胎儿和成人心脏组织外植体作为三维体外研究平台的可比较去角质

摘要

心脏细胞外基质 (ECM) 是一个复杂的分子网络, 它在组织和器官中协调关键的过程, 同时在一生中忍受生理重塑。通过捕获原生建筑和生物力学特性, 胎儿和成人心脏的标准化去细胞化允许在三维环境中对这两个组织进行比较实验研究。

摘要

目前对细胞外基质 (ECM)-细胞通信的了解转化为大型二维 (2D) 体外培养研究, 其中 ECM 成分被显示为表面涂层。这些培养系统简化了组织 ECM 的复杂性, 包括生化成分、结构和机械性能。为了更好地模拟塑造心脏微环境的 ecm 细胞通讯, 我们开发了一个协议, 允许整个胎儿心脏和成人左心室组织外植体同时进行比较研究。该协议结合了使用低渗缓冲液, 阴离子表面活性剂的洗涤剂, 和 DNase 处理, 而不需要任何专门的技能或设备。在不同年龄的受试者的组织样本中应用相同的去细胞化策略是进行比较研究的另一种方法。目前的协议允许识别胎儿和成人心脏 ECM 网格和生物细胞反应之间的独特结构差异。此外, 本文的方法表明, 更广泛的应用正在成功地应用于其他组织和物种与轻微的调整, 如在人类肠道活检和小鼠肺。

引言

细胞外基质 (ecm) 是一个动态的分子网络, 调节重要的细胞过程, 即脂肪决定, 增殖和分化¹,²。细胞-ecm 相互作用的研究主要是在具有 ECM 成分的二维体外培养体中进行的, 这简化了体内发现的原生 ecm 特性。去减细胞化产生无细胞3d 样 ecm 生物咖啡因, 在很大程度上保留细胞外结构和原生组织和器官的组成 3^,4。除了作为组织工程的生物活性支架外, 脱细胞化的三维 ECM 生物材料也正在成为评估与体内环境平行的细胞-ecm 生物学的新平台。

评估不同组织、器官和年龄的 ECM 成分的差异作用将受益于使用产生本地生物咖啡因的类似协议。在心脏, 我们已经开发了一个多功能的方案去细胞化的胎儿和成人衍生的样本, 作为一个替代的方法, 进行比较研究的器官微环境。利用这种方法, 我们捕获了本地心脏微环境, 并表明胎儿 ECM 促进更高的心脏细胞5的再繁殖产量^.去渗进一步确定了胎儿和成人 ECM 在基底层和周细胞基质网排列和纤维成分5水平上的常驻结构差异^.在这项工作之前, 使用相同的去细胞化方法对不同大生阶段的组织进行面对面的比较, 只报告了恒河猴肾脏和啮齿类动物的心脏。此外, 数量有限的研究报告胎儿组织/器官去细胞化本身^5,6,7。这是利用安全数据单作为一种独特的去电磁化剂实现的;然而, 不同的 sds 浓度被用于胎儿和成人心脏组织的去病毒化^7,8。sds 是用于清除细胞质和核材料的最有效的离子洗涤剂之一, 广泛应用于不同组织和标本的去渗化 9^,10.含有高 SDS 浓度和长时间接触的溶液与蛋白质变性、糖胺多糖 (Gag) 损失和胶原纤维10、¹¹的破坏有关, 因此在 ECM 保存和细胞去除之间取得平衡是必要的。为了将同样的程序应用于胎儿和成人心脏组织, 本文所述的程序分为三个连续的步骤: 渗透休克 (低渗缓冲) 的细胞裂解;脂蛋白、dna 蛋白和蛋白质-蛋白质相互作用的增溶 (0.2% SDS);和核材料去除 (DNase 处理)。

我们的方案显示了几个优点: i) 应用相同的去细胞化策略, 可以对特定年龄的心脏组织进行等效去细胞化;(二) 不需要专门的方法或设备;(iii) 随时适应其他组织和物种, 因为它已成功地应用于人的肠道活检¹²和小鼠肺13的轻微变化;而且, 重要的是, iv) 可以解决 ECM 生物力学特性, 同时能够组装三维样的有机培养物, 更密切地模仿本地组织微环境的分子特征。

研究方案

所述所有方法都得到了 i3S 动物伦理委员会和 Direção Geral De 管乐家的批准, 并符合欧洲议会第 201/63/eu 号指令。

1. 脱髓化解决方案的准备

注: 除另有规定外, 所有脱髓化溶液均应通过0.22μm 膜过滤器进行过滤, 并最多储存3个月。

1. 对于 1x PBS:A/毫升的氯化钠, 1.01 克的 Na₂hpo₄ 200 毫克的 kcl, 200 毫克的 kh₂po 4, 与900毫升的去离子水 (di 水)_.将溶液 ph 值调整到 7.5, 最终溶液体积可达 1 L. 过滤器、高压灭菌器, 并在室温下存储溶液 (RT)。
2. 对于 Hypotonic 缓冲器 (10 mM tris, 0.1% EDTA): 在900毫升去离子水中溶解1.21 克的 TrisBASE 和1克 EDTA。使用 Naoh/hcl 将溶液 ph 值调整到 7.8, 将最终溶液体积调整为 1 L. 过滤器, 通过高压灭菌器进行消毒, 并存放在 RT。
3. 对于 0.2% SDS 溶液 (0.2% SDS, 10mm Tris): 在400毫升 di 水中加入0.6 克的 TrisBASE 和1克十二烷基硫酸钠 (SDS), 在60°c 下搅拌, 直到完全溶化。让溶液冷却到 RT, 将溶液 ph 值调整到 7.8, 将最终溶液体积调整到500毫升。过滤消毒溶液。
   注: SDS 解决方案应在使用前准备好。只有在 SDS 完全溶解后, 过滤液溶液才会使过滤器饱和, 改变最终的 SDS 浓度, 从而影响组织去细胞化效率。
4. 对于低氧清洗缓冲液 (10 mM Tris): 在900毫升的 di 水中混合1.21 克的 Trrisbase。将溶液 ph 值调整到 7.8, 将最终体积调整为1升滤清器, 通过高压灭菌器进行消毒, 并存放在 RT。
5. 用于 Dnm 处理 (20 mM Tris、2 mM MgCl₂、50 umcl dnase): 在 900 ml di 水中溶解2.42 克 trisbase 和 2 mL MgCl 2。将 pH 值调整为 7.8, 将最终溶液体积调整为1升过滤器, 并通过高压灭菌器对溶液进行灭菌。在使用前将溶液储存在 Rt. 在使用前添加 DNase i (50 U/mL)。
6. 对于 DNase i 库存溶液: 准备一个含有50% 甘油、20 mM Tris-HCl ph 7.5、1 mM MgCl 2 的 Dnase缓冲液, 并用 di 水调整到 10 ml 的最终溶液体积。在层流罩中, 将 DNase i 粉末添加到 DNase 缓冲液中, 轻轻搅拌, 直至完全溶解。通过0.22μm 过滤器对溶液进行消毒。准备1毫升的等价物, 并储存在-20°c。

2. 组织采集和冷冻保存

1. 通过 CO2 窒息, 在怀孕 18天 (E18 胎儿) 时对成年怀孕女性进行安乐死。用手术剪刀对雌性进行剖腹产, 并使用两个带有弯曲尖端的锯齿式推子 (每个角末端一个推拿器) 将带有胎儿老鼠的子宫角收集到一个带冰凉的 1 x PBS 的培养皿中。
   1. 打开子宫角和羊膜囊, 隔离胎儿。将胎儿转移到一个新的培养皿与冰凉 1x PBS 麻醉他们和斩首与剪刀。
   2. 用 CO2 窒息对7-8 大的雄性 c57bl6 小鼠进行安乐死。在每个老鼠的胸部做一个切口, 收集心脏。
   3. 用冰凉的 1x PBS 对胎儿和成人心脏进行简要冲洗。
2. 用手术刀取出成人心脏的心房。在右心室上做一个切口, 用直的小剪刀将其取出。通过去除隔膜暴露左心室内壁。在一个新的培养皿中 , 将左心室游离壁分成 2 毫米厚的纵条 , 并使用手术刀和弯曲尖端的锯齿式推子去除肌。
   1. 使用2毫米 x2 mm 网格 (补充图 1 5 中的详细说明), 借助手术刀^对小组织外植体进行消费税。用 1x PBS 简单冲洗组织外植体。
3. 在蒸压 1.5 mL 微离心管中加入 ~ 250μl 的最佳切割温度 (OCT) 化合物。用 250μl oct 将整个胎儿心脏和成人心脏外植体转移到试管中, 用干冰冷却异戊烷冷冻它们, 并储存在-80°c (最多 6个月)。
   注: 使用冷冻保存超过6个月的心脏组织外植体将显著降低去室化效率, 特别是在成人心脏组织外植体。

3. 组织去细胞化

注: 心脏组织去细胞化是在一个24孔组织培养板与一个样本每口井进行。每个去电磁化解的1毫升被添加到每个单独的井。除非另有规定, 所有脱光步骤应在165转/分 (轨道直径为20毫米的孵化器振动台) 和25°c 时搅拌进行。欲了解更多详情, 请参阅图 1a 上的方案。两性霉素 B (如fungizone) 和庆大霉素在使用前被新鲜添加到所有去细胞化溶液中, 最终浓度分别为2.5μgml 和0.01Μgml。为了量化在去细胞化组织中保留的 DNA 量, 在开始去细胞化协议之前, 需要确定样本质量。DNA 定量协议在第5.1 节中有进一步的详细说明。

1. 第1天
   1. 从-80°c 的冰柜中取出组织样本。将 1.5 mL 微离心管留在 RT, 直到 OCT 部分融化。将仍冻过的 OCT 的心脏组织块转移到具有 1x PBS 的培养皿中。
   2. OCT 融化后, 将心脏组织移动到一个新的培养皿与 1x PBS。用振动台清洗 1x PBS 和60转/分的振荡器清洗样品 10-15, 重复至少两次。
   3. 在无菌24孔组织培养板的每口井中加入1毫升工作的低血压缓冲液。借助钳子, 每口输送一个样品。
   4. 将样品中的24口组织培养板移动到25°c 的孵化器振动台, 并开始使用低声缓冲液进行18小时孵育。
2. 第2天
   1. 按照第1.3 节的描述, 准备0.2% 的 SDS 解决方案。
   2. 吸吸低血压缓冲液, 用 1x PBS 清洗样品 1小时. 重复3次。
      注: 暂停: 在静态条件下, 脱叶化下的组织可在4°c 下的 1x PBS 中保存18小时。
   3. 取出 1x PBS, 每口加入1毫升新鲜制造的 SDS 溶液 (步骤 1.3), 孵育样品24小时。
      注: (检查点) 后 SDS 孵化, 确保样品呈现白色到半透明的外观。在这一步中, SDS 处理的样品被浸透在 DNA 中, 显示出类似明胶的一致性。慢慢去除 SDS 溶液, 以避免样品粘附到移液器尖端。
3. 第3天
   1. 用低氧洗液缓冲液 (每口1毫升) 清洗样品 20分钟, 重复3次。
      注: 在此步骤中, 观察到由于清除电池残留物而导致样本大小减少是正常的。暂停点: 在静态条件下, 脱叶化下的组织可在4°C 的低声洗涤缓冲液中保存18小时。
   2. 每口加入1毫升的 DNase 处理液, 在37°c 孵育样品3小时。
   3. 吸入 DNase 处理液, 用 1x PBS (每口1毫升) 清洗样品 20分钟, 重复3次。在 RPM 连夜用 1x PBS (每口1毫升) 进行最后一次清洗, 并在60转/分的情况下晃动。
   4. (检查点)DNase 处理后, 确保脱菌样品失去了明胶样的一致性。
      注: DNase 处理后, 轻轻取出并添加 1x PBS, 因为样品可以很容易地被固定在移液器尖端。

4. 去细胞化组织细胞去除的评估

1. 将样品固定在24孔组织培养板中, 每口井1个样品, 在 RT 添加1毫升新鲜制造的10% 福尔拉林中性缓冲液, 0.03% 水生量 eosin 2.5-3小时。
   注: Eosin 被添加到固定剂染色脱钙的组织, 并在切片和组织学染色过程中方便样品的可视化。eosin 的添加既不干扰组织学染色, 也不干扰免疫荧光技术。另外, 固定可以在4°c 下进行过夜。
2. 取出固定溶液, 加入 1x PBS 的1毫升来清洗样品。
3. 根据制造商的说明, 使用一次性乙烯基标本模具, 将固定生物咖啡因封装在组织学加工凝胶中。
4. 取出组织学凝胶与样品嵌入从模具和转移到活检过程-嵌入与盖子。
   注: 组织嵌入组织学和加工凝胶的替代方法是处理两个小毛孔的活检海绵中的每个样本。样本应定位到活检海绵的中心, 以便进行检测。值得注意的是, 某些示例可能难以使用此方法进行本地化。
5. 通过连续培养 (每个溶液 30分钟) 在一系列酒精浓度 (70%、80%、90%、100%、100%)、异构丙基脂肪烃溶液 (2个培养站) 和石蜡 (2个孵育) 中进行石蜡包埋样品的工艺在56°c 时)。
6. 将样品安装在石蜡块中。
7. 在微胶卷上切割3μm 厚的石蜡切片, 并在玻璃显微镜幻灯片上收集部分。
8. 在37°c 下过夜的干石蜡部分。
   注: (暂停点) 石蜡部分存储在 4°c, 直到进一步使用。
9. 为了验证协议的效率, 根据制造商的说明, 对脱病毒样品部分进行血红素和 Eosin (H & E) 和马松的三氯甲烷染色 (MT), 并对非操纵组织的切片进行染色。
   注: H & E 染色染色染色细胞核蓝紫色, 细胞质深粉红色和胶原蛋白浅粉色和 MT 染色核黑色, 细胞质红色, 胶原蛋白和粘液蓝色。当观察到多孔浅粉色 (H & E、MT) 和蓝色 (MT) 网络时, 在没有核染色的情况下, 可实现高效的去电磁化。

5. 评估脱病毒组织核材料的去除情况

注: 去细胞化组织上的 DNA 含量的定量必须与相应的非操作组织进行比较。

1. 在去电磁化之前, 在高精度的数字刻度上称重 1.5 mL 的微离心管。将心脏组织转移到试管中, 取出额外的 1x PBS, 并与样品称重。计算样品的湿重:
   样品_湿重= 重量管_与样品–_重量空管
2. 按照步骤3中的说明对样品进行解码。
3. 去细胞化后, 将脱细胞组织收集到微离心管中。
   1. 由于单个心脏样本和试剂盒规格的尺寸和质量较小, 每个样本条件 (胎儿心脏: 5 颗全心; 成人 LV 外植体:15 种外植体) 的池去细胞化组织。对非操作组织执行相同的过程。
      注: (暂停点) 样品可以储存在-20°c, 直到 DNA 提取和定量进行。
4. 在干净的 Petri 培养皿中, 用手术刀帮助切割小外植体中的非操作和脱病毒组织。
   注: 每个样品使用单独的手术刀和培养皿。用手术刀对样品进行机械破坏, 有利于其后酶消化和随后的 DNA 提取。
5. 对于 DNA 提取, 请根据制造商的说明使用基于自旋柱的 DNA 提取方法。
   1. 根据制造商的说明, 使用宽孔管尖, 使用主消化缓冲液 (消化缓冲液和蛋白酶 K) 从 Petri 培养皿中收集机械分离的样品。
      注: 在脱菌样品中, 用蛋白酶 K 消化组织裂解的速度更快。要同时处理不同的样品, 请将裂解的样品放在冰上, 直到所有样品都被裂解, 以最大限度地减少降解。完成样品裂解时间在4-6 之间。
   2. 按照制造商的说明继续执行协议。
   3. 为了提高脱病毒和非脱化组织样本提取 DNA 的产率, 分别在25-50μl 和100μl 洗脱缓冲液上提取 DNA。收集洗脱的 DNA 并加载自旋柱。根据制造商的说明, 在 RT. 离心机上生下1分钟。
      注: (暂停点) 从样品中提取的 DNA 可以储存在-20°c, 直到进一步使用。
6. 按照制造商的说明, 使用荧光 dsDNA 检测试剂盒对从样品中提取的 DNA 进行定量。
7. 将 DNA 含量归化为初始样本湿重 (去髓化前) 每毫克 DNA 的纳米图谱。

6. 去室支架细胞播种

注: 所有溶液/试剂都必须是无菌的, 整个过程都要在无菌条件下进行。

1. 用2.5μgml 的两性霉素 b 和 1% psp (青霉素, 100 i. u.; 链霉素 100μgml) 制备 1x DPBS。
2. 从最后一个去电化洗涤步骤 (步骤 3.3.3) 中取出 1x PBS 溶液, 每井加入 500Μl, 加入新鲜制备的 1x dpbssssp/ml 的两性霉素 bc% psμs 溶液。将样品存放在1-7 的4°C 下。
   注: 在4°c 下储存样品对于保持无菌是很重要的。
3. 将 p1 至细胞基部培养基 (不含 FBS 和补充剂) 添加到1% 的最终浓度中。
4. 从脱折样品中提取 1x dpbscsp. 2.5μg/2。在37°c 或4°C 时, 每井加入 500Μl, 使样品平衡 1小时, 或在4°c 时平衡1小时以上。
5. 分裂所感兴趣的细胞, 并准备小的细胞等价物在所需的细胞密度。
   注: 脱髓化组织种子必须在立体显微镜下和无菌条件下进行。细胞培养培养基应含有1%。
6. 将3-4 微米的 DPBS 输送到96孔板的中心。使用薄而直的推子, 将脱光脚手架转移到 DPBS 的落差中, 通过抽吸去除多余的 DPBS, 并确保样品不会折叠或起皱。让它在边缘变干, 粘附在井面上。
   注: 分离支架的播种效率较低。
7. 通过将单细胞溶液缓慢地移向井边, 将细胞添加到脚手架上。
   注: 例如, 新生大鼠心肌细胞的密度为 7, 500 细胞 2, 使小鼠林- sca-1⁺心肌祖细胞 (icpc^sca-1) 的密度为60-1500 细胞/毫米²。根据实验原理调整细胞密度。
8. 将 DPBS 添加到相邻的油井中, 以避免快速的介质蒸发。
9. 24小时后细胞播种, 如果细胞类型使用粘附在组织培养聚苯乙烯板 (TCPS), 转移生物咖啡因到一个新的井。否则, 请更换介质以去除未粘附的细胞。
10. 根据细胞类型的具体要求仔细更换介质。

结果

脱细胞化效率应通过三种主要技术进行评估: 宏观观察、组织学和 DNA 定量。sds 处理后样品的宏观外观间接影响细胞切除的效果。SDS 孵化后, 样本应显示为半透明至白色 (图 1c)。胎儿 (E18) 脱胎组织的特点是高度半透明的结构, 而成体外植体有一个半透明到白色的外观。更白的外观通常与显示出更高纤维和胶原蛋白含量的 ECM 网络相关,例如成人?...

讨论

细胞外基质 (ECM) 是纤维和粘接糖蛋白的高度动态和复杂的网状结构, 由多个生物活性肽和包埋生长因子组成的储集层组成。ECM 作为细胞粘附、细胞骨架动力学、运动迁移、增殖、分化和凋亡的主要调节剂, 积极调节细胞功能和行为。知道细胞行为在2D 和3D 培养中是不同的, 因此一直在努力开发能够准确复制自然组织环境的新型有机型模型。在过去的几年里, 组织去细胞化已经成为组织工程和再生医...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker	Orbital Shakers	IKA:3510001	Recommended
Fluorimeter	-	-	Equipment available
Digital weight scale	-	-	Equipment available
Inverted Microscope	-	-	Equipment available
Cell culture incubator	-	-	Equipment available
Fridge (4ºC)	-	-	Equipment available
Deep freezer (-80ºC)	-	-	Equipment available
Microtome	-	-	Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	5000-08	Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox	Fine Science Tools	11254-20	Recommended
Dumont 7 forceps	Fine Science Tools	11272-30	Recommended
Dissecting Scissors, straight	-	-	Tool available
Forceps, serrated, curved	-	-	Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped	VWR	29442-044	-
96 well plates, individually wrapped	VWR	71000-078	-
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized	Millipore	SE1M179M6	-
Eppendorff	-	-	Material available
15 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430791	-
50 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430829	-
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid	Electron Microscopy Science	70075-B	-
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	22-037-246	-
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006	-
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)	Sigma-Aldrich	277258-1L	-
Dry ice	-	-	-
Decellularization
NaCl	BDH Prolabo	27810.364	-
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S-31264	-
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-100g	-
KCl	Sigma-Aldrich	P8041-1KG	-
TrisBASE	Sigma-Aldrich	T6066-500G	-
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L-4390	-
MgCl2	MERCK	1.05833.1000	-
DNAse I	AplliChem	A3778,0050	-
Gentamicin	Gibco	15710-049	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Histology
10 % formalin neutral buffer	Prolabo	361387P	-
Eosin Y AQUEOUS	Surgipath	01592E	Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	-
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous	Aga	4,006,02,02,00	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Clear Rite 3	Richard-Allan Scientific	6915	-
Shandon Histoplast	Thermo Fisher Scientific	RAS.6774006	-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	-
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit	Invitrogen	P11496	-
Cell culture
DPBS	VWR	45000-434	-
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Labclinics	L0022-100	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Cell culture media of the cell of interest	-	-	-