Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

Resumen

La matriz extracelular cardiaca (ECM) es una compleja red de moléculas que orquestar procesos clave en los tejidos y órganos mientras aguantando remodelación fisiológica durante toda la vida. Descelularización estandarizado del corazón fetal y adulto permite estudios experimentales comparativos de ambos tejidos en un contexto 3D mediante la captura de arquitectura original y propiedades biomecánicas.

Resumen

Conocimiento actual de la matriz extracelular (ECM)-comunicación celular se traduce en estudios grandes bidimensional (2D) cultivo in vitro donde se presentan componentes de ECM como una capa superficial. Estos sistemas de cultivo constituyen una simplificación de la compleja naturaleza de la ECM que abarca la composición bioquímica, estructura y propiedades mecánicas del tejido. Para imitar mejor la comunicación ECM-la célula que forma el microambiente cardiaco, hemos desarrollado un protocolo que permite la descelularización del corazón entero fetal y tejido adulto ventrículo izquierdo explantes simultáneamente para estudios comparativos. El protocolo combina el uso de un tampón hipotónico, un detergente de características de surfactante aniónico y el tratamiento de DNasa sin ningún requisito de conocimientos especializados o equipos. La aplicación de la misma estrategia de descelularización en muestras de tejido de sujetos de edad diferentes es una alternativa para realizar estudios comparativos. El presente Protocolo permite la identificación de diferencias estructurales únicas en adulto y fetales cardiaca ECM malla y biológico respuestas celulares. Además, la presente metodología muestra una aplicación más amplia siendo aplicada con éxito en otros tejidos y especies con ajustes menores, como en las biopsias del intestino humanas y en pulmón de ratón.

Introducción

La matriz extracelular (ECM) es una red dinámica de moléculas que regulan importantes procesos celulares, es decir, decisión de la suerte, proliferación y diferenciación de^1,2. La investigación de las interacciones célula-ECM se ha realizado principalmente en dos dimensiones (2D) en vitro culturas recubierto con componentes de ECM, que constituyen una simplificación de las propiedades nativas de ECM en vivo. Descelularización genera acelular bioscaffolds de ECM como 3D que conservan en gran medida la arquitectura extracelular y composición de los tejidos nativos y órganos^3,4. Además de servir como andamios bioactivos para ingeniería de tejidos, biomateriales de ECM 3D decellularized surgen como nuevas plataformas para evaluar biología celular-ECM eso paralelo el ambiente en vivo.

Evaluación de la función diferencial de los componentes de la ECM de distintos tejidos, órganos y edad se beneficiará con el uso de protocolos similares de generar bioscaffolds nativo. En el corazón, hemos desarrollado un protocolo versátil de la descelularización de muestras derivadas de adulto y fetales, como una alternativa para realizar estudios comparativos del microambiente de órgano. Utilizando esta metodología, Capturamos el microambiente cardiaco nativo y demostró que la ECM fetal promueve mayores rendimientos de la repoblación de células cardíacas⁵. Descelularización dispone identificación de residente diferencias estructurales entre ECM fetal y adultos a nivel de la lámina basal y pericelular arreglo de malla de matriz y fibra composición⁵. Antes de este trabajo, la comparación directa de los tejidos en las diferentes etapas ontogenic utilizando el mismo enfoque de descelularización se ha divulgado solamente para roedores corazones y riñones de mono rhesus. Además, un número limitado de estudios Informe tejido/órgano fetal descelularización propiamente^5,6,7. Esto se ha logrado utilizando SDS como agente único descelularización; sin embargo, diferentes concentraciones de SDS se utilizaron para la descelularización de tejido cardíaco fetal y adulto^7,8. SDS es uno de los detergentes iónicos más eficaces para la remoción de material citoplásmico y nuclear y ampliamente utilizado en la descelularización de diferentes tejidos y muestras de^9,10. Soluciones que contienen altas concentraciones de SDS y largos períodos de exposición se han correlacionado con la desnaturalización de la proteína, pérdida de glicosaminoglicanos (GAGs) y alteración de las fibrillas de colágeno de^10,11y por lo tanto un equilibrio entre preservación y celular la eliminación de ECM es necesario. Para aplicar el mismo procedimiento al tejido del corazón fetal y adulto, el protocolo descrito en este documento se divide en tres pasos secuenciales: lisis de células por choque osmótico (tampón hipotónico); solubilización de lípidos y proteínas, DNA-proteína y proteína-proteína interacciones (0.2% SDS); y remoción de material nuclear (tratamiento de DNasa).

Nuestro protocolo muestra varias ventajas: i) la posibilidad de descelularización equivalente de tejidos cardiacos específicos de la edad mediante la aplicación de la misma estrategia de descelularización; II) no hay requisitos para métodos especializados o equipos; III) listo adaptación a otros tejidos y especies como se ha aplicado con éxito con menores alteraciones en las biopsias del intestino humano¹² y ratón pulmonar¹³; y, sobre todo, iv) puede abordar propiedades biomecánicas ECM permitiendo el montaje de las culturas organotypic de 3D como que más imitan muy de cerca las características moleculares del microambiente del tejido nativo.

Protocolo

Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el i3S Comité de ética Animal y Direção Geral de Veterinária (DGAV) y están de acuerdo con Parlamento Europeo Directiva 2010/63/UE.

1. preparación de las soluciones de descelularización

Nota: Todos descelularización soluciones deben ser filtradas a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y almacenadas por un máximo de 3 meses, excepto se especifique lo contrario.

1. De 1 x PBS: mezclar 8 g de NaCl, 1,01 g de Na₂HPO₄ 200 mg de KCl y 200 mg de KH₂PO₄ con 900 mL de agua desionizada (agua desionizada). Ajustar el pH de la solución a 7.5 y el volumen de solución final hasta 1 L. filtro, autoclave y tienda la solución a temperatura ambiente (RT).
2. Para el tampón hipotónico (10 mM Tris, EDTA 0,1%): disolver 1,21 g de TrisBASE y 1 g de EDTA en 900 mL de agua desionizada. Ajustar el pH de la solución a 7.8 con NaOH/HCl y el volumen de solución final a 1 L. filtro, esterilizar en autoclave y almacenar a TA.
3. Para la solución de SDS 0,2% (0.2% SDS, 10 mM Tris): Añadir 0,6 g de TrisBASE y 1 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) en 400 mL de agua desionizada y mezclar a 60 ° C hasta disolución completa del soluto. Deje que la solución se enfríe a RT. ajuste solución pH a 7.8 y el volumen de solución final a 500 mL. Esterilizar la solución por filtración.
   Nota: La solución de SDS se prepara antes de usar. Solución de filtrado sólo tras completar disolución SDS, de lo contrario las partículas insolubles de la SDS saturan el filtro, variando la concentración final de SDS y afectando, en consecuencia, eficacia de descelularización de tejido.
4. Para el tampón de lavado hipotónica (10 mM Tris): mezcla de 1,21 g de TrisBASE en 900 mL de DI agua. Ajustar el pH de la solución a 7.8 y el volumen final de 1 L. filtro, esterilizar en autoclave y almacenar a TA.
5. Para el tratamiento de DNasa (20 mM Tris, 2 mM de MgCl₂, 50 U/mL DNasa): disolver 2,42 g de TrisBASE y 2 mL de 1 M de MgCl₂ en 900 mL de agua desionizada. Ajustar pH a 7.8 y el volumen de solución final a 1 L. filtro y esterilizar la solución por autoclave. Almacene la solución en RT. agregar ADNasa I (50 U/mL) antes de usarlo.
6. Para DNase stock solución: preparar un tampón de DNasa que contiene 50% glicerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl₂y se ajustan a un volumen de solución final de 10 mL con agua desionizada. En campana de flujo laminar, agregue la ADNsa I polvo al buffer de DNasa y mezclar suavemente hasta disolución completa. Esterilizar la solución a través de 0.22 μm filtro. Preparar alícuotas de 1 mL y almacenar a-20 ° C.

2. tejidos y criopreservación

1. Eutanasia a las hembras embarazadas adultas a los 18 días de gestación (fetos E18) a través de CO₂ asfixia. Realizar una cesárea en las mujeres con una tijera quirúrgica y recoger los cuernos uterinos con los ratones fetales a una placa Petri con helada 1 x PBS utilizando dos pinzas dentadas con punta curvada (una pinzas en cada extremo del cuerno).
   1. Abrir los cuernos uterinos y el saco amniótico para aislar a los fetos. Transferencia de los fetos a una nueva caja Petri con helada 1 x PBS para anestesiarlos y decapitar con una tijera.
   2. Eutanasia a ratones C57BL/6 machos 7-8 semanas de edad, uso de CO₂ asfixia. Realizar una incisión en el pecho de cada ratón y recoge el corazón.
   3. Enjuague el corazón fetal y adulto con PBS 1 x frío de hielo.
2. Retire las aurículas del corazón adulto con la ayuda de un bisturí. Realizar una incisión en el ventrículo derecho y extraerlo con unas tijeras recta pequeñas. Exponer la pared interna del ventrículo izquierdo quitando el tabique. En una nueva placa de Petri, dividir el ventrículo izquierdo libre de la pared en tiras longitudinales con 2 mm de espesor y retirar el músculo papilar usando un bisturí y pinzas dentadas con puntas curvas.
   1. Impuestos especiales explantes pequeños de tejido con la ayuda de un bisturí con una cuadrícula de 2 x 2 mm (Descripción detallada en el suplementario figura 1⁵). Enjuague explantes de tejido con PBS 1 x.
3. Añadir 250 μl de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesta para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL esterilizado. Transfer corazones todo fetal y adulto explantes cardíacos a los tubos con 250 μl de OCT y congelar con isopentano enfriado con hielo seco y conservar a-80 ° C (hasta un máximo de 6 meses).
   Nota: El uso de explantes de tejido cardiaco congelados por más de 6 meses reducirá significativamente la eficiencia de la descelularización, especialmente en los explantes de tejido del corazón adulto.

3. descelularización tejido

Nota: Descelularización de tejido cardiaco se realiza en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con una muestra por pozo. 1 mL de cada solución de descelularización se añade a cada pocillo. Todos los pasos de descelularización deben realizarse con agitación a 165 rpm (coctelera de la incubadora con un diámetro orbital de 20 mm) y a 25 ° C, a menos que se especifique lo contrario. Para más detalles, consulte el esquema de la figura 1A. Anfotericina B (fungizonepor ejemplo ) y gentamicina son recién añadidos a todas las soluciones de descelularización antes del uso a una concentración final de 2,5 μg/mL y 0.01 μg/mL, respectivamente. Cuantificar la cantidad de ADN conservado dentro de los tejidos decellularized, la muestra masa deben determinarse antes de iniciar el protocolo de descelularización. El protocolo de cuantificación de ADN es más detallada en 5.1.

1. DÍA 1
   1. Extraer muestras de tejido del congelador de-80 ° C. Dejar 1,5 mL tubos de microcentrífuga en RT hasta OCT se convierte parcialmente derretido. Transferir el bloque de tejido cardiaco del OCT congelado a una placa de Petri con PBS 1 x.
   2. Después del OCT se derrite, hacia el tejido cardiaco una nueva placa de Petri con PBS 1 x. Las muestras de lavado de 1 x PBS y a 60 rpm con un agitador de 10-15 minutos repetición al menos dos veces.
   3. Añadir 1 mL de trabajo tampón hipotónico por pozo de una placa de cultivo estériles para tejidos 24-bien. Transferir una muestra por pozo con la ayuda de fórceps.
   4. Mover la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con las muestras a una coctelera de la incubadora a 25 ° C y comenzar la incubación de 18 h con tampón hipotónico.
2. DÍA 2
   1. Preparar la solución de SDS 0,2% como se describe en la sección 1.3.
   2. Aspirar el tampón hipotónico y lavar las muestras con PBS 1 x por veces 1 h. repetir 3.
      Nota: Pausa punto: tejido bajo descelularización puede conservarse en PBS 1 x a 4 ° C por 18 h en condiciones estáticas.
   3. Retirar el PBS 1 x, agregue 1 mL de solución de SDS recién hecha (paso 1.3) por pozo e incubar las muestras durante 24 horas.
      Nota: Incubación (CHECK POINT) Post SDS Asegúrese de que las muestras exhiben un blanco de aspecto translúcido. En este paso, SDS tratadas las muestras son bañadas en el ADN, mostrando una consistencia gelatinosa. Eliminar la solución de SDS lentamente para evitar la adherencia de la muestra a la punta de la pipeta.
3. DÍA 3
   1. Lavar las muestras con tampón de lavado hipotónica (1 mL por pozo) por 20 minutos, repetir 3 veces.
      Nota: En este paso, es normal observar una disminución en el tamaño de la muestra debido a la eliminación de restos celulares. PUNTO de pausa: Tejido bajo descelularización puede conservarse en tampón de lavado hipotónica a 4 ° C por 18 h en condiciones estáticas.
   2. Añadir 1 mL de solución de tratamiento de DNasa por bien e incubar las muestras durante 3 h a 37 ° C.
   3. Aspire la solución de tratamiento de DNasa y lavar las muestras con PBS 1 x (1 mL por pozo) por 20 minutos, repetir 3 veces. Realizar un último lavado con PBS 1 x (1 mL por pozo) durante la noche en RT y agitación a 60 rpm.
   4. (Check point) Después del tratamiento de DNasa, asegúrese de que las muestras decellularized han perdido la consistencia de gelatina.
      Nota: Después del tratamiento de DNasa, retirar y añadir 1 x PBS suavemente desde muestras pueden ser fácilmente atrapadas y atadas a la punta de la pipeta.

4. evaluación de la extracción de células de tejido decellularized

1. Fijar las muestras en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, 1 muestra por pozo, añadiendo 1 mL de tampón neutro recién hecha de formalina al 10% con eosina acuosa 0,03% por 2.5-3 h a TA.
   Nota: Eosina se agrega al fijador para teñir los tejidos decellularized y para facilitar la visualización de la muestra durante el seccionamiento y la coloración histológica. La adición de la eosina que ni interfieren con las manchas histológicas ni con técnicas de inmunofluorescencia. Por otra parte, la fijación puede realizarse durante la noche a 4 ° C.
2. Retirar la solución fijadora y añadir 1 mL de PBS 1 x a lavar la muestra.
3. Encapsular el bioscaffolds fijo en procesamiento histología gel usando un molde de muestra desechables de vinilo según las instrucciones del fabricante.
4. Retirar el gel de la histología con la muestra incrustada del molde y la transferencia a biopsia procesamiento/incrustación Cassettes con tapa.
   Nota: Una alternativa al tejido de incrustar en la histología y tratamiento gel es para procesar cada muestra en dos esponjas de biopsia con poros pequeños. Las muestras deben localizarse en el centro de las esponjas de la biopsia para habilitar la detección. De nota, algunas muestras pueden ser difíciles de localizar utilizando este enfoque.
5. Procesar las muestras de parafina inclusión a través de incubaciones sucesivas (30 min por solución) en serie de concentraciones de alcohol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solución de hidrocarburo alifático isoparaffinic (2 estaciones de incubación) y parafina (incubación 2 estaciones) a 56 ° C.
6. Montar las muestras en un bloque de parafina.
7. Cortar 3 tramos de parafina μm de espesor en un micrótomo y recoger las secciones sobre portaobjetos de vidrio.
8. Secciones de la parafina seca durante la noche a 37 ° C.
   Nota: Las secciones de parafina (pausa punto) se almacenan a 4 ° C hasta su uso posterior.
9. Para verificar la eficacia del Protocolo, realizar hematoxilina y eosina (H & E) y TRICROMICA de Masson (TM) la coloración de las secciones de la muestra decellularized y a las secciones de tejido no manipulados según las instrucciones del fabricante.
   Nota: H & E tinción manchas celular núcleos azul/violeta, citoplasma rosado/rojo oscuro y colágeno pálido rosado y MT las manchas negras de los núcleos, citoplasma rojo y colágeno y mucina azul. Descelularización eficiente se logra cuando un poroso rosa (H & E, MT) y se observa red azul (MT), en ausencia de una tinción nuclear.

5. evaluación de remoción de material nuclear de tejido decellularized

Nota: Debe realizarse la cuantificación del contenido de ADN en el tejido decellularized en comparación con el tejido respectivo no manipulado.

1. Antes de descelularización, pesar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en una balanza digital de alta precisión. Transferir el tejido cardiaco al tubo, retire la cantidad extra de 1 x PBS y pese el tubo con las muestras. Calcular el peso húmedo de las muestras:
   Peso_húmedo = peso del _{tubo con muestras} – peso _{tubo vacío}
2. Decellularize las muestras como se describe en el paso 3.
3. Después de descelularización, recoger los tejidos decellularized en un tubo de microcentrífuga.
   1. Debido a las pequeñas dimensiones y masa de las muestras individuales cardiacas y kit especificaciones, piscina decellularized los tejidos de cada condición de la muestra (corazón fetal: 5 corazones enteros; adultos LV de explantes: 15 explantes). Realizar el mismo procedimiento con el tejido no manipulado.
      Nota: (Punto de pausa) las muestras pueden ser almacenadas a-20 ° C hasta que se realizaron la extracción de ADN y cuantificación.
4. Corte no manipulados y decellularized los tejidos de explantes pequeños con la ayuda de un bisturí en una caja de Petri limpia.
   Nota: Use un bisturí individual y un plato de Petri por cada muestra. Alteración mecánica de las muestras con un bisturí facilita su posterior digestión enzimática y posterior extracción de ADN.
5. Para la extracción de ADN, usar un método de extracción de ADN de vuelta-columna base según las instrucciones del fabricante.
   1. Recolectar las muestras mecánicamente disociadas de la placa de Petri con el tampón de digestión principal (tampón de digestión y proteinasa K) según las instrucciones del fabricante utilizando una pipeta de amplio orificio.
      Nota: Lisis de tejido con digestión proteinasa K es más rápido en las muestras de decellularized. Para procesar muestras distintas al mismo tiempo, mantener las muestras sometidas a lisis en hielo, hasta que todas las muestras son sometidas a lisis para minimizar la degradación. Lisis de muestras completas se logra entre 4-6 h.
   2. Proceder con el protocolo según las instrucciones del fabricante.
   3. Para aumentar los rendimientos de ADN extraído de muestras de tejido decellularized y no decellularized, eluir el ADN en 25-50 μL y 100 μL de tampón de elución, respectivamente. Recoger el ADN eluído y carga la columna de vuelta. Incubar durante 1 min a RT. centrifugar las muestras según las instrucciones del fabricante.
      Nota: (Pausa punto) el ADN extraído de las muestras puede almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.
6. Cuantificar el ADN extraído de las muestras con un kit de detección fluorescente dsDNA siguiendo las instrucciones del fabricante.
7. Normalizar el contenido de ADN como nanogramos de ADN por miligramo de peso húmedo de la muestra inicial (antes de descelularización).

6. celular de andamios decellularized siembra

Nota: Todos los reactivos/soluciones tienen que ser estériles y todo el procedimiento se realiza en condiciones estériles.

1. Preparar 1 x DPBS con 2.5 μg/mL de anfotericina B y el 1% P/S (100 U.I. penicilina, estreptomicina 100 μg/mL).
2. Retire la solución PBS 1 x del última descelularización lavado paso (3.3.3) y agregar 500 μL por pocillo de la recién preparado 1 x DPBS/2.5 μg/mL de anfotericina B/1% P/S solución. Almacenar las muestras a 4 ° C de 1-7 días.
   Nota: Almacenamiento de las muestras a 4 ° C es importante para mantener la esterilidad.
3. Agregar P/S para celular media basal (sin FBS y suplementos) a una concentración final de 1%.
4. Aspire 1 x DPBS/2.5 μg/mL de anfotericina B/1% P/S solución de las muestras decellularized. Añadir 500 μL por pocillo de célula basal media/1% P/S y dejar muestras equilibre durante 1 h a 37 ° C o a 4 ° C por más de 1 h.
5. Dividir las celdas de interés y preparar pequeñas alícuotas de células en la densidad celular deseado.
   Nota: La siembra de decellularized tejido debe realizarse en un microscopio estereoscópico y en condiciones estériles. Medios de cultivo celular debe contener 1% P/S.
6. Pipetear 3-4 μL de DPBS al centro de un pozo de una placa de 96 pocillos. Con unas pinzas finas y rectas, los andamios decellularized de transferencia a la caída DPBS, quitar la DPBS extra por aspiración y asegúrese de que la muestra no está doblada o arrugada. Que se convierten en los bordes se adhieran a la superficie bien seca.
   Nota: Andamios separados tienen menor eficiencia de siembra.
7. Añadir las células al andamio mediante pipeteo la solución sola célula lentamente contra los bordes del pozo.
   Nota: por ejemplo, cardiomiocitos neonatales de rata son sembradas con a una densidad de 7.500 células/mm² y ratón inmortalizado Lin⁻ Sca-1⁺ cardiaco las células progenitoras (CIPC^Sca-1) con una densidad de 60 1.500 células/mm². Ajustar la densidad de célula según la lógica experimental.
8. Añadir DPBS a los pozos vecinos para evitar la evaporación rápida de los medios de comunicación.
9. 24 horas post siembra celular, si el tipo de célula utilizado adherido a las placas de poliestireno de cultivo de tejidos (TCPS), transfiere bioscaffolds a un nuevo pozo. En caso contrario, sustituir el medio para eliminar las células no adherentes.
10. Cambie cuidadosamente los medios según los requisitos específicos del tipo de la célula.

Resultados

La eficacia de la descelularización debe evaluarse a través de tres técnicas principales: observación macroscópica, la histología y la cuantificación de ADN. El aspecto macroscópico de las muestras post-SDS de trato afecta indirectamente la eficacia de la eliminación de la célula. Después de la incubación de la SDS, las muestras deben aparecer como transparente a blanquecino (figura 1). Fetal (E18) decellularized tejidos se caracterizan por una es...

Discusión

La matriz extracelular (ECM) es una red altamente dinámica y compleja de glicoproteínas fibrosas y adhesivas, que consiste en un depósito de numerosos péptidos bioactivos y atrapado los factores de crecimiento. Como importante modulador de la adhesión celular, dinámica del citoesqueleto, movilidad y migración, proliferación, diferenciación y apoptosis, ECM regula activamente el comportamiento y función celular. Sabiendo que el comportamiento celular difiere en 2D y 3D de las culturas, se han hecho esfuerzos par...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker	Orbital Shakers	IKA:3510001	Recommended
Fluorimeter	-	-	Equipment available
Digital weight scale	-	-	Equipment available
Inverted Microscope	-	-	Equipment available
Cell culture incubator	-	-	Equipment available
Fridge (4ºC)	-	-	Equipment available
Deep freezer (-80ºC)	-	-	Equipment available
Microtome	-	-	Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	5000-08	Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox	Fine Science Tools	11254-20	Recommended
Dumont 7 forceps	Fine Science Tools	11272-30	Recommended
Dissecting Scissors, straight	-	-	Tool available
Forceps, serrated, curved	-	-	Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped	VWR	29442-044	-
96 well plates, individually wrapped	VWR	71000-078	-
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized	Millipore	SE1M179M6	-
Eppendorff	-	-	Material available
15 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430791	-
50 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430829	-
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid	Electron Microscopy Science	70075-B	-
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	22-037-246	-
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006	-
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)	Sigma-Aldrich	277258-1L	-
Dry ice	-	-	-
Decellularization
NaCl	BDH Prolabo	27810.364	-
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S-31264	-
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-100g	-
KCl	Sigma-Aldrich	P8041-1KG	-
TrisBASE	Sigma-Aldrich	T6066-500G	-
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L-4390	-
MgCl2	MERCK	1.05833.1000	-
DNAse I	AplliChem	A3778,0050	-
Gentamicin	Gibco	15710-049	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Histology
10 % formalin neutral buffer	Prolabo	361387P	-
Eosin Y AQUEOUS	Surgipath	01592E	Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	-
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous	Aga	4,006,02,02,00	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Clear Rite 3	Richard-Allan Scientific	6915	-
Shandon Histoplast	Thermo Fisher Scientific	RAS.6774006	-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	-
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit	Invitrogen	P11496	-
Cell culture
DPBS	VWR	45000-434	-
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Labclinics	L0022-100	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Cell culture media of the cell of interest	-	-	-