生体外研究における 3 D のようなプラットフォームとして胎児と成人の心筋組織を外植体の対等な Decellularization

要約

心臓の細胞外マトリックス (ECM) は、人生を通して生理学的な改造に耐えながら組織や臓器における主要なプロセスを調整する分子の複雑なネットワークです。胎児と大人の心の標準化された decellularization 3 D コンテキスト ネイティブ アーキテクチャと力学的特性をキャプチャすることにより両方の組織の比較実験が可能です。

要約

細胞外マトリックス (ECM) の現在のナレッジ-携帯通信は表面コーティングとして ECM コンポーネントを提示する、大規模な二次元 (2 D) 体外培養研究に変換します。これらの文化のシステムは、組織の生化学的組成、構造、および機械的性質を包含する ECM の複雑な性質の単純化を構成します。良い心臓の微小環境を形成 ECM 携帯通信をエミュレートする、我々 は全体胎児心臓の decellularization を可能にするプロトコルを開発した、大人の左心室の組織は同時に比較研究外植片します。プロトコルは、専門的なスキルや機器、洗剤は陰イオン界面活性剤と DNase 処理を必要とせず、低張バッファーの使用を組み合わせたものです。様々 な年齢の被験者から組織サンプルの間で同じ decellularization 戦略の応用は、比較研究を実行する別の方法です。この議定書は、胎児と成人心臓 ECM メッシュと生物細胞応答の間でユニークな構造的な違いの識別を許します。さらに、本方法論が人間の腸生検のマウス肺のなど他の組織のマイナーな調整と種正常に適用されて広範なアプリケーションを示します。

概要

細胞外マトリックス (ECM) は、すなわち運命決定、増殖と分化の^1,2の重要な細胞プロセスを調整する分子の動的ネットワークです。細胞外マトリクスの相互作用の調査を行った二次元 (2 D) ECM 成分でコーティングされた生体外の文化で、主に生体内で検出されたネイティブの ECM プロパティの単純化を構成します。Decellularization は、主細胞アーキテクチャとネイティブの組織と臓器^3,4の構成を保持する無細胞の 3 D のような ECM bioscaffolds を生成します。組織工学用生理活性足場として機能に加えて、3 D ECM 生体材料の脱は並列体内環境セル ECM 生物学を評価する新しいプラットフォームとして新たな。

明確な組織・器官・年齢の ECM 成分の差分の役割の評価でお越しの際にもネイティブの bioscaffolds を生成するのと同様のプロトコルを用いる。中心部に臓器微小環境の比較研究を実行する別の方法として胎児と大人由来サンプルの decellularization のための汎用プロトコルを開発した我々。この方法論を使用して、我々 はネイティブ心臓微小環境をキャプチャし、胎児の ECM が歩留まり心筋細胞⁵の再作成を促進することを示した。Decellularization はさらに地下板と細胞性のマトリックス メッシュ配置のレベルで胎児と成人の ECM と繊維組成⁵居住構造差の識別を提供しました。この作品の前に同じ decellularization アプローチを使用してさまざまな個体発生段階での組織の頭に頭の比較は、アカゲザルの腎臓および齧歯動物の心の報告されています。また、研究の限られた数は、胎児の組織・臓器 decellularization自体^5,6,7を報告します。これは、ユニークな decellularization エージェントとして SDS を使用して達成されています。ただし、個別の SDS の濃度は胎児と成人の心臓組織^7,8decellularization の使用されました。SDS は細胞質と核物質のクリアランスのための最も効果的な界面活性剤の一つと広く異なる組織と標本^9,10の decellularization で。タンパク質変性、グリコサミノグリカン (Gag) の損失とコラーゲン線維の^10、11の中断に関連したソリューション高 SDS 濃度と曝露の長期間を含むため、ECM の保全と細胞の除去のバランスが必要です。胎児と成人の心臓組織に、同じ手順を適用する記載プロトコルは 3 つの連続したステップに分けられる: 高浸透圧刺激 (低張バッファー) を用いた細胞の換散脂質タンパク質、DNA 蛋白質および蛋白質蛋白質の相互作用 (0.2 %sds); の可溶化・原子力材料除去 (DNase 処理)。

我々 のプロトコルは、いくつかの利点を示しています: 私) 同じ decellularization 戦略のアプリケーションによる年齢固有心筋組織の等価 decellularization の可能性特殊な方法または装置; ii) の要件iii) 人間の腸生検¹²マウス肺¹³; のマイナーな変化と正常が適用されて、他の組織および種への適応を準備します。重要なは、iv) 3 D のような切片文化詳細は密接にネイティブの組織微小環境の分子の機能を模倣のアセンブリを可能にしながら ECM の力学的特性に対応できます。

プロトコル

記載されているすべての方法論は、i3 の s 動物倫理委員会および Direção ジェラール山脈 de によって承認された Veterinária (DGAV) とに従い、欧州議会指令 2010年/63/EU。

1 decellularization 溶液の調製

注: すべての decellularization ソリューションを 0.22 μ m のメンブラン フィルターで濾過し、を除く 3 ヶ月の最大値の格納する必要があります指定。

1. 1 × PBS のため: Na₂HPO₄ KCl、200 mg の 1.01 g, 塩化ナトリウム 8 g を混ぜると 900 mL の脱イオン水 (純水) と KH₂PO₄の 200 mg。1 l. フィルター、オートクレーブ、および保管常温 (RT) ソリューションを pH 7.5、最終的な解決のボリュームを調整します。
2. 低張性のバッファー (10 mM トリス、0.1 %edta): 1.21 g TrisBASE と EDTA 脱イオン水 900 mL に 1 g を溶解します。水酸化ナトリウム/塩酸で 7.8 に pH と 1 l. フィルターに最終的な解決策ボリュームを調整、オートクレーブによる滅菌、室温保存
3. SDS 溶液の 0.2% (0.2 %sds、10 mM Tris): DI 水 400 mL に 0.6 g TrisBASE のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 1 g を追加し、完全な溶質溶解まで 60 ° C で攪拌します。RT。 調整 pH 7.8 にして 500 mL に最終的な解決の容積を冷却するソリューションをしましょう。ソリューションをろ過滅菌します。
   注: SDS ソリューションを使用する前に準備する必要があります。フィルター ソリューション後にのみ完全 SDS 溶解、それ以外の場合 SDS の不溶性粒子は、フィルター、最終の SDS の濃度を変更して、その結果組織 decellularization の効率に影響を与えるを飽和状態になり。
4. 低張性の洗浄バッファー (10 mM Tris): 水 900 ml ・ ディ ・ TrisBASE の 1.21 g を混ぜます。7.8 に pH、1 l. フィルターに最終的な音量を調整、オートクレーブによる滅菌、室温保存
5. DNase 処理 (20 mM 2 mM MgCl₂、トリス 50 U/mL DNase): 2.42 g TrisBASE と 1 M MgCl₂ ・ ディ ・水 900 mL に 2 mL を溶かします。PH 7.8 と 1 l. フィルターに最終的な解決の容積を調整し、オートクレーブによる溶液を滅菌します。RT。 追加 DNase 溶液を保存私 (50 U/mL) 使用前に。
6. DNase の私在庫ソリューション: 20 mM トリス塩酸 pH 7.5、1 mM MgCl₂, 50% グリセロールを含んで DNase バッファーを準備し、DI 水で 10 mL の最終的な解決の容積に。層流フードの DNase 私は DNase バッファーに粉体し、完全解散まで優しくミックスを追加します。0.22 μ m のフィルターを通してソリューションを滅菌します。1 ml を準備し、-20 ° C で保存

2. 組織採取し、凍結保存

1. CO₂窒息経由 (E18 胎児) 胎齢 18 日に妊娠した雌成虫を安楽死させます。外科はさみを持つ女性の帝王を実行し、子宮角の曲面のヒント (ホルンの各端に 1 つピンセット) と 2 つの鋸歯状ピンセットを使用して冷たい 1x PBS でシャーレに胎児のマウスを軸受を収集します。
   1. 子宮角を開き、羊膜嚢、胎仔を隔離します。それらを麻酔し、ハサミで首を切る冷たい 1x PBS で新しいペトリ皿に胎児を転送します。
   2. CO₂窒息を使用して 7-8 週古い男性 c57bl/6 マウスを安楽死させます。各マウスの胸の切開を行い、心を収集します。
   3. 氷冷 1x PBS で胎児と成人の心を簡単に洗い流してください。
2. メスの助けを借りて、成人の心臓の心房を削除します。右心室の切開を行い、まっすぐ小さなはさみを使用してそれを削除します。鼻中隔を削除することによって左心室内壁を公開します。新しいペトリ皿で 2 mm の厚さで縦方向のストリップでの左心室の自由-壁を分割し、湾曲した先端のメスと鋸歯状のピンセットを使用して乳頭筋を削除します。
   1. 2 mm x 2 mm グリッド (補足図 1⁵の詳細な説明) を使用してメスの助けを借りて、消費税ティッシュ植。簡単に 1 × PBS で組織を外植体を洗い流してください。
3. オートクレーブ 1.5 mL 遠心チューブに最適な切削温度 (OCT) 化合物の ~ 250 μ L を追加します。10 月の 250 μ L でチューブに全く胎児の心と大人の心臓植を転送し、ドライアイス冷却イソペンタンとストア-80 ° c (最長 6 ヶ月) にそれらを凍結します。
   注: 6 ヶ月以上凍結保存心筋外植片の使用軽減 decellularization 効率、特に成人の心臓組織植。

3. 組織 decellularization

注: 心臓組織 decellularization は、ウェルあたり 1 つのサンプルと 24 も組織培養プレートで実行されます。各 decellularization 溶液 1 mL は、個々 にも追加されます。Decellularization のすべての手順は、指定しない限り 165 rpm (インキュベーター シェーカー軌道直径 20 mm) で、25 ° C で撹拌で行わなければなりません。詳細については、図 1 aのスキームを参照してください。アムホテリシン B (例: fungizone) とゲンタマイシンたて、それぞれ 2.5 μ g/mL の 0.01 μ g/mL、最終濃度使用前にすべての decellularization ソリューションに追加されます。脱組織、decellularization プロトコルを開始する前に決定するサンプル大量ニーズに保持 DNA の量を計量。DNA の定量化のプロトコルはさらに詳細にセクション 5.1 です。

1. 1 日目
   1. -80 ° C のフリーザーから組織のサンプルを削除します。1.5 mL 遠心チューブまではのまま RT OCT になる部分的に溶けた。1x PBS でシャーレにまだ冷凍 10 月の心臓組織ブロックを転送します。
   2. OCT が溶け後、心臓組織を 1x PBS で新しいペトリ皿に移動します。1 PBS x と、10 ~ 15 分のシェーカー 60 rpm でのウォッシュ サンプルを 2 回以上繰り返します。
   3. 24 ウェル組織培養プレートのウェルあたり低張バッファーの 1 つの mL を追加します。鉗子の助けを借りてよくあたり 1 つのサンプルを転送します。
   4. 25 ° C でインキュベーター シェーカーにサンプル 24 ウェル培養プレートを移動、低張性のバッファーで 18 時間培養を始めます。
2. 2 日目
   1. セクション 1.3 で説明されているように、0.2 %sds の溶液を準備します。
   2. 低張性のバッファーを吸引し、1 h. を繰り返します 3 回の 1x PBS でサンプルを洗ってください。
      注: 一時停止ポイント: 静的な条件で 18 h の 4 ° C で 1 × PBS の decellularization の下で組織を保つことができます。
   3. 1 × PBS を削除たて SDS 溶液 (手順 1.3) ウェルあたり 1 mL を追加し、24 h のサンプルをインキュベートします。
      注: (チェック ポイント) ポスト SDS インキュベーション、サンプルが半透明の外観に白を示すことを確認します。この手順では、SDS が扱われるゼラチン状の一貫性を示す DNA サンプルがびっしょり。ピペット チップ サンプル接着を避けるためにゆっくりと SDS ソリューションを削除します。
3. 3 日目
   1. 20 分を繰り返し 3 回のサンプルは低張性洗浄バッファー (ウェルあたり 1 mL) を洗います。
      メモ: この手順では、それは正常です細胞残骸の除去によるサンプル サイズの減少を観察します。一時停止ポイント: decellularization 下の組織は低張性の洗浄バッファーの静的な条件で 18 h の 4 ° C で保存できます。
   2. ウェルあたり DNase 処理溶液の 1 mL を追加し、37 ° C で 3 時間サンプルをインキュベート
   3. DNase 処理液を吸引し、20 分を繰り返して 3 回 1 × PBS (ウェルあたり 1 mL) のサンプルを洗ってください。RT と 60 rpm で揺れに一晩 1 × PBS (ウェルあたり 1 mL) の最終的な洗浄を実行します。
   4. (チェックポイント)DNase 処理後、decellularized のサンプルがゼラチン状の一貫性を失っていることを確認します。
      注: DNase 処理後を削除し、サンプルすることができます簡単に陥れたし、ピペット チップに接続されているので、優しく 1x PBS を追加します。

4. 310 細胞除去の評価

1. 室温 1 mL の 2.5-3 h の 0.03% 水溶液エオシンたての 10% ホルマリン中性バッファーを追加して 24 ウェル培養プレート、好評につき、1 サンプルのサンプルを修正します。
   注: エオシン定着剤 decellularized の組織を染色して断面と組織染色中サンプルの可視化を容易にするために追加されます。どちらも妨害組織の汚れにも蛍光免疫測定法とエオシンの追加。また、固定は 4 ° C で一晩行うことが
2. 定着性のソリューションを削除し、1 mL のサンプルを洗う 1 × PBS を追加します。
3. 製造元の指示に従って使い捨てビニール片金型を使用した組織学処理ゲルで固定 bioscaffolds をカプセル化します。
4. ふた付け生検処理/埋め込みカセット金型転送から埋め込みサンプル組織ゲルを削除します。
   注: 組織組織に埋め込み、ゲルを処理する代わりに小さな孔を持つ 2 つの生検スポンジ内の各サンプルを処理することです。サンプルは、検出を有効にする生検スポンジの中央にローカライズする必要があります。注記のうち、いくつかのサンプルはこのアプローチを使用してローカライズ作業が困難にすることができます。
5. Isoparaffinic 脂肪族炭化水素ソリューション (2 潜伏駅) アルコール濃度 (70%、80%、90%、100%、100%) のシリーズで連続孵化 (ソリューションあたり 30 分) を埋め込むパラフィン、パラフィン (2 インキュベーションのためのサンプルを処理します。局) 56 ° C で
6. パラフィン ブロックのサンプルをマウントします。
7. ミクロトームで 3 μ m 厚パラフィン セクションをカットし、ガラス顕微鏡スライド上のセクションを収集します。
8. 37 ° C で一晩乾燥パラフィン切片
   メモ: (一時停止ポイント) パラフィン切片は、さらに使用するまで 4 ° C で保存されます。
9. プロトコルの効率を確認するには、Hematoxilin とエオシン (H & E) と脱サンプル セクションの製造元の指示に従って組織を非操作のセクションに (MT) を染色、マッソンの Trichrome を実行します。
   注: H & E 染色汚れ細胞核青/紫、細胞質濃いピンク/赤とコラーゲンの淡いピンクと MT 汚れ粘液とコラーゲン細胞質、赤核黒青。効率的な decellularization、時 (H & E、MT) 多孔質光ピンクとブルー (MT) ネットワークを観察すると、核の染色の不在で。

5. 310 核材料除去の評価

注: 310 の DNA 量の定量化は、それぞれ非操作組織と比較して実行する必要があります。

1. Decellularization、前に高精度デジタル スケールで 1.5 mL 遠心チューブの重量を量る。心臓の組織をチューブに転送、1 × PBS の余分な量を削除、サンプル チューブの重量を量る。サンプルの湿重量を計算します。
   サンプルの_湿重量= 重量_{サンプル管}-重量_空管
2. 手順 3 で説明したように、サンプルを decellularize します。
3. Decellularization 後、微量遠心チューブに decellularized 組織を収集します。
   1. 小さな寸法など個々 の心臓のサンプルやキット仕様の質量によりプールの各サンプル条件の脱組織 (胎児心拍数: 5 心; 大人 LV 植: 15 植)。非操作組織と同じ手順を実行します。
      注: サンプルがすることができます (一時停止ポイント) DNA の抽出と定量化を行うまでに-20 ° C で保存されます。
4. 非操作をカットし、クリーンなペトリ皿でメスの助けを借りて小さな植組織を脱します。
   注: は、各サンプルの個々 のメスとペトリ皿を使用します。サンプルはメスの機械的破壊彼らの後部の酵素消化と後続の DNA の抽出を促進します。
5. DNA の抽出の製造元の指示に従ってスピン列による DNA 抽出法を使用します。
   1. 広いオリフィスのピペット チップを使用して、製造元の指示に従ってマスター消化バッファー (消化バッファーおよびプロティナーゼ K) とシャーレから機械的に解離のサンプルを収集します。
      注: プロティナーゼ K 消化組織溶解は脱サンプルで高速です。同時に異なるサンプルを処理するには、すべてのサンプルは、劣化を最小限に抑えることによってまで氷の上分離のサンプルを保ちます。4-6 h の間完全なサンプルの溶解を実現します。
   2. 製造元の指示によるとプロトコルを続行します。
   3. 脱し、非脱組織サンプルの抽出 DNA の収量を増やすには、それぞれ 25 50 μ L、100 μ L の溶出バッファーの DNA を溶出します。溶出の DNA を収集し、スピン列を読み込みます。製造元の指示に従ってサンプルした遠心分離機で 1 分間インキュベートします。
      注: (一時停止ポイント) の DNA サンプルから抽出は、さらに使用するまで-20 ° C でストアをすることができます。
6. 製造元の指示に従って蛍光 dsDNA 検出キットのサンプルから抽出した DNA を定量化します。
7. (Decellularization) の前に、初期サンプルの湿重量のミリグラムあたり DNA のナノグラムとして DNA の内容を正規化します。

6. 脱足場の細胞播種

注: すべてのソリューション/試薬は、滅菌する必要があり、無菌状態で全体の手順を実行します。

1. 2.5 μ g/ml アムホテリシン B と 1% の 1 x DPBS の準備 P/S (100 i. u. のペニシリン; ストレプトマイシン 100 μ g/mL)。
2. 最後の decellularization 洗浄のステップ (ステップ 3.3.3) から PBS ソリューション x 1 を削除し、DPBS/2.5 μ g/mL アムホテリシン B/1% P/秒ソリューション x 作りたて 1 ウェルあたり 500 μ L を追加します。1-7 日から 4 ° c のサンプルを格納します。
   注: サンプル ストレージ 4 ° C では無菌性を維持することが重要です。
3. P/S を最終濃度 1% (FBS サプリメントも) 基底メディアをセルを追加します。
4. アムホテリシン B/1% P/秒ソリューション decellularized のサンプルからの DPBS/2.5 μ g/mL x 1 を吸い出しなさい。細胞基底 media/1% P/S の井戸あたり 500 μ L を追加し、37 ° c、または 1 時間以上のための 4 ° C で 1 時間平衡のサンプル。
5. 興味のセルを分割し、必要に応じて細胞密度の細胞の小さい因数を準備します。
   注: は、実体顕微鏡下で、無菌状態で実行する 310 播種する必要があります。細胞培養媒体は 1% を含める必要があります P/s.
6. 96 ウェル プレートの井戸の中心に DPBS の 3-4 μ L をピペットします。薄くてストレート ピンセットを使用して、DPBS ドロップする decellularized の足場を転送、吸引、余分な DPBS を削除およびサンプルの折り返しやしわはしないでください。よく表面に付着するエッジでドライになること。
   注: 戸建足場下播種効率があります。
7. 井戸の端にゆっくりと単一細胞液を分注して足場にセルを追加します。
   注: たとえば、ラット新生児心筋細胞がシードで 7,500 セル/mm²と不死化マウスの密度で林⁻ Sca 1⁺心臓前駆細胞 (iCPC^{Sca 1}) 60-1,500 セル/mm²の密度で。実験的根拠によると細胞密度を調整します。
8. 高速メディアの蒸発を避けるために近隣の井戸に DPBS を追加します。
9. 24 時間投稿細胞播種、使用セル型培養ポリスチレン板 (TCP) に付着した新しい井戸に bioscaffolds を転送します。そうでなければ、非付着性のセルを削除する媒体を交換します。
10. セルの種類の特定の要件に従ってメディアを慎重に変更します。

結果

Decellularization の効率は 3 つの主要技術が評価されるべき: 肉眼、組織学、DNA の定量化。サンプル ポスト SDS の処置の肉眼は、細胞の除去の効果があることを直接に影響します。SDS インキュベーション後サンプルが白っぽい (図 1) に半透明で表示されます。胎児 (E18) 大人植を半透明白色の外観を持っている組織の脱は半透明度が高い構造によっ?...

ディスカッション

細胞外マトリックス (ECM) は多数の生理活性ペプチドと成長因子の内包された貯留層から成る繊維と接着剤の糖蛋白質の非常に動的かつ複雑な網目です。細胞接着、細胞骨格のダイナミクス、運動/移行、増殖、分化、アポトーシスの重要な変調器として ECM は積極的に細胞機能および行動を調整します。2 D と 3 D の文化で細胞挙動が異なることを知ること、自然な組織環境を正確に複製するこ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker	Orbital Shakers	IKA:3510001	Recommended
Fluorimeter	-	-	Equipment available
Digital weight scale	-	-	Equipment available
Inverted Microscope	-	-	Equipment available
Cell culture incubator	-	-	Equipment available
Fridge (4ºC)	-	-	Equipment available
Deep freezer (-80ºC)	-	-	Equipment available
Microtome	-	-	Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	5000-08	Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox	Fine Science Tools	11254-20	Recommended
Dumont 7 forceps	Fine Science Tools	11272-30	Recommended
Dissecting Scissors, straight	-	-	Tool available
Forceps, serrated, curved	-	-	Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped	VWR	29442-044	-
96 well plates, individually wrapped	VWR	71000-078	-
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized	Millipore	SE1M179M6	-
Eppendorff	-	-	Material available
15 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430791	-
50 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430829	-
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid	Electron Microscopy Science	70075-B	-
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	22-037-246	-
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006	-
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)	Sigma-Aldrich	277258-1L	-
Dry ice	-	-	-
Decellularization
NaCl	BDH Prolabo	27810.364	-
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S-31264	-
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-100g	-
KCl	Sigma-Aldrich	P8041-1KG	-
TrisBASE	Sigma-Aldrich	T6066-500G	-
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L-4390	-
MgCl2	MERCK	1.05833.1000	-
DNAse I	AplliChem	A3778,0050	-
Gentamicin	Gibco	15710-049	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Histology
10 % formalin neutral buffer	Prolabo	361387P	-
Eosin Y AQUEOUS	Surgipath	01592E	Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	-
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous	Aga	4,006,02,02,00	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Clear Rite 3	Richard-Allan Scientific	6915	-
Shandon Histoplast	Thermo Fisher Scientific	RAS.6774006	-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	-
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit	Invitrogen	P11496	-
Cell culture
DPBS	VWR	45000-434	-
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Labclinics	L0022-100	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Cell culture media of the cell of interest	-	-	-