القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة

Summary

الكريات البيضاء شوق تتفاعل مع خلايا الأوعية الدموية والصفائح الدموية بعد إصابة الجدار السفينة أو أثناء التهاب. وهنا يصف لنا تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية.

Abstract

تجنيد الكريات البيضاء عند الإصابة أو التهاب للمواقع من ضرر أو تلف الأنسجة حققت خلال العقود الأخيرة، وقد أدى مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض لا بعد تماما حددت. التوظيف الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال العدوى والتهاب (السيارات) محصنة والبحوث، فإننا نعرض تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، و التهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. يمكن استخدام التحليل في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. ويصف هذا البروتوكول تحليل القائم على التدفق الصفحي استخدام دائرة التوازي-تدفق و مقلوب مجهر تباين المرحلة متصلة بكاميرا لدراسة التفاعلات بين الكريات البيضاء وخلايا بطانية أو الصفائح الدموية، التي يمكن أن تصور وتسجل ثم تحليل دون اتصال. يمكن pretreated خلايا بطانية أو الصفائح الدموية أو الكريات البيضاء مع مثبطات أو الأجسام المضادة لتحديد دور جزيئات محددة أثناء هذه العملية. شروط القص، أي الشرياني أو الوريدي القص الإجهاد، يمكن تكييفها بسهولة من اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة.

Introduction

عند الإصابة أو الالتهاب أو العدوى، الكريات البيضاء بسرعة الاستجابة الممرض أو الأضرار-المرتبطة بالجزيئات أنماط (بامبس، دامبس)، تغيير في حالة نشطة، والانتقال من مجرى الدم إلى مواقع لتلف الأنسجة والتهاب. قدرة الكريات البيضاء على التفاعل مع بيئتها الخلوية والجزيئية ضروري لوظيفتها الصحيحة كالخلايا المناعية، كما أبرزت الاضطرابات الوراثية مثل نقص التصاق الكريات البيض¹. التصاق الكريات البيض خضعت لتحقيقات مكثفة خلال العقود الماضية وأسفر ذلك عن مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض في أوائل التسعينات^2،3. التصاق الكريات البيض تبدأ بإلقاء القبض على سيليكتين بوساطة الكريات البيضاء إلى البطانة، مما تسبب في الخلايا للفة فوق سطح الأوعية الدموية. هذا المتداول تمكن الكريات البيضاء المسح الضوئي لربط البطانة المهاجرة العظة، مثلاً، المستقطبات، والحث على تفعيل إينتيجرينس. وفي وقت لاحق، التوسط integrins المنشط الربط إلى يغاندس بطانية، أسفرت عن اعتقال الكريات البيض وطيد. في وقت لاحق قد تعد الكريات البيضاء اكسترافاساتي بالزحف والانتشار، قبل اختراق أحادي الطبقة البطانية وترانسميجراتينج إلى الأنسجة الكامنة. المفهوم الأساسي لسلسلة الكريات البيض المتعارف عليه قد يتغير إلى حد كبير منذ إطلاقها، مع بعض الخطوات الوسيطة وأضاف⁴. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة وأدوار العديد من اللاعبين المتورطين في تجنيد الكريات البيض لم توضح حتى الآن، وتجنيد الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال الإصابة بالتهاب و (السيارات-) محصنة ضد البحث.

على سبيل المثال، أثناء أمراض التهاب الأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين، زيادة تجنيد الكريات البيض في وضع اللوحة محركات الأقراص الجدار السفينة. قد تمزق لويحات تصلب الشرايين غير مستقرة، مما يؤدي إلى تنشيط واسعة النطاق لنظام التخثر والصفائح الدموية، وفيما بعد انسداد السفينة⁵. قد ينتج هذا عن نتائج القلب والأوعية الدموية الشديدة مثل احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية. وباﻹضافة إلى ذلك، تعرية غشائي كما يحدث سريرياً، مثلاً بعد الدعامات للشريان التاجي، يؤدي إلى العديد من التفاعلات من الكريات البيضاء والصفائح الدموية إلى داخل الجدار سفينة مكشوفة (مثلاً، عناصر المصفوفة وسلس خلايا العضلات) والكريات البيضاء مع الصفائح الدموية تغطي إصابة الأوعية الدموية. هذه التفاعلات تعتبر هامة لمواصلة تطوير هذا المرض كما قد تدفع التفاعلات الوحيدات-الصفائح الدموية نيوينتيما تشكيل^6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، توسط التفاعلات الكريات البيض الصفيحات الكريات البيض إنتغرين ماك-1 (α β_م2) والصفائح الدموية GPIbα قد حددت مؤخرا كسائقين رواية تجلط الدم في الفئران⁸.

ونظرا لتوافر الدم البشري والحيواني على نطاق واسع كمصدر للكريات البيضاء والصفائح الدموية للبحوث، وطائفة واسعة من الجزيئات مصفوفة معزولة وخطوط الخلية مخلدة الكريات البيض ومنشأ الأوعية الدموية، أنه من الممكن لمحاكاة الكريات البيض التفاعلات تحت التدفق في مختبر للإعداد، باستخدام الدوائر نضح تدفق مصممة خصيصا. وقد صممت العديد من المتغيرات العقود الماضية، بدءاً من يحركها الفراغ إلى الدوائر نضح ذاتية اللصق. كافة المتغيرات تشترك في هذا الجزء غير متحركة (مثلاً، واستزراع خلايا الأوعية الدموية أو مصفوفة البروتينات) يتم تجميعها إلى غرفة مانعة للتسرب أكبر مزودة بقناة معرفة مسبقاً تمكين نضح السوائل فوق الجزء غير متحرك. وباﻹضافة إلى ذلك، مكن التقدم في صب التكنولوجيا وضع حلول مخصصة استناداً إلى السليكا البوليمرات⁹. اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة أساسا تحديد خصائص القص إجهاد الجهاز نضح تدفق¹⁰. في هذه المقالة، نقدم الأسلوب في المختبر لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، والتهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. استفادة الأساليب المقدمة هنا هو أنها يمكن أن يؤديها باستخدام مجهر الأسفار كاميرا متصلة مشتركة، ولا تتطلب من المجربون أن تمتلك الكفاءة التقنية العالية. الفحص في المختبر يمكن التلاعب بطرق عديدة (مثلاً، عن طريق إضافة مثبطات أو حجب الأجسام المضادة)، وهكذا قابلاً للتطبيق في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية ويسمح التحقيق في التصاق وظائف البروتين أو تقييم لمركبات معينة.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها الأخلاقية الطبية ومجالس الأخلاقية الحيوان في جامعة ماستريخت.

1-تدفق على أساس مقايسة مع الخلايا البشرية

1. عزل الصفائح الدموية من الدم البشري
   1. سحب الدم الوريدي في تخثر سترات (3.2 في المائة).
   2. إضافة إلى حجم 1/15 من "حمض سترات الدكستروز" (حوار التعاون الآسيوي: سترات صوديوم 80 مم، وحمض الستريك 52 مم والجلوكوز 183 مم) في الدم.
   3. الطرد المركزي في 350 x ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
   4. نقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة المجلد 1/20 من حوار التعاون الآسيوي.
   5. الطرد المركزي في 1,110 ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الفقيرة الصفائح الدموية (تعادل القوة الشرائية).
   6. تجاهل المادة طافية. قطع نهاية طرف بيبيت (1000 ف)، يجعلها واسعة تتحمل، فيها الإيدز في منع تنشيط الصفائح الدموية، وتعليق بيليه الصفائح الدموية بعناية في نفس وحدة التخزين كالحزب الثوري في الصفيحات المخزن المؤقت pH 6.6 (PB: 136 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم هيبيس ، 2.7 مم بوكل، 2 مم مجكل₂والبومين المصل البقري 0.1% والجلوكوز 0.1%). إضافة إلى حجم 1/20 من حوار التعاون الآسيوي وتخلط برفق.
   7. بيليه الصفائح الدموية في 1,110 ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة.
   8. تجاهل المادة طافية وتعليق الصفائح الدموية أعلاه بعناية في المخزن المؤقت للصفائح الدموية 1 مل (درجة الحموضة 7.5).
   9. قياس تركيز الصفائح الدموية في تمييع 1/10 مع محلل الدم الآلي.
   10. ضبط حجم الصوت مع المخزن المؤقت للصفائح الدموية (درجة الحموضة 7.5) لتحقيق عد من 2 × 10⁷/mL.
2. عزل خلايا النوى من الدم البشري (مقتبس من برينكمان et al. ¹¹ )
   1. رسم 24 مل دم في الهيبارين (10 U/mL) تخثر الدم.
   2. إضافة 6 مل من كثافة 1.077 غ/مل بوليسوكروسي الصوديوم دياتريزواتي المتوسطة (انظر الجدول للمواد) إلى الأنبوبة المخروطية 15 مل، وعناية الطبقة 5-6 مل الدم كله على أعلى.
   3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز دون الفرامل.
   4. نضح وتجاهل الطبقة العليا مصفر واضح ونقل في مرحلة المحمر السفلي يحتوي على المحببة إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل جديدة. تغسل الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 مم أدتا إلى وحدة تخزين نهائي 14 مل، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل.
   5. وفي الوقت نفسه، تعد وسيلة تدرج في كثافة (مثلاً، بركل، انظر الجدول للمواد) حل عملي بخلط 18 مل الكثافة المتوسطة التدرج مع 2 مل 10 × الحل مخزون برنامج تلفزيوني. تمييع هذا الحل العمل مع برنامج تلفزيوني (س 1) للحصول على مل 4.25 كل حل من الحلول المتوسطة التدرج 85%، 80%، 75%، 70%، و 65%.
   6. إعداد أنابيب مخروطية 2 مع التدرج كثافة من طبقات 2 مل من كل نسبة مئوية متوسطة فوق بعضها البعض. بدء تشغيل مع أعلى تركيز والاستمرار في ترتيب تنازلي. علامة الطبقات في الأنبوب مع علامة الماء.
   7. الطبقة 2 مل تعليق خلية على كل من التدرجات استعداد اثنين بعناية.
   8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز دون الفرامل في أجهزة الطرد مركزي متوازنة بعناية.
   9. بعد الطرد المركزي، إزالة الطبقة العليا وأكثر من 65% طبقة (الحلقة الأولى) مع ببمكس، وجمع في أنابيب جديدة الأبيض الباقية إينتيرفاسيس حتى الطبقة 85% (الدائري الثاني، المجنحة).
   10. تغسل الخلايا عن طريق ملء أنابيب مع برنامج تلفزيوني 2 مم يدتا، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل.
   11. إزالة المادة طافية وتعليق الخلايا رسابة (عادة % إيه ناين فايف هي المجنحة) في 1 مل من المخزن المؤقت في هانك (pH 7.45)، التي تحتوي على 10 ملم الزلال البشري حبيس و 0.2 في المائة (مقايسة المخزن المؤقت).
   12. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتعليق الخلايا في/mL⁶1 x 10.
   13. تواصل مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3).
3. إعداد ملتصقة الصفائح الدموية وخلايا الأوعية الدموية-مونولاييرس
   1. إعداد طبق ثقافة الخلية (الخلايا المستزرعة)
      1. قبل معطف أطباق الثقافة خلية 35 ملم مع 1 مل الكولاجين ذيل الجرذ المخفف (30 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني تصفيتها عبر فلتر 0.2 ميكرون).
      2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتجاهل الحل الكولاجين، وغسل الطبق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
   2. ثقافة خلايا الأوعية الدموية في أطباق الثقافة
      1. فصل الابتدائي (مثلاً، هوفيك, هاويك, هاوسمك) أو خلايا الأوعية الدموية مخلدة (مثلاً، عصام. Hy926، سفيك) ارتفع إلى التقاء في قارورة T75 مع 1.5 مل الخلية المفرزة الحل (مثلاً، أككوتاسي). إضافة 4.5 مل متوسط النمو المناسبة لتحييد الحل مفرزة الخلية وتحديد تركيز الخلية مع خلية العد الدائرة. تعليق الخلايا في 0.5 × 10⁵ خلايا/مل في المتوسطة النمو المناسب (مثلاً، الخلية البطانية كاملة النمو المتوسطة).
      2. إضافة 2 مل تعليق خلية لكل طبق 35 ملم. ثقافة الخلايا في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ حتى التقاء (أخذ ح 24 – 48، تبعاً لنوع الخلية).
   3. إعداد ساترة زجاجية (ملتصقة الصفائح الدموية)
      1. تزج ساترة زجاجية مرة في HCl-EtOH (1.2 متر/50% v/v).
      2. شطف ساترة 2 مرات في الماء عالي النقاوة.
      3. جاف ساترة تحت ن₂.
      4. معطف قبل ساترة زجاجية مع 100 ميليلتر، وفقا لموقف القناة الدائرة نضح الفئران المخفف الذيل الكولاجين النوع الأول (30 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني تصفيتها عبر فلتر 0.2 ميكرون).
      5. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت وتجاهل الحل الكولاجين، وتغسل ساترة 3 x مع برنامج تلفزيوني.
      6. كتلة ساترة الكولاجين المغلفة مع جيش صرب البوسنة 1% في حبيس ح 0.5 في الرايت
      7. تغسل والجاف ساترة وجبل في قاعة التروية. عزل الصفائح الدموية من البشر أو الدم الماوس كما هو موضح في الخطوة 1، 1 أو 2-1، على التوالي.
   4. التثبيت من الصفائح الدموية
      1. إضافة 70 ميليلتر من 2 × 10⁷/mL الصفائح الدموية تعليق كل قناة، واحتضان ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
      2. عناية استبدال الصفائح الدموية غير ملتصقة بعرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في حبيس) مدة 30 دقيقة على الأقل في متابعة الرايت مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3).
   5. تنشيط خلايا الأوعية الدموية أحادي الطبقة
      1. تنشيط الخلايا والأوعية الدموية بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة التي تحتوي على 10 α عامل نخر الورم نانوغرام/مليلتر (TNFα) ح 4 في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.

2-القائم على التدفق المقايسة مع خلايا موريني

1. عزل الصفائح الدموية من الدم الماوس
   1. تخديره من سحب الدم من ثقب القلب باستخدام إبرة ز 21 (~ 1 مل) من (الكيتامين 80 ملغ/كغ وميديتوميديني 0.3 مغ/كغ) الأسبوع 6-8-الفئران القديمة (C57Bl/6) في سترات (3.2 في المائة) تخثر الدم.
   2. إضافة إلى حجم 1/6 لحوار التعاون الآسيوي.
   3. أجهزة الطرد المركزي في 220 س ز، والفرامل متوسطة لمدة 5 دقائق للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
   4. نقل المادة طافية (~ 600 ميليلتر) بالإضافة إلى 1/3 خلايا الدم الحمراء إلى أنبوب جديد
   5. الطرد المركزي في 95 ز العاشر دون الفرامل لمدة 6 دقائق.
   6. نقل المادة طافية (PRP) وقياس تركيز الصفائح الدموية في 1/10 إضعاف في المخزن المؤقت تيرودي (TH المخزن المؤقت: 136 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم هيبيس، 2.7 مم بوكل، 0.42 مم NaH₂بو₄* ح₂س، 2 مم مجكل₂، ألبومين المصل البقري 0.1% و 0.1% الجلوكوز) مع محلل الدم الآلي.
   7. تغسل الصفائح بإضافة المجلد 1/25 لحوار التعاون الآسيوي + 0.1 مليلتر يو أبيراسي، والطرد المركزي في 2,870 ز، فرامل متوسطة لمدة 2 دقيقة.
   8. تجاهل المادة طافية وإضافة 600 ميليلتر TH العازلة، المجلد 1/10 لحوار التعاون الآسيوي، وأبيراسي U/mL 0.1. قطع الحافة بيبيت (1000 ف)، يجعلها واسعة تتحمل، مما يساعد في منع تنشيط الصفائح الدموية، وتعلق بلطف بيليه.
   9. أجهزة الطرد المركزي في 2,870 ز، والفرامل متوسطة لمدة 2 دقيقة
   10. تجاهل المادة طافية وتعليق الصفائح بلطف في المخزن المؤقت لل.
   11. ضبط حجم الصوت بال المخزن المؤقت لتحقيق عد من 2 × 10⁷/mL.
2. إعداد مونولاييرس الصفائح الدموية ملتصقة
   1. إعداد ساترة زجاجية (الصفائح الدموية ملتصقة) حسب 1.3.3.
3. التثبيت من الصفائح الدموية
   1. إضافة 100 ميليلتر من 2 × 10⁷/mL الصفائح الدموية تعليق كل قناة، واحتضان ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
   2. استبدال بعناية الصفائح الدموية غير ملتصقة بعرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في هيبيس) مدة 30 دقيقة على الأقل في متابعة الرايت مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3)
4. تنشيط ماوس الصفيحات أحادي الطبقة
   1. قبل التروية من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3)، حفز الصفائح نضح ثرومبين (0.5 nM) في المخزن المؤقت حصصة لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.

3. فلوري وسم ونضح من الكريات البيضاء (المجنحة أو THP-1 للإنسان و RAW264.7 أو وحيدات الماوس الأساسي للتحليل القائم على التدفق مورين)

1. وسم نيون
   1. قم بتسمية الكريات البيضاء (1 × 10⁶/mL) مع الحمض النووي الفلورية الخضراء خلية بيرمينت وصمة عار (1 ميكرومتر). احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. وقف الخلايا بتركيز 0.5 × 10⁶ خلايا/مل (5 مل كل شرط الاختبار، تبعاً لمعدل التدفق) في المخزن المؤقت للمقايسة، وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
2. تدفق إعداد المقايسة الدائرة
   1. لالتصاق الكريات البيض في أحادي الطبقة خلية، تجاهل مستنبت الخلية من الطبق، وجمع في قاعة تدفق. قم بتوصيل أنابيب المحاقن. لالتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المعطل تداولها، قم بتوصيل الشريحة مايكرو المحاقن. قبل الحارة حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
   2. تأخذ حقنه التروية (50 مل)، المحاقن التثبيت على حامل حقنه، ومجموعة سحب المضخة على الوضع. تعيين حجم مضخة لمل 0، وتعيين القطر إلى 26.70 مم لحقنه 50 مل.
   3. قم بتوصيل موصل اللوير كوع واحدة من نهاية الأنبوب. ضع مقرنة قفل اللوير للمحاقن وتوصيل الأنابيب مع موصل اللوير الكوع المقرنة قفل اللوير. قم بتوصيل نهاية الأنابيب مجاناً إلى الدائرة تدفق.
3. نضح الكريات البيض والالتصاق
   1. لالتصاق الكريات البيض في أحادي الطبقة خلية، تجاهل مستنبت الخلية من الطبق، وجمع في قاعة تدفق. قم بتوصيل أنابيب المحاقن. لالتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المعطل تداولها، قم بتوصيل الشريحة مايكرو المحاقن.
   2. لنضح الكريات البيض والالتصاق أكثر الأوعية الدموية-أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية، وضع الأنبوب الثاني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمقايسة وملء الأنابيب مع 1 مل بيبيت، ثم الضغط الأنابيب وتوصيله إلى دائرة تدفق.
   3. قبل التروية الكريات البيض، إضافة 3 مم كاكل₂ و 2 مم مجكل₂ إلى تعليق خلية واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. نتخلل الإنزيم المخزن المؤقت قبل التروية للخلايا لإزالة جوية محتملة من الدائرة والأنابيب.
   5. أغلق أنبوب ينتهي بالضغط على ضيق وتبديل الأنابيب من المخزن المؤقت للمقايسة إلى تعليق خلية، منع فقاعات الهواء من الوقوع. نتخلل الخلايا مع الإجهاد القص/معدل التدفق المناسب حتى تصل الخلايا الأولى.
   6. نتخلل الخلايا مع الإجهاد القص/معدل التدفق المناسب لمدة 2 دقيقة، والتقاط صور على الأقل 6 بين دقيقة 2-6 خلايا متجددة وملتصقة مجهر تباين/فلورية مرحلة مقلوب (مثلاً، أفوس-فلوريدا) استخدام التكبير X 100 متصل أن كاميرا رقمية CCD أو CMOS.
      ملاحظة: إجهاد القص/معدل التدفق يعتمد على تدفق الدائرة الأبعاد واللزوجة من بيرفوساتي. لنضح الدائرة المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: إجهاد القص (1 داين/سم²)
      Η: اللزوجة (0.015 داين * s/سم²)
      Φ: معدل التدفق (0.67 مل/دقيقة)
4. التصاق الكريات البيض دي
   1. دياديسيون، تبديل الأنابيب من تعليق خلية إلى المخزن المؤقت للفحص بالضغط في الأنابيب، الحيلولة دون أن تصبح المحاصرين فقاعات الهواء.
   2. فصل الخلايا من نضح مع المخزن المؤقت للمقايسة مع التأكيد على معدل/قص تدفق مناسب (انظر 3.3.7 الملاحظة).
5. التهجير الكريات البيض
   1. للتهجير الكريات البيض، نتخلل الكريات البيضاء (الخطوة 3) حتى تنضم كمية كافية من الكريات البيضاء (~ 50 عرض الخلايا/حقل).
   2. استبدال تعليق الكريات البيض مع المخزن المؤقت للمقايسة.
   3. سجل خلايا ترانسميجراتينج بواسطة الفاصل الزمني كل 10 – 15 ثانية لمدة 30 – 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

النتائج

دراسة التصاق غشائي الكريات البيض، كانت perfused المسمى فلوريسسينتلي THP-1 خلايا أكثر TNFα-أو غير-حفز غشائي أحادي الطبقة لمدة 2 دقيقة في 3 داين/سم². العدد الإجمالي للخلايا مونوسيتيك ملتصقة تحددها بعد 2 دقيقة من نضح التقاط 6 حقول مستقلة على مدى فترة من 2-6 دقيقة. تم قياس كمية الخل...

Discussion

هذا التحليل في المختبر وسيلة مباشرة للتحقيق في الآليات الأساسية للتوظيف الكريات البيض أثناء التهاب الأوعية الدموية، ولكن هناك بعض النقاط الحرجة للإشارة إلى. الشرط الأول لنجاح إجراء هذا الفحص هو نضح من الكريات البيضاء حالها والمتلاقية الأوعية الدموية أو أحادي الطبقة الصفائح الدموي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood