Сопоставимых Decellularization плода и взрослых сердечной ткани эксплантов как 3D-как платформы для в исследованиях in Vitro

Резюме

Сердца внеклеточная матрица (ECM) является сложной сети молекул, которые оркестровать ключевых процессов в органах и тканях при Несокрушимая физиологических ремоделирования на протяжении всей жизни. Стандартизированные decellularization плода и взрослых сердец позволяет сравнительные экспериментальные исследования обеих тканей в условиях 3D, захватив родной архитектуры и биомеханических свойств.

Аннотация

Текущий набор знаний внеклеточного матрикса (ECM)-сотовой связи переводится большой двухмерный (2D) в пробирке культуры исследования, где представлены компоненты ECM как покрытие поверхности. Эти культуры системы представляют собой упрощение сложного характера ECM, которая охватывает биохимического состава, структуры и механических свойств ткани. Чтобы лучше подражать ECM-сотовой связи, формирование сердца микроокружения, мы разработали протокол, который позволяет для decellularization сердца всего плода и ткани взрослых левого желудочка эксплантах одновременно сравнительных исследований. Протокол сочетает в себе использование гипотонический буфера, моющее средство анионное ПАВ свойств и DNase лечения без какого-либо требования для специальных навыков или оборудования. Применение той же стратегии decellularization через образцы тканей от субъектов различного возраста является альтернативный подход для проведения сравнительных исследований. Настоящий Протокол позволяет выявление уникальных структурных различий между плода и взрослых сердца ECM сетки и биологического клеточных реакций. Кроме того здесь методологии демонстрирует более широкое применение, успешно применяется в других тканях и видов с незначительными изменениями, таких как в человеческой кишечника биопсии и мыши легких.

Введение

Внеклеточная матрица (ECM) является динамичной сети молекул, которые регулируют важные клеточные процессы, а именно судьба решение, пролиферации и дифференцировки^1,2. Исследование взаимодействий клеток ECM была проведена главным образом в двухмерный (2D) в vitro культур, покрытые компоненты ECM, которые представляют собой упрощение родной ECM, найденных в естественных условиях. Decellularization генерирует бесклеточной ECM 3D-как bioscaffolds, который во многом сохранить внеклеточного архитектуры и состава собственных тканей и органов^3,4. В дополнение к качестве биоактивные подмости для тканевой инженерии, decellularized 3D ECM биоматериалов появляются как Роман платформы для оценки биологии клетки ECM параллельных в естественных условиях окружающей среды.

Оценки дифференциальной роли компонентов ECM различных тканей, органов и возраста принесет пользу с использованием аналогичных протоколов генерации родной bioscaffolds. В самом сердце мы разработали универсальный протокол для decellularization плода и взрослого, полученных образцов, в качестве альтернативного подхода для проведения сравнительных исследований орган микроокружения. С использованием этой методологии, мы захватили собственного сердца микроокружения и показал, что плода ECM способствует повышению урожайности заселение сердечной клетки⁵. Decellularization представлена дополнительная идентификация резидентов структурных различий между плода и взрослых ECM на уровне механизма, подвал пластинки и околоклеточного сетки матрицы и волокна состав⁵. До этой работы голова к голове сравнения тканей на разных этапах онтогенезе, используя тот же подход decellularization сообщалось только резус почек и сердца грызунов. Кроме того ограниченное количество исследований сообщают плода ткани/орган decellularization per se^5,6,7. Это было достигнуто с помощью SDS как уникальный decellularization агент; Однако собственный SDS концентрации были использованы для decellularization плода и взрослых сердечной ткани^7,8. SDS является одним из наиболее эффективных ионных моющих средств для разминирования цитоплазмы и ядерных материалов и широко используется в decellularization различных тканей и образцы^9,10. Растворы, содержащие высокие концентрации SDS и длительного воздействия были связаны с денатурации белков, потеря Глюкозаминогликан (GAGs) и нарушение фибрилл коллагена^10,11и поэтому необходим баланс между удаления сохранение и клеток ECM. Чтобы применить ту же процедуру для ткани сердца плода и взрослых, протокол, описанные здесь делится на три последовательных этапа: сотовый лизис по осмотическим шоком (гипотоническая буфера); солюбилизация липидов белков, ДНК белковых и белок белковых взаимодействий (0,2% SDS); и удаления ядерного материала (DNase лечение).

Наш протокол показывает несколько преимуществ: я) возможность эквивалент decellularization возрасту сердечной ткани путем применения одной и той же стратегии decellularization; II) никаких требований для специализированных методов или средств; III) готовы адаптации для других видов тканей и как она успешно применялась с небольшими изменениями в человеческой кишечника биопсий¹² и мыши легких¹³; и, главное, iv) может адресовать ECM биомеханических свойств позволяя Ассамблея 3D-как organotypic культур, что более тесно имитировать молекулярные особенности родной ткани микроокружения.

протокол

Все описанные методологии были одобрены i3S Комитета по этике животных и Direção Geral де Veterinária (DGAV) и находятся в соответствии с Европейским парламентом Директива 2010/63/ЕС.

1. Приготовление растворов decellularization

Примечание: Все decellularization решения следует фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм и хранить не более 3 месяцев, за исключением указано иное.

1. Для ПБС: смесь 8 г NaCl, 1.01 g Na₂HPO₄ 200 мг хлористого калия и 200 мг х₂PO₄ 900 мл деионизированную воду (ди). Отрегулируйте раствор pH 7.5 и окончательное решение объем до 1 л фильтр, автоклавы и магазина решение при комнатной температуре (RT).
2. Гипотонический буфера (10 мм трис, 0.1% ЭДТА): растворить 1,21 г TrisBASE и 1 г ЭДТА в 900 мл деионизованной воды. Отрегулируйте раствор pH 7,8 с NaOH/HCl и окончательное решение объемом 1 л фильтр, стерилизовать в автоклаве и хранить на RT.
3. Для SDS 0,2% раствор (0,2% SDS, 10 мм Tris): добавить 0,6 г TrisBASE и 1 g додецилового сульфата натрия (SDS) в 400 мл воды ди и перемешать до полного растворения вещества при температуре 60 ° C. Пусть решение остыть до RT. Adjust раствор pH 7,8 и окончательное решение объемом до 500 мл. Стерилизуйте решения путем фильтрации.
   Примечание: Решение ПБ должен быть подготовлен до использования. Фильтр решение только после завершения ИКБ роспуске, иначе SDS нерастворимых частиц будет насыщать фильтр, изменив конечная концентрация SDS и следовательно влияющих на эффективность decellularization ткани.
4. Гипотонический мыть буфера (10 мм Tris): смесь 1,21 г TrisBASE в 900 мл ди воды. Отрегулируйте раствор pH 7,8 и окончательный объем до 1 л фильтр, стерилизовать в автоклаве и хранить на RT.
5. Для лечения DNase (20 мм трис, 2 мм MgCl₂, 50 ед/мл DNase): растворить 2.42 g TrisBASE и 2 мл 1 М MgCl₂ 900 мл воды ди. Скорректировать рН 7,8 и окончательное решение объемом 1 л фильтр и стерилизовать решение в автоклаве. Хранят раствор на RT. Добавить DNase I (50 ед/мл) перед использованием.
6. Для DNase я складе решение: подготовить DNase буфер, содержащий 50% глицерина, 20 мм трис-HCl рН 7,5, 1 мм₂MgCl и приспособиться к окончательного решения объемом 10 мл с ди водой. Ламинарный шкаф добавьте DNase I порошок DNase буфер и осторожно перемешать до полного растворения. Стерилизуйте решение через 0,22 мкм фильтр. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.

2. ткань уборка и криоконсервацию

1. Усыпить беременных самок на 18 дней гестации (E18 плодов) через удушение CO₂ . Выполнения кесарева сечения на самок с хирургические ножницы и собирать маточные рожки, принимая плода мышей к чашке Петри с ледяной 1 x PBS с помощью двух зубчатыми пинцета с изогнутой советы (один пинцет к каждому концу рога).
   1. Откройте маточные рожки и Амниотический мешок изолировать плодов. Передача плодов в новой Петри блюдо с ледяной ПБС анестезировать их и обезглавить с ножницами.
   2. Усыпить 7-8 недель мужчины C57BL/6 мышей с использованием CO₂ удушья. Выполните надрез на каждой мыши груди и собирать сердца.
   3. Кратко промойте плода и взрослых сердец с лед холодной ПБС.
2. Удаление предсердия взрослых сердца с помощью скальпеля. Выполните надрез на правый желудочек и удалить его с помощью прямо маленькие ножницы. Подвергайте внутренней стенки левого желудочка, удалив перегородки. В новом Петри разделите бесплатно левый желудочек стены в продольные полоски толщиной 2 мм и удалить папиллярных мышц с помощью скальпеля и зубчатыми пинцет с изогнутыми концами.
   1. Акцизный небольшой ткани эксплантов с помощью скальпеля с помощью сетки 2 мм х 2 мм (подробное описание в дополнительных 1 рисунок⁵). Кратко прополощите ткань эксплантов с ПБС.
3. Мкл ~ 250 оптимального раскроя температуры (OCT) соединение для газобетона 1.5 мл пробирок microcentrifuge. Передаче всего плода сердца и взрослых сердца эксплантов трубки с 250 мкл OCT и заморозить их с сухим льдом с жидкостным охлаждением изопентана и хранить на-80 ° C (максимум 6 месяцев).
   Примечание: Использование эксплантов сердечной ткани криоконсервированных для более чем 6 месяцев существенно снизит эффективность decellularization, особенно в эксплантов ткани взрослых сердце.

3. ткань decellularization

Примечание: Сердечной ткани decellularization производится в 24-ну тканевые культуры плита с одной пробы в колодец. 1 мл раствора каждого decellularization добавляется к каждому хорошо. Все decellularization шаги должны быть выполнены с агитация на 165 об/мин (шейкер инкубатор с орбитальной диаметром 20 мм) и при 25 ° C, если не указано иное. Для более подробной информации обратитесь к схеме на рисунке 1A. Амфотерицин B (например , fungizone) и гентамицин свежезаваренным добавляются ко всем решениям decellularization перед использованием до конечной концентрации 2,5 мкг/мл и 0,01 мкг/мл, соответственно. Чтобы подсчитать количество ДНК сохраняется в decellularized тканях, образец массовые потребности будут определены до начала decellularization протокола. Протокол количественного определения ДНК является далее подробно говорится в разделе 5.1.

1. ДЕНЬ 1
   1. Удаление образцов ткани из морозильной камеры-80 ° С. Оставьте по 1,5 мл microcentrifuge трубы на RT, до тех пор, пока Окт становится частично расплавленный. Сердечной ткани блок все еще замороженных OCT передачи в чашке Петри с ПБС.
   2. После октября расплавов, переместите сердечной ткани нового Петри с ПБС. По крайней мере дважды повторить стирки образцов в 1 x PBS и при 60 об/мин с шейкер на 10-15 мин.
   3. Добавьте 1 mL работы гипотонический буфера за хорошо плиты стерильные 24-ну тканевые культуры. Передача одного образца на хорошо с помощью щипцов.
   4. Переместить пластину 24-ну тканевые культуры с образцами в шейкер инкубатор при 25 ° C и начать 18 ч инкубации с гипотонический буфера.
2. ДЕНЬ 2
   1. Приготовляют раствор 0,2% SDS, как описано в разделе 1.3.
   2. Аспирационная гипотонический буфера и стирать образцы с ПБС за 1 ч. Повторите 3 раза.
      Примечание: Пауза точка: ткани под decellularization может храниться в однократном ПБС на 4 ° C для 18 h в статических условиях.
   3. Удаление ПБС, добавить 1 мл свежеприготовленной SDS раствора (шаг 1.3) в хорошо и Проинкубируйте образцы за 24 ч.
      Примечание: Пост SDS (CHECK POINT) инкубации, убедитесь, что образцы exhibit белый полупрозрачный вид. На этом шаге рассматривается SDS образцы залитые в ДНК, показаны консистенцию желатина как. Удаление решения SDS медленно, чтобы избежать прилипания образец к кончику дозатор.
3. ДЕНЬ 3
   1. Мыть образцы с гипотонический мыть буфера (1 мл на хорошо) для 20 минут повторите 3 раза.
      Примечание: На данном этапе, это нормально для наблюдать уменьшение размера выборки за счет удаления остатков клеток. ПАУЗЫ точка: Ткани под decellularization может храниться в гипотонический мыть буфера на 4 ° C для 18 h в статических условиях.
   2. Добавить 1 мл раствора DNase лечения в колодец и Проинкубируйте образцы для 3 ч при 37 ° C.
   3. Аспирационная DNase лечение решение и стирать образцы с ПБС (1 мл на хорошо) для 20 минут повторите 3 раза. Выполните окончательный промыть ПБС (1 мл на хорошо) на ночь в RT и тряски на 60 об/мин.
   4. (КПП) После лечения DNase убедитесь, что decellularized образцы потеряли желатин как последовательности.
      Примечание: После лечения DNase, удалить и добавить ПБС осторожно, поскольку образцы могут быть легко захваченного и прилагается к кончику дозатор.

4. Оценка decellularized ткани клеток удаления

1. Исправить образцы в 24-ну культуры ткани пластины, 1 образец в колодец, добавив 1 мл свежеприготовленной формалина 10% нейтральные буфера с 0,03% водного раствора эозина для 2,5-3 ч в рт.
   Примечание: Эозина добавляется фиксатором пятно в decellularized ткани и для облегчения визуализации образца при резании и гистологической пятнать. Добавление эозином, который не мешает с гистологическим пятна ни с иммунофлюоресценции методов. Кроме того фиксация может быть выполнена на ночь при 4 ° C.
2. Удалите фиксирующие решения и добавьте 1 mL ПБС мыть образца.
3. Инкапсуляции фиксированных bioscaffolds в гистологии обработки гель с использованием образца формы Одноразовые виниловые согласно инструкциям производителя.
4. Удалите гистология гель с образцом, встроенные от плесени и передачи для биопсии обработки/Embedding кассет с крышкой.
   Примечание: Альтернативой ткани встраивания в гистологии и обработки гель является для обработки каждого образца в двух биопсии губки с мелкие поры. Образцы должно быть локализовано в центр биопсии губки для обнаружения. Следует отметить некоторые образцы могут быть трудно локализовать с помощью этого подхода.
5. Обработка образцов для парафина, встраивание через последовательные инкубаций (30 мин на решение) в серии концентраций алкоголя (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), решение Изопарафиновые алифатических углеводородов (2 инкубации станции) и парафина (2 инкубации станции) на 56 ° C.
6. Установите образцы в блоке парафина.
7. Вырежьте 3 мкм густой парафин секции на микротом и собирать разделы на стеклянных скольжениях микроскопа.
8. Сухой парафиновых срезах в одночасье в 37 ° C.
   Примечание: Разделы парафина (пауза точка) хранятся при температуре 4 ° C до дальнейшего использования.
9. Чтобы проверить эффективность протокола, выполняют Hematoxilin и эозином (H & E) и Массон Trichrome окрашивание (MT) decellularized образец секций и секций не манипулировать ткани согласно инструкциям производителя.
   Примечание: H & E пятнать пятна ячейки ядер голубой/пурпурный, цитоплазма темно розовый/красный и коллаген бледно розовый и MT пятна ядер черный, красный, цитоплазма и коллагена и муцина синий. Эффективное decellularization достигается при пористой светло-розовый (H & E, MT) и синий (MT) сети наблюдается, в отсутствие ядерных пятно.

5. Оценка decellularized ткани удаления ядерного материала

Примечание: Количественная оценка содержания ДНК на decellularized ткани должны быть выполнены по сравнению с соответствующими не манипулировать ткани.

1. Перед decellularization весить 1.5 мл microcentrifuge на высокой точностью цифровой шкале. Передать трубку сердечной ткани, удалить дополнительное количество ПБС и весят трубки с образцами. Вычислите сырого веса образцов:
   Образец_{живого веса} = вес _{трубки с образцами} – вес _{пустой трубки}
2. Decellularize образцы, как описано в шаге 3.
3. После decellularization собирают decellularized тканям в пробки microcentrifuge.
   1. Из-за малых размеров и массы отдельных сердца образцов и комплект характеристики, бассейн decellularized тканей состояния каждого образца (сердца плода: 5 всего сердца; Взрослый эксплантов LV: 15 эксплантов). Выполните ту же процедуру с ткани-манипулировали.
      Примечание: (Пауза точка) образцы можно хранить при температуре от-20 ° C до тех пор, пока выполняются экстракции ДНК и количественной оценки.
4. Вырезать, не манипулируют и decellularized тканей в небольших эксплантов с помощью скальпеля в чистой Петри.
   Примечание: Использование индивидуальных скальпель и Петри для каждого образца. Механическое разрушение образцов с помощью скальпеля облегчает их задней ферментативного пищеварения и последующего извлечения ДНК.
5. Для экстракции ДНК используйте метод экстракции ДНК спин столбца на основе согласно инструкциям производителя.
   1. Соберите механически диссоциированных образцы от Петри с буфером мастер пищеварения (буфер пищеварение и протеиназы K) согласно инструкциям производителя с помощью кончика пипетки широкие отверстия.
      Примечание: Лизис ткани с пищеварением протеиназы K быстре в decellularized образцах. Для обработки различных образцов в то же время, держите лизированных образцы на льду, до тех пор, пока все образцы будут анализироваться для сведения к минимуму деградации. Полные примеры лизис достигается между 4-6 ч.
   2. Продолжите с протоколом, в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Для повышения урожайности ДНК образцов decellularized и не decellularized ткани, элюировать ДНК на 25-50 мкл и 100 мкл буфера, соответственно. Собирать eluted дна и загрузить спин столбец. Инкубируйте 1 мин на RT. центрифуги образцах в соответствии с инструкциями производителя.
      Примечание: (Пауза точка) ДНК, извлеченные из образцы можно хранить при-20 ° C до дальнейшего использования.
6. Количественного определения ДНК от образцов с комплектом обнаружения флуоресцентные dsDNA следуя инструкциям производителя.
7. Нормализуют содержание ДНК как нг ДНК на миллиграмм сырого веса исходного образца (до decellularization).

6. decellularized Подмости мобильные посева

Примечание: Все решения/реагенты должны быть стерильными и вся процедура выполняется в стерильных условиях.

1. Подготовка 1 x DPBS с 2,5 мкг/мл, амфотерицин B и 1% P/S (пенициллин, 100 И.Ю; этамбутол 100 мкг/мл).
2. Удаление 1 x PBS решение из последнего шага Стиральная decellularization (шаг 3.3.3) и добавьте 500 мкл на хорошо свежеприготовленные 1 x DPBS/2,5 мкг/мл раствора B/1% P/S амфотерицин. Хранить образцы на 4 ° C от 1-7 дней.
   Примечание: Примеры хранения при температуре 4 ° C имеет важное значение для поддержания стерильности.
3. Добавьте P/S в ячейку базальной СМИ (без FBS и добавки) до конечной концентрации 1%.
4. Аспирационная 1 x DPBS/2,5 мкг/мл раствора B/1% P/S амфотерицин от decellularized образцов. Добавьте 500 мкл на хорошо клеток базальной media/1% P/S и пусть образцы сбалансировать за 1 ч при 37 ° C, или на 4 ° C для более чем 1 час.
5. Разделение клетки интереса и подготовить небольшой аликвоты клеток на плотность клеток желаемого.
   Примечание: Заполнение decellularized ткани должны выполняться под стереоскопическим микроскопом и в стерильных условиях. Средства массовой информации культуры клеток должен содержать 1% P/S.
6. Пипетка мкл 3-4 DPBS в центр хорошо 96-луночных плиты. С помощью пинцета тонкий и прямой передачи decellularized леса на DPBS падение, удалите дополнительные DPBS, стремление и убедитесь, что образец не сложить или морщинистой. Пусть это станет сухой на краях присоединиться к поверхности хорошо.
   Примечание: Частные леса имеют меньше посева эффективность.
7. Добавление ячеек на эшафот, закупорить одноклеточных раствор медленно против края колодца.
   Примечание: например, новорожденных крыс кардиомиоцитов семенами с на плотности 7500 клеток/мм² и увековечен мыши Линь⁻ Sca-1⁺ сердечной клетки-предшественники (МЦПП^Sca-1) на плотность 60-1500 клеток/мм². Отрегулируйте согласно экспериментальное обоснование плотность клеток.
8. Добавьте DPBS в соседних скважин, чтобы избежать испарения быстро СМИ.
9. 24 часа после заполнения ячейки, если используется тип ячейки придерживаться культуры ткани пенополистирольные плиты (ПТС), передать новой скважины bioscaffolds. В противном случае замените средство для удаления не сторонник клеток.
10. Измените тщательно СМИ согласно конкретным требованиям типа ячейки.

Результаты

Decellularization эффективность должна оцениваться посредством трех основных методов: макроскопический наблюдения, гистология и количественного определения ДНК. Макроскопические появление лечение пост SDS образцов косвенно влияет на эффективность удаления клеток. После ин?...

Обсуждение

Внеклеточная матрица (ECM) является весьма динамичного и сложного сеть волокнистых и клей гликопротеинов, состоящий из водохранилища многочисленные биоактивные пептиды и зависшие факторов роста. Как основных модулятором клеточной адгезии, Цитоскелет динамики, моторики и миграцией, ра?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker	Orbital Shakers	IKA:3510001	Recommended
Fluorimeter	-	-	Equipment available
Digital weight scale	-	-	Equipment available
Inverted Microscope	-	-	Equipment available
Cell culture incubator	-	-	Equipment available
Fridge (4ºC)	-	-	Equipment available
Deep freezer (-80ºC)	-	-	Equipment available
Microtome	-	-	Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	5000-08	Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox	Fine Science Tools	11254-20	Recommended
Dumont 7 forceps	Fine Science Tools	11272-30	Recommended
Dissecting Scissors, straight	-	-	Tool available
Forceps, serrated, curved	-	-	Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped	VWR	29442-044	-
96 well plates, individually wrapped	VWR	71000-078	-
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized	Millipore	SE1M179M6	-
Eppendorff	-	-	Material available
15 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430791	-
50 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430829	-
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid	Electron Microscopy Science	70075-B	-
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	22-037-246	-
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006	-
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)	Sigma-Aldrich	277258-1L	-
Dry ice	-	-	-
Decellularization
NaCl	BDH Prolabo	27810.364	-
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S-31264	-
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-100g	-
KCl	Sigma-Aldrich	P8041-1KG	-
TrisBASE	Sigma-Aldrich	T6066-500G	-
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L-4390	-
MgCl2	MERCK	1.05833.1000	-
DNAse I	AplliChem	A3778,0050	-
Gentamicin	Gibco	15710-049	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Histology
10 % formalin neutral buffer	Prolabo	361387P	-
Eosin Y AQUEOUS	Surgipath	01592E	Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	-
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous	Aga	4,006,02,02,00	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Clear Rite 3	Richard-Allan Scientific	6915	-
Shandon Histoplast	Thermo Fisher Scientific	RAS.6774006	-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	-
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit	Invitrogen	P11496	-
Cell culture
DPBS	VWR	45000-434	-
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Labclinics	L0022-100	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Cell culture media of the cell of interest	-	-	-