Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Resumo

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Resumo

O recrutamento de leucócitos após lesão ou inflamação a locais de lesão ou dano tecidual foi investigado durante décadas recentes e resultou no conceito de cascata de adesão de leucócitos. No entanto, os mecanismos moleculares exatos envolvidos no recrutamento de leucócitos ainda não foram totalmente identificados. Desde o recrutamento de leucócitos continua a ser um tema importante no campo da infecção, inflamação e (auto) imune pesquisa, apresentamos um ensaio simples baseada em fluxo laminar para estudar os mecanismos subjacentes da adesão, de adesão, e transmigração de leucócitos sob regimes de fluxo arterial e venoso. O ensaio em vitro pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre leucócitos e seus parceiros celulares em diferentes modelos de inflamação vascular. Este protocolo descreve um ensaio baseado em fluxo laminar, utilizando uma câmara de fluxo paralelo e um microscópio de contraste de fase invertido conectado a uma câmera para estudar as interações de leucócitos e células endoteliais ou plaquetas, que podem ser visualizadas e gravadas em seguida análise off-line. Células endoteliais, plaquetas ou leucócitos podem ser pré-tratados com inibidores ou anticorpos para determinar o papel de moléculas específicas durante este processo. Condições de cisalhamento, ou seja, arterial ou venosa tensão de cisalhamento, podem ser facilmente adaptadas pela viscosidade e vazão dos fluidos perfundidos e a altura do canal.

Introdução

Após lesão, inflamação ou infecção, leucócitos respondem rapidamente ao patógeno ou dano-associada molecular padrões (PAMPs, represas), mudar para um estado ativado e mover fora do fluxo de sangue para locais de inflamação e tecido danos. A capacidade dos leucócitos de interagir com seu ambiente celular e molecular é essencial para a sua correta função como células do sistema imunológico, como destacado por desordens genéticas, como a adesão de leucócitos deficiência¹. Adesão de leucócitos tem sido objecto de intensa investigação durante as últimas décadas, e isto resultou no conceito de cascata de adesão de leucócitos no início da década de 1990,^2,3. Adesão de leucócitos é iniciada pela captura selectina-mediada dos leucócitos ao endotélio, fazendo com que as células a rolar sobre a superfície vascular. Este rolamento permite leucócitos procurar pistas migratórias endotélio-limite, por exemplo, quimiocinas, que induzem a ativação das integrinas. Posteriormente, as integrinas activadas mediam a ligação a ligantes endoteliais, resultando na prisão de leucócitos firme. Leucócitos podem posteriormente Prepare-se para extravasate rastejando e espalhando-se, antes de penetrar a monocamada endotelial e reencarnando no tecido subjacente. O conceito básico da cascata canônico leucócito tem permaneceram praticamente inalteradas desde a sua introdução, com algumas etapas intermediárias adicionado⁴. No entanto, os mecanismos moleculares exatos e os papéis de muitos jogadores envolvidos no recrutamento de leucócitos não foram clarificados, até agora, e recrutamento de leucócitos continua a ser um tema importante no campo da infecção, inflamação e (auto-) imune pesquisa.

Por exemplo, durante doenças inflamatórias vasculares como aterosclerose, aumentou o recrutamento de leucócitos para o vaso parede drives placa desenvolvimento. Ateroma instável pode se romper, levando à enorme ativação de plaquetas e o sistema de coagulação e posteriormente à oclusão do vaso⁵. Isso pode resultar em graves resultados cardiovasculares como infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral. Além disso, por exemplo, após implante de stent de uma artéria coronária, desnudamento endotelial que ocorre clinicamente, conduz a uma infinidade de interações de leucócitos e plaquetas para o interior de parede vaso expostas (por exemplo, componentes de matriz e liso as células do músculo) e de leucócitos com plaquetas cobrindo a lesão vascular. Essas interações são importantes para o desenvolvimento da doença como interações monócito plaquetas podem conduzir neointima formação^6,7. Além disso, as interações leucócito-plaquetas mediada por leucócitos integrina Mac-1 (_M. α β₂) e plaquetas GPIbα recentemente foram identificados como drivers de romance de trombose em ratos⁸.

Dada a ampla disponibilidade de sangue humano e animal como fonte de leucócitos e plaquetas para pesquisa e o amplo espectro de moléculas isoladas de matriz e linhas de célula imortalizado de origem vascular e leucócitos, é possível simular leucócitos interações sob fluxo em um laboratório de configuração, usando câmaras de perfusão de fluxo especialmente concebidos. Muitas variantes foram projetadas nas últimas décadas, variando de orientado a vácuo para câmaras de perfusão autoadesivo. Todas as variantes têm em comum que a parte imóvel (por exemplo, culturas de células vasculares ou proteínas da matriz) é montada em uma câmara de estanques maior equipada com um canal predefinido permitindo a perfusão dos fluidos sobre a parte do imóvel. Além disso, os avanços na tecnologia de moldagem permitiram o desenvolvimento de soluções sob medidas com base em polímeros de silicone⁹. A viscosidade e a taxa de fluxo do líquido perfundido e a altura do canal principalmente determinam as características de tensão de cisalhamento do fluxo da perfusão dispositivo¹⁰. Neste artigo, apresentamos uma in vitro método para estudar os mecanismos subjacentes da adesão, de adesão e transmigração de leucócitos sob regimes de fluxo arterial e venoso. A vantagem dos métodos apresentados aqui é que eles podem ser executados usando um microscópio de fluorescência conectado a câmera comum e não exigem um experimentadores possuir alta proficiência técnica. O ensaio em vitro podem ser manipulado de várias maneiras (por exemplo, adicionando inibidores ou bloqueando os anticorpos) e, portanto, é aplicável em diferentes modelos de inflamação vascular e permite a investigação de adesão funções de proteína ou o avaliação de compostos específicos.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela ética médica e Animal placas de ética da Universidade de Maastricht.

1. baseado em fluxo de ensaio com células humanas

1. Isolamento de plaquetas do sangue humano
   1. Tirar sangue venoso em anticoagulante citrato (3,2%).
   2. Adicionar 15/1 volume de ácido citrato Dextrose (ACD: citrato trissódico 80mm, ácido cítrico de 52mm e glicose 183 mM) para o sangue.
   3. Centrifugar a 350 g de x sem freio por 15 min obter plasma rico de plaquetas (PRP).
   4. Transferir o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL e adicionar o volume de 1/20 do ACD.
   5. Centrifugar a 1.110 g sem freio por 15 min obter plasma pobre de plaquetas (PPP).
   6. Desprezar o sobrenadante. Cortar a extremidade da ponta da pipeta (P. 1000), tornando-o grande furo, que auxilia na prevenção da ativação plaquetária e cuidadosamente suspender o sedimento de plaquetas no mesmo volume que o PRP em plaquetas tampão de pH 6,6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl₂, albumina de soro bovino 0,1% e 0,1% de glicose). Adicionar o volume de 1/20 do ACD e misture suavemente.
   7. Granule as plaquetas no 1.110 g sem freio por 15 min.
   8. Desprezar o sobrenadante e cuidadosamente suspender as plaquetas como acima em 1 mL de tampão de plaquetas (pH 7,5).
   9. Medir a concentração de plaquetas em uma diluição de 1/10 com um analisador de hematologia automatizada.
   10. Ajuste o volume com tampão de plaquetas (pH 7,5) para alcançar uma contagem de 2 x 10⁷/mL.
2. Isolamento de células polimorfonucleares de sangue humano (adaptado de Brinkmann et al ¹¹ .)
   1. Desenhe 24 mL de sangue em heparina (10 U/mL) como anticoagulante.
   2. Adicionar 6 mL de meio de diatrizoate de polysucrose de sódio de densidade 1,077 g/mL (ver Tabela de materiais) para um tubo cônico de 15 mL e cuidadosamente a camada 5-6 mL sangue na parte superior.
   3. Centrifugar por 20 min a 800 x g sem freio.
   4. Aspire e descartar a camada superior claro amarelada e transferir a fase inferior avermelhada contendo granulócitos em frescos tubos cônicos de 15 mL. Lave as células adicionando PBS contendo 2 mM EDTA até um volume final de 14 mL e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g sem freio.
   5. Entretanto, preparar um meio de gradiente de densidade (por exemplo, percoll, consulte Tabela de materiais) solução de trabalho misturando meio gradiente de densidade de 18 mL com 2 mL 10 x solução de PBS. Diluir esta solução do trabalho com PBS (1 x) para obter 4,25 mL de cada uma das soluções médias gradientes de 85%, 80%, 75%, 70% e 65%.
   6. Prepare 2 tubos cónicos com o gradiente de densidade por camadas de 2 mL de cada percentual médio em cima do outro. Comece com a maior concentração e continuar em ordem decrescente. Marca as camadas do tubo com um marcador à prova de água.
   7. Camada cuidadosamente 2 mL das suspensões celulares para cada um dos dois gradientes preparados.
   8. Centrifugar por 20 min a 800 x g sem freio em uma centrífuga cuidadosamente equilibrada.
   9. Após a centrifugação, remover a camada superior e a maioria dos 65% da camada (primeiro anel) com PBMC e coletar em tubos de novos o branco permanecendo interface até a camada de 85% (segundo anel, PMN).
   10. Lave as células por encher os tubos com PBS 2 mM EDTA e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g sem freio.
   11. Remover o sobrenadante e suspender as células sedimentadas (tipicamente ≥ 95% são PMN) em 1 mL de tampão de Hank (pH 7,45), contendo 10 mM Hepes e 0,2% de albumina humana (buffer de ensaio).
   12. Contar as células usando um hemocytometer e suspender as células em 1 x 10⁶/mL.
   13. Continue com a rotulagem fluorescente e perfusão dos leucócitos (passo 3.3).
3. Preparação de plaquetas aderentes - e célula vasculares-monocamadas
   1. Preparação de prato de cultura celular (células cultivadas)
      1. Pre-revesti os pratos de cultura de célula de 35mm com 1 mL de colágeno de cauda de rato diluída (30 µ g/mL diluído em PBS, filtrado por um filtro de 0,2 µm).
      2. Incubar durante 30 min a 37 ° C, descartar a solução de colágeno e lave o prato uma vez com PBS.
   2. Cultura de células vasculares em pratos de cultura
      1. Desanexe primária (por exemplo, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) ou imortalizadas células vasculares (por exemplo, EA. Hy926, SVEC) crescido a confluência em balão T75 1,5 mL solução de desprendimento de células (por exemplo, accutase). Adicione 4,5 mL de meio de cultura apropriado para neutralizar a solução de desprendimento de célula e determinar a concentração de células com uma célula de contagem câmara. Suspenda as células em 0,5 x 10⁵ células/mL em meio de cultura apropriado (por exemplo, meio de crescimento de célula endotelial completa).
      2. Adicione 2 mL de suspensão de células para cada prato de 35 mm. Cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% CO₂ até confluência (tendo 24 – 48 h, dependendo do tipo de célula).
   3. Preparação da lamela de vidro (plaquetas aderentes)
      1. Mergulhe a lamela de vidro uma vez em HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
      2. Enxágue a lamela 2 vezes em água ultrapura.
      3. Seque a lamela sob N₂.
      4. Pré-revestimento a lamela de vidro com 100 µ l, em conformidade com a posição do canal da câmara de perfusão de colágeno de cauda de rato diluídos tipo I (30 µ g/mL diluído em PBS, filtrado por um filtro de 0,2 µm).
      5. Incubar durante 30 min à RT, descartar a solução de colágeno e lave a lamela 3 x com PBS.
      6. Bloco a lamela de colágeno revestido com 1% de BSA em HEPES para 0,5 h no RT
      7. Lave e seque a lamela e montá-lo na câmara de perfusão. Isole as plaquetas de humano ou sangue de rato, conforme descrito no passo 1.1 e 2.1, respectivamente.
   4. Imobilização de plaquetas
      1. Adicionar 70 µ l de uma suspensão de plaquetas 2 x 10⁷/mL por canal e incube por 1,5 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
      2. Cuidadosamente, substitua as plaquetas não-aderente com solução de bloqueio (5% BSA em HEPES) pelo menos 30 min em RT. Continue com rotulagem fluorescente e perfusão dos leucócitos (passo 3.3).
   5. Estimulação da monocamada de células vasculares
      1. Estimula as células vasculares, substituindo os meios de comunicação com a mídia fresca contendo 10 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNFa) por 4 h a 37 ° C e 5% de CO₂.

2. baseado em fluxo de ensaio com células murino

1. Isolamento de plaquetas do sangue de rato
   1. Sorteio de sangue por punção cardíaca, usando uma agulha 21G (~ 1 mL) de anestesiados (cetamina 80 mg/kg e medetomidina 0,3 mg/kg) de 6-8 semanas-ratos velhos (C57Bl/6) no citrato (3,2%) como anticoagulante.
   2. Adicione o volume de 1/6 da ACD.
   3. Centrífuga a 220 x g, freio médio por 5 min obter plasma rico de plaquetas (PRP).
   4. Transferir o sobrenadante (~ 600 µ l) mais 1/3 das células vermelhas do sangue para um tubo novo
   5. Centrifugar a 95 x g sem freio para 6 min.
   6. Transfira o sobrenadante (PRP) e medir a concentração de plaquetas em uma diluição de 1/10 no buffer de Tyrode (buffer de TH: 136 mM de NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH₂PO₄* H₂O, 2 mM MgCl₂, albumina de soro bovino 0,1% e 0,1% glicose) com um analisador de hematologia automatizada.
   7. Lave as plaquetas, adicionando o volume de 1/25 da ACD + 0.1 Apirase U/mL e centrifugar a 2.870 g, freio médio por 2 min.
   8. Desprezar o sobrenadante e adicionar 600 µ l TH buffer, volume 1/10 do ACD e 0.1 Apirase U/mL. Cortar a ponta da pipeta (P. 1000), tornando-o grande furo, que auxilia na prevenção da ativação plaquetária e suspender suavemente a pelota.
   9. Centrífuga a 2.870 g, freio médio por 2 min
   10. Desprezar o sobrenadante e suspender suavemente as plaquetas no buffer de TH.
   11. Ajuste o volume com buffer de TH para alcançar uma contagem de 2 x 10⁷/mL.
2. Preparação de monocamadas de plaquetas aderentes
   1. Prepare a lamela de vidro (plaquetas aderentes) conforme 1.3.3.
3. Imobilização de plaquetas
   1. Adicione 100 µ l de uma suspensão de plaquetas 2 x 10⁷/mL por canal e incube por 1,5 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
   2. Cuidadosamente, substituir as plaquetas não-aderente com solução de bloqueio (5% BSA em HEPES) pelo menos 30 min em RT. Continue com rotulagem fluorescente e perfusão dos leucócitos (passo 3.3)
4. Estimulação de monocamadas de plaquetas de rato
   1. Antes da perfusão dos leucócitos (passo 3.3), estimular as plaquetas por perfusão de trombina (0,5 nM) no buffer HHHSA para 3 min a 37 ° C.

3. fluorescentes rotulagem e perfusão dos leucócitos (PMN ou THP-1 para humanos e RAW264.7 ou Mouse principal monócitos para ensaio baseado em fluxo murino)

1. Etiquetando fluorescente
   1. Rotule os leucócitos (1 x 10⁶/mL) com a mancha de ácido nucleico verde fluorescente de célula-permeant (1 µM). Incube as celulas por 30 min a 37 ° C.
   2. Lavar as células com PBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min e suspender as células a uma concentração de 0,5 x 10⁶ células/mL (5 mL por condição de teste, dependendo da taxa de fluxo) no buffer de ensaio.
2. Preparação de ensaio de câmara de fluxo
   1. Para adesão de leucócitos em uma monocamada de células, descartar o meio de cultura celular do prato e montá-lo na câmara de fluxo. Conecte o tubo para a seringa. Para adesão de leucócitos em plaquetas imobilizadas, conecte o micro slide para a seringa. Pré-aquecer o banho-maria a 37 ° C.
   2. Pegue uma seringa de perfusão (50 mL), seringa de instalação no suporte de seringa e conjunto de retirar a bomba na modalidade. Definir o volume da bomba para 0 mL e definir o diâmetro de 26,70 mm para a seringa de 50 mL.
   3. Conecte um conector luer em cotovelo para uma extremidade da tubulação. Coloque um acoplador de trava luer na seringa e conecte o tubo com o conector luer cotovelo para o acoplador de fechamento de luer. Conecte a extremidade livre do tubo para a câmara de fluxo.
3. Adesão e perfusão dos leucócitos
   1. Para adesão de leucócitos em uma monocamada de células, descartar o meio de cultura celular do prato e montá-lo na câmara de fluxo. Conecte o tubo para a seringa. Para adesão de leucócitos em plaquetas imobilizadas, conecte o micro slide para a seringa.
   2. Para perfusão de leucócitos e adesão sobre um vascular- ou monocamada de plaquetas, coloque o tubo de segundo em um tubo cônico de 50 mL contendo o buffer de ensaio e preenchimento de tubos com pipeta de 1 mL, em seguida, apertar o tubo e conectá-lo a uma câmara de fluxo.
   3. Antes da perfusão dos leucócitos, adicionar 3 mM CaCl₂ e 2 mM MgCl₂ à suspensão de células e incubar durante 5 min a 37 ° C.
   4. Perfundir buffer de ensaio antes da perfusão de células para remover possível ar da sala e a tubulação.
   5. Fechar as extremidades do tubo apertando-os firmemente e trocar o tubo de buffer de ensaio à suspensão de células, impedindo que as bolhas de ar sendo preso. Perfundir células com tensão de taxa/cisalhamento do fluxo adequado até que cheguem as primeiras células.
   6. Perfundir células com estresse de cisalhamento/taxa fluxo apropriado por 2 min e capturar pelo menos 6 fotos entre 2-6 min de rolamento e aderentes de células com um microscópio de fluorescência/contraste de fase invertida (por exemplo, EVOS-FL) usando a ampliação de 100 X conectado para uma câmera digital CCD ou CMOS.
      Nota: Stress/tensão de corte de taxa de fluxo depende de dimensões de câmara de fluxo e viscosidade do perfusato. Para a câmara de perfusão usada aqui (veja a Tabela de materiais):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: tensão de cisalhamento (1 dyn/cm²)
      Η: viscosidade (0.015 dyn * s/cm²)
      Φ: taxa de fluxo (0,67 mL/min)
4. A adesão de leucócitos
   1. Para de-adhesion, trocar tubulação de suspensão de células para buffer de ensaio apertando o tubo, impedindo que as bolhas de ar tornando-se presa.
   2. Separe células por perfusão com buffer de ensaio com uma tensão de taxa/cisalhamento do fluxo apropriado (ver 3.3.7 nota).
5. Transmigração de leucócitos
   1. Para transmigração de leucócitos, perfundir leucócitos (etapa 3) até que uma quantidade adequada de leucócitos aderem (campo de ~ 50 células/modo de exibição).
   2. Substitua a suspensão de leucócitos com buffer de ensaio.
   3. Gravar reencarnando células por lapso de tempo a cada 10-15 s para 30 a 60 min a 37 ° C.

Resultados

Para estudar a adesão endotelial de leucócitos, células de THP-1 fluorescente etiquetadas foram perfundidas sobre uma monocamada endotelial TNFa - ou não-estimulada por 2 min em 3 Dina/cm². O número total de células monocítica aderentes foi determinado após 2 min de perfusão capturando 6 campos independentes durante um período de 2-6 min. As células aderentes foram quantificadas pelo menos 6 imagens capturadas com um microscópio de fluorescência/contraste de fase i...

Discussão

Este ensaio em vitro é um método simples para investigar os mecanismos subjacentes de recrutamento de leucócitos durante a inflamação vascular, mas existem alguns pontos críticos a ser anotadas. O primeiro requisito para executar com êxito este ensaio é a perfusão de leucócitos sobre uma intacta e confluente vasculares ou monocamada de plaquetas. Isto pode ser conseguido pela prévia do revestimento das superfícies com colágeno tipo eu. Em geral, quando se trabalha com células vasculares primárias,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood