Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Resumo

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Resumo

Conhecimento atual da matriz extracelular (ECM)-célula comunicação se traduz em estudos de grande bidimensional (2D) cultura in vitro, onde os componentes de ECM são apresentados como um revestimento de superfície. Estes sistemas de cultura constituam uma simplificação da natureza complexa do tecido ECM que engloba a composição bioquímica, estrutura e propriedades mecânicas. Para melhor emular a ECM-célula comunicação moldar o microambiente cardíaca, desenvolvemos um protocolo que permite a decellularization do coração fetal toda e tecido adulto ventrículo esquerdo explants simultaneamente para estudos comparativos. O protocolo combina a utilização de um buffer hipotônica, um detergente de surfactante aniônico Propriedades e tratamento de DNase sem qualquer exigência de habilidades especializadas ou equipamento. A aplicação da estratégia de decellularization da mesma através de amostras de tecido de indivíduos de idade diferentes é uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos. O presente protocolo permite a identificação das únicas diferenças estruturais entre fetais e adultas cardíaca ECM malha e biológicas respostas celulares. Além disso, a aqui a metodologia demonstra uma aplicação mais vasta, sendo aplicada com sucesso em outros tecidos e espécies com pequenos ajustes, tais como em biópsias de intestino humanas e pulmão do rato.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) é uma rede dinâmica de moléculas que regulam processos celulares importantes, nomeadamente o destino-decisão, proliferação e diferenciação de^1,2. A investigação de interacções célula-ECM foi realizada principalmente em duas dimensões (2D) em vitro culturas revestido com componentes de ECM, que constituem uma simplificação das propriedades nativas de ECM encontrado na vivo. Decellularization gera bioscaffolds de ECM 3D-como acelular que preservam em grande parte a arquitetura extracelular e composição de tecidos nativos e órgãos^3,4. Além de servir como andaimes bioativos para a engenharia de tecidos, biomateriais de ECM decellularized 3D estão emergindo como plataformas de romance para avaliar biologia celular-ECM desse paralelo o ambiente em que vivo.

Avaliação da função diferencial dos componentes de diferentes tecidos, órgãos e idade ECM serão beneficiados com o uso de protocolos semelhantes de gerar bioscaffolds nativo. No coração, temos desenvolvido um protocolo versátil para decellularization de amostras fetais e adulto-derivado, como uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos com o microambiente do órgão. Usando esta metodologia, capturamos o microambiente cardíaca nativa e mostrou que o ECM fetal promove maior rendimento de repovoamento de células cardíacas⁵. Decellularization ainda mais desde a identificação de residentes diferenças estruturais entre ECM fetal e adulto ao nível da cave lamina e pericelular matriz malha o arranjo e composição de fibra⁵. Antes deste trabalho, Head-to-comparação de tecidos em diferentes estágios de ontogenic, usando a mesma abordagem de decellularization só tem sido relatado para roedores corações e rins de macaco rhesus. Além disso, um número limitado de estudos relatam o tecido fetal/órgão decellularization por si^5,6,7. Isto foi conseguido usando SDS como agente exclusivo de decellularization; no entanto, distintas concentrações de SDS foram usadas para o decellularization do tecido cardíaco fetal e adulto^7,8. SDS é um dos detergentes iônicos mais eficazes para o apuramento de material citoplasmático e nuclear e amplamente utilizado na decellularization de diferentes tecidos e espécimes^9,10. Soluções contendo altas concentrações de SDS e longos períodos de exposição tem sido correlacionadas com a desnaturação da proteína, a perda de glicosaminoglicano (GAGs) e a ruptura do colágeno fibrilas^10,11e, portanto, um equilíbrio entre preservação e célula remoção de ECM é necessário. Para aplicar o mesmo procedimento para o tecido cardíaco fetal e adulto, o protocolo descrito neste documento é dividido em três etapas sequenciais: lise de células por choque osmotic (hipotônica tampão); solubilização dos lipídios-proteínas, ADN-proteína e proteína-proteína interações (0,2% SDS); e remoção de material nuclear (tratamento de DNase).

Nosso protocolo mostra várias vantagens: eu) a possibilidade de decellularization equivalente dos tecidos cardíacos de idade específica aplicando a mesma estratégia de decellularization; II) sem requisitos para métodos especializados ou equipamento; III) pronta adaptação para outros tecidos e espécies como foi aplicado com sucesso com pequenas alterações em biópsias de intestino humano¹² e mouse pulmão¹³; e, importante, iv) pode resolver propriedades biomecânicas de ECM, permitindo a montagem de organotypic 3D-como as culturas que mais estreitamente imitam as características moleculares do microambiente do tecido nativo.

Protocolo

Todas as metodologias descritas foram aprovadas pelo i3S Comitê de ética Animal e Direção Geral de Veterinária (DGAV) e estão em conformidade com a europeias Parlamento Directiva 2010/63/CE.

1. preparação das soluções decellularization

Nota: Decellularization todas as soluções devem ser filtradas através de um filtro de membrana de 0,22 μm e armazenadas por um período máximo de 3 meses, exceto especificado o contrário.

1. Para 1X PBS: misturar 8 g de NaCl, 1,01 g de Na₂HPO₄ 200 mg de KCl e 200 mg de KH₂PO₄ com 900 mL de água deionizada (água DI). Ajuste o pH da solução de 7,5 e o volume de solução final para 1 filtro de L., autoclave e armazenar a solução à temperatura ambiente (RT).
2. Para Buffer hipotônica (10 mM Tris, 0,1% EDTA): dissolver 1,21 g de TrisBASE e 1 g de EDTA em 900 mL de água desionizada. Ajustar o pH da solução para 7,8 com NaOH/HCl e o volume de solução final para 1 L. filtro, esterilize em autoclave e armazenar no RT
3. Para solução de SDS de 0,2% (0,2% SDS, 10mm Tris): Adicionar 0,6 g de TrisBASE e 1 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) em 400 mL de água Desionizada e mexa a 60 ° C até a dissolução completa de soluto. Deixe a solução arrefecer a pH de solução RT. Adjust para 7,8 e o volume da solução final de 500 mL. Esterilize a solução por filtração.
   Nota: A solução de SDS deve ser preparada antes de usar. Solução de filtro só depois completar a dissolução do SDS, caso contrário as partículas insolúveis SDS ficarão saturados o filtro, mudando a concentração final de SDS e, consequentemente, afetando a eficiência de decellularization de tecido.
4. Para tampão de lavagem hipotônica (10 mM Tris): misturar 1,21 g de TrisBASE em 900 mL de DI água. Ajustar o pH da solução para 7,8 e o volume final para 1 L. filtro, esterilize em autoclave e armazenar no RT
5. Para o tratamento de DNase (20 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 50 DNase U/mL): dissolver 2,42 g de TrisBASE e 2 mL de 1m MgCl₂ em 900 mL de água Desionizada. Ajustar o pH a 7,8 e o volume de solução final para 1 L. filtro e esterilizar a solução por autoclave. Armazenar a solução no RT. Adicionar DNase eu (50 U/mL) antes de usar.
6. Para DNase armazeno solução: preparar uma reserva de DNase contendo 50% de glicerol, pH 7,5, 1 mM MgCl₂, do Tris-HCl de 20mm e ajustar para um volume de solução final de 10 mL com água. Em uma capa de fluxo laminar, adicione o DNase I do pó para o buffer de DNase e misture suavemente até dissolução completa. Esterilize a solução através de filtro de 0,22 μm. Alíquotas de 1ml de preparar e armazenar a-20 ° C.

2. tecido colheita e criopreservação

1. Eutanásia em fêmeas grávidas adultas em 18 dias de gestação (fetos E18) através do CO₂ asfixia. Realizar uma cesariana em fêmeas com uma tesoura cirúrgica e coletar os cornos uterinos, tendo os ratos fetais para uma placa de Petri com PBS 1x gelada usando duas pinças serrilhadas com pontas curvadas (uma pinça para cada extremidade do chifre).
   1. Abra os cornos uterinos e o saco amniótico para isolar os fetos. Transferi os fetos para uma nova placa de Petri com PBS 1x gelada para anestesia e decapitar com uma tesoura.
   2. Eutanásia em camundongos C57BL/6 machos 7-8 semanas de idade, usando CO₂ asfixia. Realizar uma incisão no peito cada rato e recolher o coração.
   3. Brevemente enxague o coração fetal e adulta com gelo frio 1X PBS.
2. Remova os átrios do coração adulto com a ajuda de um bisturi. Realizar uma incisão no ventrículo direito e removê-lo usando tesouras pequenas em linha reta. Expor a parede interna do ventrículo esquerdo através da remoção do septo. Em uma nova placa de Petri, dividir o ventrículo esquerdo livre-parede em tiras longitudinais com espessura de 2 mm e remover o músculo papilar usando um bisturi e uma pinça serrilhada com pontas curvadas.
   1. Impostos especiais de consumo pequeno tecido explantes com a ajuda de um bisturi, usando uma grade de 2 x 2 mm (descrição detalhada na complementar 1 da figura⁵). Brevemente enxague o tecido explantes com PBS 1x.
3. Adicione ~ 250 µ l da temperatura de corte ideal (OCT) composta para tubos de microcentrifuga autoclavado 1,5 mL. Transferir todo fetais corações e explantes cardíacas adultos para os tubos com 250 µ l de PTU e congelá-los com gelo seco refrigerado isopentano e loja a-80 ° C (até um máximo de 6 meses).
   Nota: O uso de tecido cardíaco explantes criopreservado por mais de 6 meses irá reduzir significativamente a eficiência de decellularization, especialmente em explantes de tecido do coração adulto.

3. decellularization de tecido

Nota: Decellularization de tecido cardíaco é executada em uma placa de cultura de tecido de 24-poço com uma amostra por bem. Bem, 1 mL de cada solução de decellularization é adicionado para cada indivíduo. Todos os decellularization de etapas devem ser executadas com agitação a 165 rpm (agitador incubadora orbital de 20 mm de diâmetro) e a 25 ° C, a menos que especificado em contrário. Para mais detalhes, consulte o esquema na figura 1A. Anfotericina B (fungizone, por exemplo ) e gentamicina são recém adicionados a todas as soluções de decellularization antes do uso para uma concentração final de 2,5 μg/mL e 0,01 μg/mL, respectivamente. Para quantificar a quantidade de DNA mantida dentro de tecidos decellularized, a amostra massa precisa ser determinada antes de iniciar o protocolo decellularization. O protocolo de quantificação de DNA é mais detalhadas na seção 5.1.

1. DIA 1
   1. Retire amostras de tecido do freezer-80 ° C. Deixe a 1,5 mL microcentrifuge tubos em RT até OCT torna-se parcialmente derretido. Transferi o bloco de tecido cardíaco da OCT ainda congelado para uma placa de Petri com PBS 1x.
   2. Depois derrete a OCT, mova o tecido cardíaco para uma nova placa de Petri com PBS 1x. Amostras de lavagens em 1 x PBS e a 60 rpm com um misturador de 10-15 min. repetir pelo menos duas vezes.
   3. Adicione 1 mL de trabalhar hipotônica Buffer por alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço estéril. Transferi uma amostra por poço com a ajuda de pinças.
   4. Mova a placa de cultura de tecidos de 24-bem com as amostras de um agitador de incubadora a 25 ° C e iniciar a incubação de 18 h com Buffer hipotônica.
2. DIA 2
   1. Prepare a solução de SDS de 0,2%, conforme descrito na seção 1.3.
   2. Aspirar o Buffer hipotônica e lavar as amostras com PBS 1x por vezes de 1 h. repetir 3.
      Nota: Ponto de pausa: tecido sob decellularization pode ser mantido em 1X PBS a 4 ° C por 18 h em condições estáticas.
   3. Remover a PBS 1x, adicionar 1 mL da solução de SDS recém-feitos (etapa 1.3) por bem e incubar as amostras por 24 h.
      Nota: Incubação SDS de Post (CHECK POINT), certifique-se de que as amostras apresentam um branco a aparência translúcida. Neste passo, SDS tratadas amostras são encharcadas de DNA, apresentando uma consistência de gelatina. Remova a solução de SDS lentamente para evitar aderência de amostra para a ponta da pipeta.
3. DIA 3
   1. Lave as amostras com amortecedor da lavagem hipotônica (1 mL por bem) por 20 min. repetir 3 vezes.
      Nota: Neste passo, é normal observar uma diminuição do tamanho da amostra devido à remoção de restos celulares. PONTO de pausa: Tecido sob decellularization pode ser mantido no tampão de lavagem hipotônica a 4 ° C por 18 h em condições estáticas.
   2. Adicionar 1 mL da solução de tratamento de DNase por bem e incubar as amostras por 3 h a 37 ° C.
   3. Aspirar a solução de tratamento de DNase e lavar as amostras com PBS 1x (1 mL por bem) por 20 min. repetir 3 vezes. Realize uma lavagem final com PBS 1x (1 mL por bem) durante a noite no RT e sacudindo a 60 rpm.
   4. (Ponto de verificação) Após o tratamento de DNase, certifique-se de que as amostras decellularized perderam a consistência de gelatina.
      Nota: Após o tratamento de DNase, retire e adicione 1X PBS suavemente, desde que as amostras podem ser facilmente aprisionadas e anexadas a ponta da pipeta.

4. avaliação da remoção de células do tecido decellularized

1. Corrigir as amostras em uma placa de cultura de tecido de 24-poço, 1 amostra por alvéolo, adicionando 1 mL de recém-feitos tampão neutro de formalina 10% com eosina aquosa de 0,03% para 2,5-3 h no RT
   Nota: Eosina é adicionada para o fixador para manchar o tecido decellularized e para facilitar a visualização da amostra durante o corte e a coloração histológica. A adição da eosina que nem interfere com as manchas histológicas, nem com as técnicas de imunofluorescência. Alternativamente, a fixação pode ser realizada durante a noite a 4 ° C.
2. Remover a solução fixador e adicione 1 mL de 1X PBS para lavar a amostra.
3. Encapsule o bioscaffolds fixo no processamento de histologia gel usando um molde de amostra de vinil descartáveis de acordo com as instruções do fabricante.
4. Remova o gel histologia com a amostra incorporada do molde e transferência para fitas de processamento/incorporação de biópsia com tampa.
   Nota: Uma alternativa ao tecido incorporação em histologia e processamento gel é para processar cada amostra em duas esponjas de biópsia com pequenos poros. As amostras devem ser localizadas ao centro das esponjas para habilitar a detecção de biópsia. Digno de nota, algumas amostras podem ser difíceis de localizar usando esta abordagem.
5. Processar as amostras para parafina incorporação através da incubação do sucessivas (30 min por solução) em série de concentrações de álcool (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solução de Hidrocarboneto alifático ISO-parafínicos (2 estações de incubação) e parafina (incubação 2 estações) a 56 ° C.
6. Monte as amostras em um bloco de parafina.
7. Corte 3 seções de parafina μm de espessura em um micrótomo e recolher as seções sobre lâminas de microscópio.
8. Cortes de parafina secar durante a noite a 37 ° C.
   Nota: Cortes de parafina (pausa ponto) são armazenadas a 4 ° C até utilização posterior.
9. Para verificar a eficiência do protocolo, execute hematoxilina e eosina (H & E) e Trichrome de Masson coloração (MT) das secções de amostra decellularized e secções de tecido não-manipulada de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: H & E mancha manchas cela núcleos azul/roxo, citoplasma rosa/vermelho escuro e rosa pálido de colágeno e MT manchas núcleos pretos, vermelha, citoplasma e colágeno e mucina azul. Decellularization eficiente é alcançada quando uma luz rosa porosa (H & E, MT) e azul rede (MT) é observada, na ausência de uma mancha nuclear.

5. avaliação da remoção de material nuclear de tecido decellularized

Nota: A quantificação do teor de DNA no tecido decellularized deve ser realizada em comparação com o respectivo tecido não-manipulada.

1. Antes decellularization, pese um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL em uma balança digital de alta precisão. O tecido cardíaco de transferência para o tubo, remover a quantidade extra de 1X PBS e pesar o tubo com as amostras. Calcule o peso molhado das amostras:
   _{Peso úmido} da amostra = peso _{tubo com amostras} – peso _{tubo vazio}
2. Decellularize as amostras conforme descrito na etapa 3.
3. Após decellularization, colete os tecidos decellularized em um tubo de microcentrifugadora.
   1. Devido às pequenas dimensões e massa das amostras cardíacas individuais e as especificações do kit, piscina decellularized tecidos de cada condição de amostra (coração fetal: 5 corações toda; adulto LV explantes: 15 explantes). Execute o mesmo procedimento com o tecido não-manipulado.
      Nota: (Ponto de pausa) as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até a extração de DNA e quantificação são executadas.
4. Cortar o não-manipulada e decellularized tecidos em pequenas explantes com a ajuda de um bisturi em um tubo de ensaio limpo.
   Nota: Utilize um bisturi individual e placa de Petri para cada amostra. Ruptura mecânica das amostras com um bisturi facilita sua posterior digestão enzimática e posterior extração de DNA.
5. Para a extração de DNA, use um método de extração de DNA de rotação-coluna com base de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Colete as amostras dissociadas mecanicamente da placa de Petri com o buffer de mestre digestão (digestão buffer e proteinase K) de acordo com as instruções do fabricante usando uma ponta de pipeta de orifício largo.
      Nota: Lise de tecido com Proteinase K digestão é mais rápida em decellularized amostras. Para processar amostras distintas ao mesmo tempo, manter amostras lisadas no gelo, até que todas as amostras lysed para minimizar a degradação. Lise de amostras completa é alcançada entre 4-6 h.
   2. Prossiga com o protocolo de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Para aumentar o rendimento de DNA extraído de amostras de tecido decellularized e não decellularized, Eluir o DNA em 25-50 μL e 100 μL de tampão de eluição, respectivamente. Coletar o DNA eluted e carregar a rotação-coluna. Incube durante 1 min no RT. Centrifugar as amostras de acordo com as instruções do fabricante.
      Nota: (Pausa ponto) o ADN extraído das amostras pode ser loja a-20 ° C até utilização posterior.
6. Quantificar o DNA extraído de amostras com um kit de deteção fluorescente dsDNA seguindo as instruções do fabricante.
7. Normalize o conteúdo de DNA como nanogramas de DNA por miligrama de massa úmida da amostra inicial (antes decellularization).

6. célula decellularized andaimes semeadura

Nota: Todas as soluções/reagentes precisam ser esterilizadas e todo o procedimento realizado em condições estéreis.

1. Preparar 1 x DPBS com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 1% P/S (penicilina, 100 UI; estreptomicina 100 µ g/mL).
2. Retire a última etapa de lavagem de decellularization (etapa 3.3.3) a 1 x solução de PBS e adicionar 500 μL por poço do recentemente preparada 1 x DPBS/2,5 μg/mL de solução B/1% P/S anfotericina. Armazenar as amostras em 4 ° C, de 1-7 dias.
   Nota: O armazenamento de amostras a 4 ° C é importante para manter a esterilidade.
3. Adicione P/S a célula basal mídia (sem FBS e suplementos) a uma concentração final de 1%.
4. Aspire 1 x DPBS/2.5 μg/mL de solução B/1% P/S anfotericina das amostras decellularized. Adicionar 500 μL por poço de célula basal media/1% P/S e deixe amostras equilibrar durante 1 h a 37 ° C, ou a 4 ° C por mais de 1h.
5. Dividir as células de interesse e preparar pequenas alíquotas de células para a densidade da célula desejada.
   Nota: O tecido decellularized semeadura deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico e em condições estéreis. Meios de cultura de célula deve conter 1% P/S.
6. Adicionar 3-4 μL de DPBS ao centro de um poço de uma placa de 96 poços. Usando uma pinça fina e reta, transferir os andaimes decellularized para a queda DPBS, remover o DPBS extra por aspiração e certifique-se que a amostra não é dobrada ou amassada. Deixá-lo a tornar-se seca nas bordas para aderir à superfície bem.
   Nota: Andaimes destacados tem baixa eficiência de semeadura.
7. Adicione células para o cadafalso pipetando a célula única solução lentamente contra as bordas do poço.
   Nota: por exemplo, rato neonatal cardiomyocytes são semeadas com em uma densidade de 7.500 células/mm² e rato imortalizado Lin⁻ Sca-1⁺ cardíaca células progenitoras (iCPC^Sca-1) com uma densidade de 60-1.500 células/mm². Ajuste a densidade da célula de acordo com a lógica experimental.
8. Adicione DPBS nos poços vizinhos para evitar a evaporação rápida da mídia.
9. 24 horas pós semeadura de célula, se o tipo de célula usado aderiu para as placas de poliestireno de cultura de tecidos (PFC), transferência de bioscaffolds para um novo poço. Caso contrário, substitua o meio para remover as células não-aderentes.
10. Mude-se cuidadosamente os meios de comunicação de acordo com exigências específicas do tipo de célula.

Resultados

A eficiência de decellularization deve ser avaliada através de três principais técnicas: observação macroscópica, histologia e quantificação de DNA. A aparência macroscópica de tratamento de amostras post-SDS indiretamente afeta a eficácia da remoção da célula. Após a incubação do SDS, amostras devem aparecer como translúcidas para esbranquiçado (Figura 1). Fetal (E18) decellularized tecidos são caracterizados por uma estrutura altamente ...

Discussão

A matriz extracelular (ECM) é uma malha altamente dinâmica e complexa de glicoproteínas fibrosas e adesivas, consistindo de um reservatório de inúmeros peptídeos bioativos e fatores de crescimento aprisionados. Como o principal modulador de adesão celular, dinâmica do citoesqueleto, mobilidade/migração, proliferação, diferenciação e apoptose, ECM ativamente regula o comportamento e a função celular. Sabendo que o diferente comportamento celular em culturas 2D e 3D, tem havido esforços para desenvolver mo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker	Orbital Shakers	IKA:3510001	Recommended
Fluorimeter	-	-	Equipment available
Digital weight scale	-	-	Equipment available
Inverted Microscope	-	-	Equipment available
Cell culture incubator	-	-	Equipment available
Fridge (4ºC)	-	-	Equipment available
Deep freezer (-80ºC)	-	-	Equipment available
Microtome	-	-	Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	5000-08	Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox	Fine Science Tools	11254-20	Recommended
Dumont 7 forceps	Fine Science Tools	11272-30	Recommended
Dissecting Scissors, straight	-	-	Tool available
Forceps, serrated, curved	-	-	Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped	VWR	29442-044	-
96 well plates, individually wrapped	VWR	71000-078	-
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized	Millipore	SE1M179M6	-
Eppendorff	-	-	Material available
15 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430791	-
50 mL Falcon tubes	Fisher Scientific	430829	-
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid	Electron Microscopy Science	70075-B	-
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	22-037-246	-
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006	-
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane)	Sigma-Aldrich	277258-1L	-
Dry ice	-	-	-
Decellularization
NaCl	BDH Prolabo	27810.364	-
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S-31264	-
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-100g	-
KCl	Sigma-Aldrich	P8041-1KG	-
TrisBASE	Sigma-Aldrich	T6066-500G	-
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L-4390	-
MgCl2	MERCK	1.05833.1000	-
DNAse I	AplliChem	A3778,0050	-
Gentamicin	Gibco	15710-049	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Histology
10 % formalin neutral buffer	Prolabo	361387P	-
Eosin Y AQUEOUS	Surgipath	01592E	Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	-
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous	Aga	4,006,02,02,00	-
Deionized water (DI water)	-	-	-
Clear Rite 3	Richard-Allan Scientific	6915	-
Shandon Histoplast	Thermo Fisher Scientific	RAS.6774006	-
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	-
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit	Invitrogen	P11496	-
Cell culture
DPBS	VWR	45000-434	-
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Labclinics	L0022-100	-
Fungizone	Gibco BRL	15290-026	-
Cell culture media of the cell of interest	-	-	-