1. فتح ابواق الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين لعزل الأجنة. نقل الأجنة في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني x 1 المثلج تخدير لهم وقطع رأس مع مقص.
   2. Euthanize 7-8 أسابيع من العمر C57BL/6 ذكور الفئران باستخدام الخنق₂ CO. تنفيذ شق على كل الصدر الماوس وجمع القلب.
   3. باختصار شطف قلوب الأجنة والبالغين مع الجليد الباردة 1 x برنامج تلفزيوني.
2. إزالة الاذينين القلب الكبار مع المساعدة من مشرط. تنفيذ شق على البطين الأيمن وإزالته باستخدام مقص صغير مباشرة. تعرض الجدار الداخلي البطين الأيسر عن طريق إزالة الحاجز. في طبق بتري جديد، تقسيم البطين الأيسر مجاناً-الجدار في شرائط طولية بسمك 2 مم وإزالة العضلات الحليمية استخدام المبضع، والملقط مسنن بأطراف منحنية.
   1. المكوس explants النسيج الصغيرة مع المساعدة من مشرط استخدام شبكة 2 × 2 مم (وصف مفصل في تكميلية 1 الشكل⁵). باختصار شطف الأنسجة explants مع برنامج تلفزيوني 1 x.
3. إضافة ~ 250 ميليلتر من قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) في مجمع لأنابيب ميكروسينتريفوجي يعقم 1.5 مل. نقل الجنين كله قلوب والكبار explants القلب إلى الأنابيب مع 250 ميليلتر من أكتوبر وتجميدها مع تبريد الثلج الجاف إيسوبينتاني ومخزن في-80 درجة مئوية (بحد أقصى لمدة 6 أشهر).
   ملاحظة: سيقلص استخدام أنسجة القلب explants cryopreserved لأكثر من 6 أشهر كفاءة ديسيلولاريزيشن، لا سيما في explants أنسجة القلب الكبار.

3-الأنسجة ديسيلولاريزيشن

ملاحظة: يتم ديسيلولاريزيشن أنسجة القلب بصفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع عينة واحدة كل بئر. يتم إضافة 1 مل من كل حل ديسيلولاريزيشن لكل فرد كذلك. ينبغي إجراء جميع خطوات ديسيلولاريزيشن مع الانفعالات 165 لفة في الدقيقة (حاضنة شاكر مع مداري قطرها 20 مم) وعند 25 درجة مئوية، ما لم يحدد خلاف ذلك. للحصول على مزيد من التفاصيل، الرجاء مراجعة المخطط على الشكل 1A. الامفوتريسين B (مثل فونجيزوني) والجنتاميسين طازجة تضاف إلى جميع الحلول ديسيلولاريزيشن قبل استخدامها لتركيز نهائي 2.5 ميكروغرام/ملليلتر و 0.01 ميكروغرام/مل، على التوالي. لتحديد مقدار الحمض النووي الاحتفاظ داخل الأنسجة ديسيلولاريزيد، واحتياجات عينة جماعية تحدد قبل بدء تشغيل بروتوكول ديسيلولاريزيشن. بروتوكول الكمي الحمض النووي هو زيادة مفصلة في القسم 5.1.

1. يوم 1
   1. إزالة عينات الأنسجة من الثلاجة-80 درجة مئوية. اترك مل 1.5 أنابيب ميكروسينتريفوجي على RT حتى يصبح ذاب جزئيا في أكتوبر. نقل كتلة أنسجة القلب OCT لا تزال مجمدة على طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني 1 x.
   2. بعد أن يذوب أكتوبر، نقل أنسجة القلب إلى طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني 1 x. كرر عينات المياه والصرف الصحي في 1 × برنامج تلفزيوني و 60 لفة في الدقيقة مع شاكر عن 10-15 دقيقة على الأقل مرتين.
   3. أضف 1 مل من العمل "ناقص التوتر المخزن المؤقت" كل من صفيحة العقيمة زراعة الأنسجة 24-جيدا جيدا. نقل عينة واحدة كل بئر بمساعدة الملقط.
   4. نقل لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع العينات إلى شاكر حاضنة عند 25 درجة مئوية والبدء في الحضانة ح 18 مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر".
2. يوم 2
   1. إعداد حل الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% كما هو موضح في الفرع 1-3.
   2. نضح "المخزن المؤقت ناقص التوتر" وغسل العينات مع برنامج تلفزيوني 1 x 1 حاء كرر 3 مرات.
      ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت: يمكن الاحتفاظ بالنسيج تحت ديسيلولاريزيشن في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية عن ح 18 في ظروف ثابتة.
   3. إزالة برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 مل من الحزب الديمقراطي الصربي تقدم طازجة (خطوة 1.3) حل كل بئر واحتضان عينات ح 24.
      ملاحظة: (راجع النقطة) "وظيفة الحزب الديمقراطي الصربي" الحضانة، ضمان أن عينات المعرض بيضاء للمظهر شفافة. في هذه الخطوة، تعامل الحزب الديمقراطي الصربي العينات هي غارق في الحمض النووي، تبين وجود اتساق مثل الجيلاتين. إزالة حل الحزب الديمقراطي الصربي ببطء لتجنب التصاق عينة لنصيحة ماصة.
3. يوم 3
   1. غسل العينات مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر يغسل" (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، فإنه من الطبيعي أن نلاحظ انخفاضا في حجم العينة نتيجة لإزالة مخلفات الخلية. نقطة الإيقاف المؤقت: الأنسجة تحت ديسيلولاريزيشن يمكن أن يوضع في "المخزن المؤقت ليغسل ناقص التوتر" عند 4 درجة مئوية عن ح 18 في ظروف ثابتة.
   2. أضف 1 مل من محلول "العلاج الدناز" كل بئر واحتضان هذه العينات ح 3 في 37 درجة مئوية.
   3. نضح الحل "العلاج الدناز" وغسل العينات مع 1 x برنامج تلفزيوني (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات. أداء يغسل نهائي مع برنامج تلفزيوني 1 x (1 مل كل بئر) بين عشية وضحاها في الرايت وتهز 60 لفة في الدقيقة.
   4. (نقطة تفتيش) بعد العلاج الدناز، ضمان أن العينات ديسيلولاريزيد فقدوا الاتساق مثل الجيلاتين.
      ملاحظة: بعد العلاج الدناز، إزالة وإضافة 1 x PBS بلطف حيث يمكن بسهولة أكمنة عينات وتعلق على الحافة ماصة.

4-تقييم لإزالة خلايا الأنسجة ديسيلولاريزيد

1. إصلاح العينات في صفيحة زراعة الأنسجة 24-حسنا، 1 عينة الواحدة وكذلك، عن طريق إضافة 1 مل محايدة تقدم طازجة الفورمالين 10% المخزن المؤقت مع 0.03 في المائة ثم مائي ح 2.5-3 في الرايت
   ملاحظة: يتم إضافة ويوزين إلى مثبت لوصمة عار الأنسجة ديسيلولاريزيد وتخفيف التصور عينة خلال تمزيقها وتلطيخ نسيجية. إضافة ويوزين لا يتداخل مع البقع النسيجي لا مع تقنيات الفلورة. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم التثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. إزالة الحل مثبت وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لغسل العينة.
3. تغليف بيوسكافولدس الثابتة في جل معالجة الأنسجة باستخدام قالب عينة الفينيل القابل للتصرف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
4. إزالة جل علم الأنسجة بالعينة جزءا لا يتجزأ من العفن ونقل إلى خزعة تجهيز/تضمين "أشرطة الكاسيت" مع غطاء.
   ملاحظة: بديل للأنسجة التضمين في علم الأنسجة وتجهيز جل لمعالجة كل عينة في الأسفنج خزعة اثنين مع المسام الصغيرة. يجب أن تكون مترجمة العينات إلى مركز الأسفنج خزعة لتمكين الكشف عن. من المذكرة، يكون من الصعب على ترجمة هذا النهج باستخدام بعض العينات.
5. معالجة العينات البارافين التضمين من خلال إينكوبيشنز المتعاقبة (30 دقيقة لكل حل) في سلسلة من تركيزات الكحول (70%، 80%، 90%، 100 ٪، 100 ٪)، إيسوبارافينيك الهيدروكربونية الاليفاتيه الحل (مراكز حضانة 2) والكيروسين (الحضانة 2 محطات) في 56 درجة مئوية.
6. تحميل العينات في كتلة بارافين.
7. قص 3 ميكرومتر سميكة البارافين الفروع المتعلقة مبضع وجمع المقاطع على الشرائح الزجاجية المجهر.
8. مقاطع البارافين الجافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتم تخزين المقاطع البارافين (وقفه نقطة) في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
9. للتحقق من فعالية البروتوكول، أداء هيماتوكسيلين وويوزين (H & E) و Trichrome ماسون لتلطيخ (طن متري) من المقاطع عينة ديسيلولاريزيد وإلى أجزاء من الأنسجة غير معالجته وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: ح & ه تلوين البقع خلية نويات أزرق/أرجواني، السيتوبلازم الظلام الوردي الأحمر والوردي شاحب الكولاجين والنقل المتعدد الوسائط بقع من نواة سوداء والسيتوبلازم أحمر، والكولاجين والميوسين الأزرق. ديسيلولاريزيشن كفاءة ويتحقق عند وردي الخفيفة المسامية (H & E، طن متري) ويلاحظ الأزرق (MT) شبكة، في غياب وصمة عار النووية.

5-تقييم لإزالة المواد النووية الأنسجة ديسيلولاريزيد

ملاحظة: يجب إجراء التقدير الكمي لمحتوى الحامض النووي في أنسجة ديسيلولاريزيد بالمقارنة مع الأنسجة غير التلاعب بها كل منهما.

1. قبل ديسيلولاريزيشن، تزن أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على نطاق رقمية عالية دقة. نقل الأنسجة القلبية إلى الأنبوب وإزالة كمية إضافية من برنامج تلفزيوني 1 x وتزن الأنبوب مع العينات. حساب الوزن الرطب من العينات:
   عينة_{من الوزن الرطب} = وزن _{الأنبوبة مع عينات} – وزن _{الأنبوبة فارغة}
2. ديسيلولاريزي العينات كما هو موضح في الخطوة 3.
3. وبعد ديسيلولاريزيشن، جمع الأنسجة ديسيلولاريزيد في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
   1. بسبب أبعاد صغيرة والجماهيري لعينات القلب فرادى ومجموعة المواصفات، تجمع الأنسجة ديسيلولاريزيد لكل شرط عينة (قلب الجنين: 5 قلوب كله؛ والكبار LV explants: 15 explants). تنفيذ نفس الإجراء مع الأنسجة عدم التلاعب بها.
      ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) العينات التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي، والتقدير الكمي.
4. قطع غير التلاعب وديسيلولاريزيد الأنسجة explants الصغيرة مع مساعدة مشرط في طبق بتري نظيفة.
   ملاحظة: استخدام المبضع الفردية وطبق بيتري لكل عينة. اختلال ميكانيكية للعينات مع مشرط يسهل الهضم الأنزيمي الخلفي، واستخراج الحمض النووي اللاحقة.
5. لاستخراج الحمض النووي، استخدام أسلوب عمود دوران على أساس استخراج الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
   1. جمع العينات ميكانيكيا ينتابها من طبق بيتري مع الهضم الرئيسي المخزن المؤقت (المخزن المؤقت الهضم والبروتيناز ك) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام تلميح ماصة واسعة فوهة.
      ملاحظة: تحلل الأنسجة مع "ك بروتيناز" الهضم أسرع في عينات ديسيلولاريزيد. لتجهيز عينات متميزة في نفس الوقت، الاحتفاظ بعينات تفكيك على الجليد، حتى يتم تفكيك جميع العينات إلى أدنى حد من التدهور. ويتحقق تحلل عينات كاملة بين ح 4-6.
   2. المضي قدما في البروتوكول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. لزيادة الغلة من الحمض النووي المستخرج من عينات الأنسجة ديسيلولاريزيد وغير ديسيلولاريزيد، الوت الحمض النووي في ميكروليتر 25-50 و 100 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت، على التوالي. جمع الحمض النووي الوتيد وتحميل تدور العمود. احتضان لمدة 1 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي الرايت العينات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يمكن (وقفه نقطة) المستخرجة من العينات "الحمض النووي" مخزن في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
6. تحديد كمية الحمض النووي المستخرج من العينات مع مجموعة كشف دسدنا نيون اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
7. تطبيع محتوى الحمض النووي نانوجرام من الحمض النووي في مليغرام من عينة أولية من الوزن الرطب (قبل ديسيلولاريزيشن).

6-ديسيلولاريزيد السقالات خلية البذر

ملاحظة: جميع الحلول/الكواشف تحتاج إلى أن تكون عقيمة وتنفيذ الإجراءات بأكملها في ظروف معقمة.

1. إعداد x DPBS 1 مع 2.5 ميكروغرام/مل من الامفوتريسين B و 1% P/S (البنسلين، 100 وحدة دولية؛ ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل).
2. إزالة 1 × الحل برنامج تلفزيوني من آخر خطوة الغسيل ديسيلولاريزيشن (الخطوة 3.3.3) وإضافة 500 ميكروليتر كل بئر الطازجة (1) x دببس/2.5 ميكروغرام/مل من محلول B/1% P/S الامفوتريسين. تخزين العينات في 4 درجات مئوية من 1-7 أيام.
   ملاحظة: تخزين العينات في 4 درجات مئوية من المهم الحفاظ على العقم.
3. أضف P/S خلية الإعلام القاعدية (دون FBS والمكملات الغذائية) إلى تركيز نهائي من 1%.
4. نضح 1 x دببس/2.5 ميكروغرام/مل من محلول B/1% P/S الامفوتريسين من العينات ديسيلولاريزيد. إضافة 500 ميكروليتر كل من الخلية القاعدية media/1% P/S جيدا وترك عينات حجته ح 1 في 37 درجة مئوية، أو عند 4 درجة مئوية لأكثر من ح 1.
5. تقسيم خلايا اهتمام وتحضير مختبرين صغيرة من الخلايا في خلية الكثافة المرغوب.
   ملاحظة: بذر الأنسجة ديسيلولاريزيد يجب إجراء تحت مجهر مجسمة وفي ظروف معقمة. خلية ثقافة وسائل الإعلام يجب أن يحتوي على 1% P/s.
6. "الماصة؛" 3-4 ميكروليتر من دببس إلى مركز بئر صفيحة 96-جيدا. استخدام ملاقط رقيقة والمستقيم، نقل السقالات ديسيلولاريزيد لإسقاط دببس وإزالة دببس إضافية بالطموح وتأكد من أن العينة لا مطوية أو التجاعيد. فلتصبح جافة في الحواف لتنضم إلى السطح جيدا.
   ملاحظة: قد فصل السقالات أقل كفاءة البذر.
7. إضافة خلايا إلى السقالة التي بيبيتينج الحل خلية واحدة ببطء ضد حواف البئر.
   ملاحظة: على سبيل المثال، كارديوميوسيتيس الفئران حديثي الولادة هي المصنف مع كثافة 7500 خلايا/مم² والماوس مخلدة لين⁻ السلف القلب خلايا Sca-1⁺ (المركز^{هيئة الأوراق المالية-1}) في كثافة 60-1,500 الخلايا/مم². ضبط كثافة الخلية وفقا للمنطق التجريبي.
8. إضافة دببس إلى الآبار المجاورة لتجنب التبخر سريع وسائل الإعلام.
9. 24 ساعة بعد خلية البذر، إذا انضمت إلى ألواح البوليسترين زراعة الأنسجة (باﻻتصال)، نقل نوع الخلية المستخدمة بيوسكافولدس إلى بئر جديدة. خلاف ذلك، قم باستبدال المتوسط إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة.
10. تغيير بعناية وسائل الإعلام وفقا للمتطلبات المحددة لنوع الخلية.

النتائج

وينبغي تقييم كفاءة ديسيلولاريزيشن من خلال التقنيات الرئيسية الثلاثة: المراقبة العيانية، وعلم الأنسجة والكمي الحمض النووي. ويؤثر العيانية مظهر عينات بوست--الحزب الديمقراطي الصربي العلاج غير مباشر فعالية إزالة خلية. بعد حضانة الحزب الديمقراطي الصربي، يجب أن تظهر العينا?...

Discussion

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو meshwork ديناميكية للغاية ومعقدة من glycoproteins الليفي ولاصقة، تتكون من خزان من الببتيدات النشطة بيولوجيا وفخ النمو عوامل عديدة. المغير الرئيسية التصاق الخلايا وديناميات cytoskeleton، حركية والهجرة، وانتشار، والتمايز والمبرمج، تنظم إدارة المحتوى في المؤسسة بنشاط وظيفة ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker	Orbital Shakers	IKA:3510001	Recommended
Fluorimeter	-	-	Equipment available
Digital weight scale	-	-	Equipment available
Inverted Microscope	-	-	Equipment available
Cell culture incubator	-	-	Equipment available
Fridge (4ºC)	-	-	Equipment available
Deep freezer (-80ºC)	-	-	Equipment available
Microtome	-	-	Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	5000-08	Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox	Fine Science Tools	11254-20	Recommended
Dumont 7 forceps	Fine Science Tools	11272-30	Recommended
Dissecting Scissors, straight	-	-	Tool available
Forceps, serrated, curved	-	-	Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped	VWR	29442-044	-
96 well plates, individually wrapped	VWR	71000-078	-
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized	Millipore	SE1M179M6	-
Eppendorff	-	-	Material available
15 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430791	-
50 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430829	-
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid	Electron Microscopy Science	70075-B	-
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	22-037-246	-
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006	-
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)	Sigma-Aldrich	277258-1L	-
Dry ice	-	-	-
Decellularization
NaCl	BDH Prolabo	27810.364	-
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S-31264	-
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-100g	-
KCl	Sigma-Aldrich	P8041-1KG	-
TrisBASE	Sigma-Aldrich	T6066-500G	-
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L-4390	-
MgCl2	MERCK	1.05833.1000	-
DNAse I	AplliChem	A3778,0050	-
Gentamicin	Gibco	15710-049	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Histology
10 % formalin neutral buffer	Prolabo	361387P	-
Eosin Y AQUEOUS	Surgipath	01592E	Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	-
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous	Aga	4,006,02,02,00	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Clear Rite 3	Richard-Allan Scientific	6915	-
Shandon Histoplast	Thermo Fisher Scientific	RAS.6774006	-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	-
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit	Invitrogen	P11496	-
Cell culture
DPBS	VWR	45000-434	-
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Labclinics	L0022-100	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Cell culture media of the cell of interest	-	-	-