На основе ламинарного потока Assays расследовать лейкоцита набора на искусственный сосудистый клетки и сторонником тромбоцитов

Резюме

Лейкоциты жадно взаимодействуют с сосудистой лейкоцитов и тромбоцитов после травмы судно стены или во время воспаления. Здесь мы опишем простой ламинарного потока на основе анализа характеризовать молекулярные механизмы, которые лежат в основе взаимодействия между лейкоцитов и их партнерами по сотовой.

Аннотация

Набор лейкоцитов после травмы или воспаления сайты травмы или повреждения тканей была исследована в последние десятилетия и привело к концепции Каскад адгезии лейкоцитов. Однако точные молекулярные механизмы, участвующие в лейкоцитарной набора еще определены не полностью. Поскольку набор лейкоцита остается важным вопросом в области инфекции, воспаления и иммунных исследований (авто-), мы представляем простой ламинарного потока на основе анализа для изучения основных механизмов адгезии, де адгезии, и трансмиграции лейкоцитов при венозной и артериальной потока режимах. В vitro assay может использоваться для изучения молекулярных механизмов, которые лежат в основе взаимодействия между лейкоцитов и их клеточных партнерами в различных моделях сосудистого воспаления. Этот протокол описывает ламинарного потока на основе анализа, используя камеру параллель потока и инвертированным микроскопом контраст фазы, подключен к камере для изучения взаимодействия лейкоциты и эндотелиальных клеток или тромбоциты, которые могут быть визуализированы и зарегистрированы то проанализированы в автономном режиме. Эндотелиальные клетки, тромбоциты или лейкоциты могут быть предварительно обработанных с ингибиторами или антител для определения роли конкретных молекул в ходе этого процесса. Сдвига условия, т.е. артериальной или венозной касательное напряжение, может быть легко адаптирована по вязкости и расхода жидкости перфузии и высота канала.

Введение

После травмы, воспаление или инфекция лейкоциты быстро реагировать на возбудителя - или повреждения связанные молекулярные модели (PAMPs, DAMPs), изменения в активированное состояние и выбраться поток крови к местам воспаления и тканей повреждения. Лейкоциты способность взаимодействовать с их клеточном и молекулярном окружающей среды имеет важное значение для их правильной работы как иммунные клетки, как подчеркнул генетических расстройств, таких как дефицит адгезии лейкоцитов¹. Лейкоцитарной адгезии был предметом интенсивных исследований в течение последних десятилетий, и это привело к концепции Каскад адгезии лейкоцитов в начале 1990-х^2,3. Лейкоцитарной адгезии инициируется селектина посредничестве захвата лейкоциты эндотелия, вызывая клеток для пролонгировать поверхности сосудов. Это подвижного позволяет лейкоцитов для проверки эндотелий прыгните мигрирующих подсказки, например, chemokines, которые вызывают активацию интегринов. Впоследствии активированные интегринов посредником привязки эндотелиальных лигандами, результате фирмы лейкоцита ареста. Лейкоциты могут впоследствии подготовиться к extravasate ползать и распространение, перед прорезывать эндотелиальной монослоя и пролетный в основной ткани. Основная концепция канонической лейкоцита Каскад остается практически неизменной с момента ее введения, с некоторые промежуточные шаги добавил⁴. Тем не менее точные молекулярные механизмы и роли многих игроков, участвующих в лейкоцитарной найма не выяснены до настоящего времени, и лейкоцитарной набор остается важным вопросом в области инфекции, воспаления и (авто-) иммунной исследования.

Например во время сосудистый воспалительных заболеваний как атеросклероз, увеличилась лейкоцита вербовки в развитие зубного налета диски судна стены. Нестабильные атеросклеротических бляшек может разрыва, привело к массовым активации тромбоцитов и свертывающей системы и впоследствии окклюзии сосуда⁵. Это может привести к тяжелой сердечно-сосудистые исходы, такие как инфаркт миокарда или инсульт. Кроме того эндотелиальных денудации как она возникает клинически, например после стентирования коронарных артерий, приводит к множество взаимодействий лейкоцитов и тромбоцитов до внутренней стены подвергается сосуд (например, матрица компоненты и гладкой мышечных клеток) и лейкоцитов с тромбоцитов, охватывающих сосудистых повреждений. Эти взаимодействия имеют важное значение для дальнейшего развития этого заболевания как Моноцит тромбоцитов взаимодействия может управлять neointima формирования^6,7. Кроме того тромбоцитов и лейкоцитов взаимодействия при посредничестве Интегрин лейкоцита Mac-1 (α_Mβ₂) и тромбоцитов GPIbα недавно были определены как Роман драйвера тромбоза в мышей⁸.

Учитывая широкую доступность крови человека и животных как источник лейкоцитов и тромбоцитов исследований, и широкий спектр изолированных матрица молекул и увековечен клеточных линий лейкоцитов и сосудистого происхождения, это возможно для имитации лейкоцитов взаимодействие в поток в лаборатории установки, используя специально разработанные потока перфузии камер. Многие варианты были разработаны за последние десятилетия, начиная от вакуум driven самоклеящиеся перфузии камер. Все варианты имеют в общем, которые неподвижной части (например, искусственный сосудистый клетки или матрица белков) собираются в больших герметичным камеру с предварительно определенный канал включение перфузии жидкости над неподвижной части. Кроме того прогресс в технологии формования включена разработка заказных решений на основе силики полимеров⁹. Главным образом определить касательное напряжение характеристики потока перфузии устройство¹⁰вязкости и расхода жидкости перфузии и высота канала. В этой статье мы представляем в vitro метод для изучения основных механизмов адгезии, снижения адгезии и переселение лейкоцитов при венозной и артериальной потока режимах. Преимущество методов, представленные здесь заключается в том, что они могут быть выполнены с использованием общей микроскоп камера подключена флуоресценции и не требуют экспериментаторов обладают высокой технической квалификации. В пробирке можно манипулировать во многих отношениях (например, путем добавления ингибиторы или блокирование антитела) и таким образом является применимым в различных моделях сосудистого воспаления и позволяет исследование адгезии функций белков или Оценка конкретных соединений.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены медицинской этики и животных этические советы Маастрихтского университета.

1. на основе потока проба с клеток человека

1. Изоляция тромбоцитов крови человека
   1. Нарисуйте венозной крови в антикоагулянтом цитрат (3,2%).
   2. Добавить 1/15 объем кислоты цитрат декстрозы (ACD: 80 мм тринатрия цитрат, лимонная кислота 52 мм и 183 мм глюкозы) в крови.
   3. Центрифуга на 350 x g без тормоза за 15 мин до получения тромбоцитов богатой плазмы (PRP).
   4. Супернатант передать 15 мл Конические трубки и добавить 1/20 объем ACD.
   5. Центрифуга в 1110 g без тормоза за 15 мин до получения тромбоцитов бедных плазмы (ППС).
   6. Выбросите супернатант. Отрезать конце кончика пипетки (P 1000), что делает широкий родила, которых СПИД в предотвращении активации тромбоцитов и тщательно приостановить гранулы тромбоцитов в том же объеме, как ОТР в тромбоцитов буфер рН 6,6 (РВ: 136 мм NaCl, 10 мм Hepes 2,7 мм KCl, 2 мм MgCl₂, альбумина bovine сыворотки 0,1% и 0,1% раствор глюкозы). Добавить 1/20 объем ACD и аккуратно перемешать.
   7. Гранулы тромбоцитов в 1110 g без тормозов на 15 мин.
   8. Отменить супернатант и тщательно приостановить тромбоцитов как выше в 1 мл тромбоцитов буфере (рН 7,5).
   9. Измерьте содержание тромбоцитов в 1/10 разрежения с автоматизированный гематологический анализатор.
   10. Отрегулируйте громкость с буфером тромбоцитов (рН 7,5) для достижения количество 2 x 10-7/мл.
2. Изоляция полиморфноядерных клеток из крови человека (адаптировано из Бринкманн и др. ¹¹ )
   1. Нарисуйте 24 мл крови в гепарина (10 ед/мл), как антикоагулянт.
   2. Добавить 6 мл 1,077 г/мл плотности polysucrose натрия diatrizoate среды (см. Таблицу материалы) до 15 мл Конические трубки и тщательно слой 5-6 мл цельной крови на вершине.
   3. Центрифуги для 20 минут, 800 x g без тормозов.
   4. Аспирационная и отбросить ясно желтоватым верхний слой и передаче этапа нижнего красноватые, содержащие гранулоцитов в свежие 15 мл конические трубы. Вымойте клетки путем добавления PBS, содержащий 2 мм ЭДТА в окончательный объем 14 мл и центрифуги для 10 мин на 300 x g без тормозов.
   5. В то же время, готовить градиент средней плотности (например, percoll, см. Таблицу материалы) рабочий раствор путем смешивания средний градиент плотности 18 мл 2 мл 10 x PBS Стоковый раствор. Разбавляют этот рабочий раствор с PBS (1 x) для получения 4.25 мл каждого из 85%, 80%, 75%, 70% и 65% градиента средних решений.
   6. Подготовьте 2 конические трубы с градиент плотности, расслоение 2 мл каждый средний процент поверх друг друга. Начните с самой высокой концентрацией и далее в порядке убывания. Марк слои на трубе с маркером воды доказательство.
   7. Тщательно слой 2 мл суспензии клеток на каждой из двух подготовленных градиентов.
   8. Центрифуги для 20 минут, 800 x g без тормозов в центрифугу тщательно сбалансированный.
   9. После центрифугирования, снимают верхний слой и большинство из 65% слой (первое кольцо) с получения и собирать в новые трубы белый, оставаясь интерфазы до 85% слой (второе кольцо, ПМН).
   10. Вымойте клетки, заполнив трубы с PBS 2 мм ЭДТА и центрифуги для 10 мин на 300 x g без тормозов.
   11. Удалить супернатант и приостановить отложившейся ячейки (обычно ≥95% ПМН) в 1 мл Хэнка буфера (рН 7,45), содержащий 10 мм Hepes и 0,2% человеческого альбумина (Assay buffer).
   12. Подсчитать ячейки, используя Горяева и приостановить клеток в 1 x 10-6/мл.
   13. Продолжите с люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (шаг 3.3).
3. Подготовка адэрентных тромбоцитов и сосудистой клеток монослои
   1. Подготовка клетки культуры блюдо (культивируемых клеток)
      1. Предварительно покройте блюда культуры клеток 35 мм с 1 мл разбавленной крысы хвост коллагена (30 мкг/мл разбавленной в PBS, фильтруется через фильтр 0.2 мкм).
      2. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C, отменить решение коллаген и мыть блюдо с PBS.
   2. Культура клеток сосудистой блюдах культуры
      1. Отсоединить основной (например, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) или увековечен сосудистой клетки (например, EA. Hy926, SVEC) выросла до впадения в колбе T75 с 1,5 мл раствора отряд клеток (например, accutase). Добавление 4,5 мл соответствующего роста средних для нейтрализации клеток отряд решения и определения концентрации клеток с ячейкой подсчета камеры. Приостановите клетки на 0,5 x 10⁵ клеток/мл в соответствующий рост среднего (например, средний рост полный эндотелиальных клеток).
      2. Добавьте 2 мл суспензии клеток к каждому блюду 35 мм. Культура клетки в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO₂ до слияния (с 24-48 ч, в зависимости от типа ячейки).
   3. Стекло coverslip подготовки (Адгезивная тромбоцитов)
      1. Погружать стекла coverslip раз в HCl-EtOH (1,2 М / 50% v/v).
      2. Промывайте coverslip 2 раза в ультрачистая вода.
      3. Сухой coverslip под N₂.
      4. Предварительно пальто coverslip стекла с 100 мкл, в соответствии с позицией канала перфузии палаты разреженных крысы хвост коллаген типа I (30 мкг/мл разбавленной в PBS, фильтруется через фильтр 0.2 мкм).
      5. Инкубируйте 30 мин на RT, отменить решение коллаген и мыть coverslip 3 x с PBS.
      6. Блок coverslip коллагена покрытием с 1% BSA в HEPES на 0,5 ч на RT.
      7. Вымыть и высушить coverslip и смонтировать его в камеру перфузии. Изолируйте тромбоцитов человека или мыши крови, как указано в шаге 1.1 и 2.1, соответственно.
   4. Иммобилизация тромбоцитов
      1. 70 мкл суспензии 2 x 10 по⁷тромбоцитов/мл на канал и проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C и 5% CO₂.
      2. Тщательно Замените non сторонник тромбоцитов блокирования решения (5% BSA в HEPES) для по крайней мере 30 минут на RT. Continue с люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (шаг 3.3).
   5. Стимуляция монослоя клеток сосудов
      1. Стимулировать клетки сосудистой, заменив СМИ с свежими СМИ, содержащие 10 нг/мл фактор некроза опухоли альфа (TNFα) за 4 ч при 37 ° C и 5% CO₂.

2. на основе потока проба с мышиных клетки

1. Изоляция тромбоцитов крови мыши
   1. Крови обратить сердца прокола иглой 21 G (~ 1 мл) от наркоза (кетамин 80 мг/кг и medetomidine 0,3 мг/кг) 6-8 недели-старых мышей (C57Bl/6) в цитрат (3,2%), как антикоагулянт.
   2. Добавьте 1/6 объем ACD.
   3. Центрифуга на 220 x g, Средний тормозной 5 минут для получения тромбоцитов богатой плазмы (PRP).
   4. Передать новые трубки супернатант (~ 600 мкл) плюс 1/3 красных кровяных клеток
   5. Центрифуга на 95 x g без тормозов для 6 мин.
   6. Передача супернатант (PRP) и измерять концентрацию тромбоцитов в разведении 1/10 в Tyrode в буфере (TH буфера: 136 мм NaCl, 5 мм Hepes, 2,7 мм KCl, 0,42 мм NaH₂PO₄* H₂O, 2 мм MgCl₂, альбумина bovine сыворотки 0,1% и 0,1% глюкоза) с автоматизированный гематологический анализатор.
   7. Вымойте тромбоцитов, добавив 1/25 объем ACD + 0,1 ед/мл apyrase и центрифуги на 2870 g, Средний тормозной на 2 мин.
   8. Отменить супернатант и добавить 600 мкл й буфер, 1/10 объема ACD и 0,1 apyrase ед/мл. Отрезать верхушку пипетки (P 1000), что делает широкий родила, который помогает в профилактике активации тромбоцитов и осторожно приостановить гранулы.
   9. Центрифуга на 2870 g, Средний тормозной 2 мин
   10. Отменить супернатант и осторожно приостановить тромбоцитов в буфере тыс.
   11. Отрегулируйте громкость с TH буфер для достижения количество 2 x 10-7/мл.
2. Подготовка монослои адэрентных тромбоцитов
   1. Подготовка стекла coverslip (Адгезивная тромбоцитов) согласно 1.3.3.
3. Иммобилизация тромбоцитов
   1. 100 мкл суспензии 2 x 10 по⁷тромбоцитов/мл на канал и проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C и 5% CO₂.
   2. Тщательно Замените non сторонник тромбоцитов блокирования решения (5% BSA в HEPES) для по крайней мере 30 минут на RT. Continue с люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (шаг 3.3)
4. Стимуляция мыши тромбоцитов монослоя
   1. До перфузии лейкоцитов (шаг 3.3), стимулировать тромбоцитов, перфузии тромбина (0,5 Нм) в буфер HHHSA за 3 мин при 37 ° C.

3. люминесцентные маркировки и перфузии лейкоцитов (ПМН или THP-1 для человека и RAW264.7 или мыши моноциты для мышиных Assay на основе потока)

1. Флуоресцентные метки
   1. Ярлык лейкоцитов (1 х 106/мл) с пятно клеток permeant Зеленый флуоресцентный нуклеиновой кислоты (1 мкм). Инкубировать клетки для 30 минут при 37 ° C.
   2. Вымыть клетки с PBS центрифугированием при 300 g x 5 минут и приостановить клетки к концентрации 0,5 х 10⁶ клеток/мл (5 мл на условие теста, в зависимости от расхода) в assay buffer.
2. Подготовка Пробирная палата потока
   1. Для адгезии лейкоцитов на монослое клеток отказаться от среднего культуры клеток от блюдо и собрать его в камеру потока. Подключение труб к шприцу. Для адгезии лейкоцитов на иммобилизованных тромбоцитов Подключите микро слайд шприца. Предварительно теплой на водяной бане до 37 ° C.
   2. Возьмите шприц перфузии (50 мл), установить шприц на держатель шприц и установите насос на снять режим. Установка насоса громкости, 0 мл и задайте диаметр 26.70 мм для 50 мл шприц.
   3. Подключите коннектор "Луер" локоть к одному концу трубки. Место стяжку замком luer шприц и подключить трубы с локоть разъем luer luer замок автосцепки. Подключите конец свободного трубы к камере потока.
3. Лейкоцитарные перфузии и адгезии
   1. Для адгезии лейкоцитов на монослое клеток отказаться от среднего культуры клеток от блюдо и собрать его в камеру потока. Подключение труб к шприцу. Для адгезии лейкоцитов на иммобилизованных тромбоцитов Подключите микро слайд шприца.
   2. Для лейкоцитов перфузии и адгезии над сосудистой- или тромбоцитов монослоя, поместите второй трубы в конической Тюбик 50 мл, содержащие assay buffer и заполнения трубки с 1 мл пипетки, затем сожмите трубки и подключить его к камере потока.
   3. До лейкоцита перфузии добавить 3 мм CaCl₂ и 2 мм MgCl₂ суспензию клеток и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
   4. Perfuse аналитического буфера до перфузии клеток, чтобы удалить возможные воздуха из камеры и труб.
   5. Закрыть концы трубы, сжимая их жесткой и переключения труб из буфера пробирного суспензию клеток, предотвращая пузырьки воздуха от защемления. Perfuse клетки с соответствующего потока скорость/касательное напряжение, до тех пор, пока прибывают первые клетки.
   6. Perfuse клетки с соответствующего потока скорость/касательное напряжение на 2 мин и захватить по крайней мере 6 фотографии между 2-6 мин прокатки и адэрентных клеток с помощью микроскопа контраст/флюоресценцию Перевернутый фазы (например, EVOS-FL) связано с использованием 100 крат для цифровой CCD и CMOS камеры.
      Примечание: Потока скорость/касательное напряжение зависит от потока размеры камеры и вязкость perfusate. Для перфузии камеры, используемые здесь (см. Таблицу материалы):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: Касательное напряжение (1 Дин/см²)
      Η: вязкость (0,015 dyn * s/см²)
      Φ: скорость потока (0,67 мл/мин)
4. Де адгезии лейкоцитов
   1. Для de-adhesion переключение труб из суспензии клеток пробирного буфер, сжимая труб, предотвращая стать в ловушке пузырьков воздуха.
   2. Отсоедините клетки, перфузии с Пробирной буфера с соответствующим потока скорость/касательное напряжение (см. 3.3.7 Примечание).
5. Лейкоцитарные перелетах
   1. Для переселения лейкоцитов, perfuse лейкоциты (шаг 3) до тех пор, пока достаточное количество лейкоцитов присоединиться (~ 50 клеток/просмотреть поле).
   2. Замените лейкоцита подвеска аналитического буфера.
   3. Запись пролетный клетки на промежуток времени каждые 10 – 15 s для 30 – 60 минут при 37 ° C.

Результаты

Для изучения эндотелиальной лейкоцитарной адгезии, дневно обозначенные THP-1 клетки были увлажненную над TNFα - или не стимулирует эндотелиальной монослоя за 2 мин на 3 Дин/см². Общее количество адэрентных клеток monocytic был определен после 2 мин перфузии, захватив 6 нез?...

Обсуждение

Этот assay в vitro простой метод для изучения основных механизмов найма лейкоцитов во время сосудистого воспаления, но есть некоторые критические точки следует отметить. Первым требованием для успешного выполнения этот assay является перфузии лейкоциты над нетронутыми и вырожденная со?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood