Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Riepilogo

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Abstract

Il reclutamento dei leucociti su lesioni o infiammazione ai siti di lesione o danno tissutale è stato studiato durante gli ultimi decenni ed ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita. Tuttavia, l'esatti meccanismi molecolari coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati ancora completamente identificati. Dal momento che il reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell'infezione, infiammazione e (auto-) ricerca immune, presentiamo un semplice test a flusso laminare per studiare meccanismi di fondo dell'aderenza, de-adesione, e trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. L'analisi in vitro può essere usata per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulare in diversi modelli di infiammazione vascolare. Questo protocollo descrive un'analisi basata su flusso laminare usando una camera di flusso parallelo ed un microscopio invertito di contrasto di fase collegato ad una macchina fotografica per studiare le interazioni dei leucociti e cellule endoteliali o piastrine, che possono essere visualizzate e registrate poi analizzati non in linea. Le cellule endoteliali, piastrine o dei leucociti possono essere pretrattati con inibitori o anticorpi per determinare il ruolo di specifiche molecole durante questo processo. Condizioni di taglio, cioè arteriosi o venosi shear stress, possono essere facilmente adattate dalla viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l'altezza del canale.

Introduzione

Alla ferita, infiammazione o infezione, il leucociti rispondono rapidamente all'agente patogeno o danni associata - molecolare modelli (PAMPs, DAMPs), cambiare in uno stato di attivazione e spostare fuori dal flusso di sangue ai siti di infiammazione e danno tissutale. La capacità dei leucociti per interagire con l'ambiente cellulare e molecolare è essenziale per la loro corretta funzione come cellule immuni, come evidenziato da malattie genetiche come l'adesione del leucocita carenza¹. L'adesione del leucocita è stato oggetto di intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni e ciò ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita nei primi anni 1990^2,3. L'adesione del leucocita è iniziata dalla cattura selectina-mediata dei leucociti all'endotelio, causando le cellule a rotolare sopra la superficie vascolare. Questo rotolamento permette di leucociti cercare spunti migratori endotelio associato, ad esempio, chemochine, che inducono l'attivazione delle integrine. Successivamente, le integrine attivate mediano l'associazione da ligandi endoteliali, con conseguente arresto del leucocita ferma. Leucociti successivamente possono preparare a MPEG strisciando e diffondendo, prima di penetrare il monostrato endoteliale e trasmigra in tessuto di fondo. Il concetto alla base della cascata del canonico del leucocita ha è rimasto pressoché invariato sin dalla sua introduzione, con alcuni passaggi intermedi aggiunto⁴. Tuttavia, i meccanismi molecolari esatti e i ruoli dei molti giocatori coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati chiariti finora, e reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell'infezione, infiammazione e (auto-) immuni ricerca.

Ad esempio, nel corso di malattie infiammatorie vascolari come l'aterosclerosi, aumentato reclutamento leucocitario nello sviluppo della placca vaso muro unità. Le placche aterosclerotiche instabili potrebbero rompersi, che conducono alla massiccia attivazione delle piastrine e del sistema di coagulazione e successivamente all'occlusione del vaso⁵. Ciò potrebbe comportare gravi esiti cardiovascolari come infarto miocardico o ictus. In più, per esempio dopo stenting di un'arteria coronaria, decumulazione endoteliali come esso si verifica clinicamente, conduce ad una moltitudine di interazioni dei leucociti e delle piastrine all'interno del muro vaso esposto (per esempio, componenti della matrice e liscio le cellule del muscolo) e dei leucociti con le piastrine che copre il danno vascolare. Queste interazioni sono importanti per l'ulteriore sviluppo della malattia come monociti e piastrine potrebbero guidare neointima formazione^6,7. Inoltre, interazioni della piastrina-leucocitarie mediata da integrine leucocitarie Mac-1 (α_Mβ₂) e della piastrina GPIbα sono state recentemente identificate come romanzo driver di trombosi in topi⁸.

Data l'ampia disponibilità di sangue umano e degli animale come fonte di leucociti e piastrine per la ricerca e l'ampio spettro di molecole di matrice isolato e linee cellulari immortalizzate di origine vascolare e del leucocita, è fattibile per simulare del leucocita interazioni in flusso in un laboratorio di impostazione, utilizzando appositamente progettato camere di aspersione di flusso. Molte varianti sono state progettate negli ultimi decenni, che vanno dal vuoto-driven agli alloggiamenti di aspersione autoadesiva. Tutte le varianti hanno in comune che la parte immobile (ad es., cellule vascolari coltivate o proteine della matrice) viene assemblata in una camera più grande di tenuta dotata di un pre-definito canale consentendo la perfusione di liquidi sopra la parte immobile. Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia di stampaggio permesso lo sviluppo di soluzioni su misura basate su silice polimeri⁹. La viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l'altezza del canale principalmente di determinare le caratteristiche di sollecitazione di taglio del flusso perfusione periferica¹⁰. In questo articolo, presentiamo un metodo in vitro per lo studio dei meccanismi sottostanti dell'aderenza, de-adesione e la trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. Il vantaggio dei metodi presentati qui è che può essere eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza lecamera comune e non richiedono un sperimentatori di possedere alta competenza tecnica. Il saggio in vitro può essere manipolato in vari modi (ad esempio, l'aggiunta di inibitori o bloccando gli anticorpi) e così è applicabile a diversi modelli di infiammazione vascolare e permette l'indagine su adesione le funzioni della proteina o la valutazione di specifici composti.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dai medici etici e animale etico tavole dell'Università di Maastricht.

1. flow-Based Assay con le cellule umane

1. Isolamento delle piastrine da sangue umano
   1. Prelievo di sangue venoso in anticoagulante citrato (3,2%).
   2. Aggiungere 15/1 volume di acido citrato destrosio (ACD: citrato trisodico 80 mM, 52 mM acido citrico e 183 mM glucosio) nel sangue.
   3. Centrifugare a 350 x g senza freno per 15 min ottenere plasma ricco di piastrine (PRP).
   4. Trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 mL e aggiungere volume 1/20 di ACD.
   5. Centrifugare a 1.110 g senza freno per 15 min ottenere plasma povero di piastrine (PPP).
   6. Scartare il surnatante. Tagliare l'estremità della punta della pipetta (P 1000), rendendolo grande alesaggio, che aiuta nella prevenzione dell'attivazione della piastrina e attentamente sospendere il pellet della piastrina nello stesso volume come PRP in tampone a pH della piastrina 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl₂, albumina di siero bovino 0,1% e 0,1% di glucosio). Aggiungere volume 1/20 del ACD e mescolare delicatamente.
   7. A pellet le piastrine a 1.110 g senza freno per 15 min.
   8. Scartare il surnatante e attentamente sospendere le piastrine come sopra in 1 mL di tampone di piastrine (pH 7.5).
   9. Misurare la concentrazione di piastrine in una diluizione di 1: 10 con un analizzatore automatizzato di ematologia.
   10. Regolare il volume con tampone della piastrina (pH 7.5) per ottenere un conteggio di 2 x 107/ml.
2. Isolamento di cellule polimorfonucleari da sangue umano (adattato da Brinkmann et al. ¹¹ )
   1. Disegnare 24 mL di sangue in eparina (10 U/mL) come anticoagulante.
   2. Aggiungere 6 mL di 1,077 g/mL liquido di densità polysucrose-sodium diatrizoate (Vedi Tabella materiali) a una provetta conica da 15 mL e attentamente livello 5-6 mL di sangue intero in cima.
   3. Centrifugare per 20 min 800 x g senza freno.
   4. Aspirare e scartare lo strato superiore giallastro limpida e trasferire la fase inferiore rossastra contenente granulociti in fresche provette coniche da 15 mL. Lavare le cellule con l'aggiunta di PBS contenente 2 mM EDTA ad un volume finale di 14 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 x g senza freno.
   5. Nel frattempo, preparare un mezzo del gradiente di densità (ad es., percoll, Vedi Tabella materiali) soluzione di lavoro mescolando 18 mL liquido gradienti di densità con 2 mL 10 x soluzione PBS. Diluire la soluzione di lavoro con PBS (1x) ottenere 4,25 mL ciascuna di 85%, 80%, 75%, 70% e 65% soluzioni di media pendenza.
   6. Preparare 2 provette coniche con il gradiente di densità di stratificazione 2 mL di ogni percentuale medio in cima a vicenda. Iniziare con la più alta concentrazione e continuare in ordine decrescente. Contrassegnare gli strati sul tubo con un pennarello resistente all'acqua.
   7. Strato attentamente 2 mL di sospensioni di cellule su ciascuno dei due gradienti preparati.
   8. Centrifugare per 20 min 800 x g senza freno in una centrifuga accuratamente equilibrata.
   9. Dopo la centrifugazione, rimuovere lo strato superiore e la maggior parte del 65% (primo anello) di strato con PBMCs e raccogliere in nuovi tubi il bianco restanti le interfasi fino al livello 85% (secondo anello, PMN).
   10. Lavare le cellule da riempire i tubi con PBS 2 mM EDTA e centrifugare per 10 minuti a 300 x g senza freno.
   11. Rimuovere il supernatante e sospendere le cellule sedimentate (≥ 95% sono in genere PMN) in 1 mL di tampone di Hank (pH 7,45), contenente 10 mM Hepes e 0,2% di albumina umana (tampone del saggio).
   12. Contare le celle utilizzando un emocitometro e sospendere le cellule a 1 x 106/ml.
   13. Continuare con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3).
3. Preparazione di aderente della piastrina e monostrati di cellule vascolari
   1. Preparazione del piatto cultura delle cellule (cellule coltivate)
      1. Pre-cappotto i piatti di cultura cellulare 35 mm con 1 mL diluito collagene coda di ratto (30 µ g/mL diluito in PBS filtrato sopra un filtro da 0,2 µm).
      2. Incubare a 37 ° C per 30 minuti, eliminare la soluzione di collagene e lavare il piatto una volta con PBS.
   2. Cultura delle cellule vascolari in piastre di coltura
      1. Staccare il primario (ad es., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) o cellule immortalizzate vascolare (ad es., EA. Hy926, SVEC) cresciuta alla confluenza in una boccetta di T75 con 1,5 mL soluzione di distacco delle cellule (per esempio, accutase). Aggiungere 4,5 mL di terreno di coltura appropriato per neutralizzare la soluzione di distacco delle cellule e determinare la concentrazione di cellule con una cella camera di conteggio. Sospendere le cellule a 0,5 x 10⁵ cellule/mL nel terreno di coltura appropriato (ad es., mezzo di sviluppo completo delle cellule endoteliali).
      2. Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare ad ogni piatto di 35 mm. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ fino alla confluenza (assunzione di 24 – 48 h, a seconda del tipo di cellula).
   3. Preparazione di vetro vetrino coprioggetti (aderente piastrine)
      1. Immergere il vetrino coprioggetti una volta in HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
      2. Sciacquare il vetrino coprioggetto 2 volte in acqua ultrapura.
      3. Asciugare il vetrino coprioggetto N.₂.
      4. Pre-cappotto il vetrino coprioggetti con 100 µ l, in conformità della posizione del canale della camera aspersione collagene coda di ratto diluito di tipo I (30 µ g/mL diluito in PBS filtrato sopra un filtro da 0,2 µm).
      5. Incubare per 30 min a RT, scartare la soluzione di collagene e lavare il vetrino coprioggetto 3 x con PBS.
      6. Bloccare il coprioggetto di collagene rivestito con 1% BSA in HEPES per 0,5 h a TA.
      7. Lavare e asciugare il vetrino coprioggetto e montarlo nella camera di aspersione. Isolare le piastrine da umano o sangue del topo come illustrato nel passaggio 1.1 o 2.1, rispettivamente.
   4. Immobilizzazione delle piastrine
      1. Aggiungere 70 µ l di una sospensione di piastrine/ml⁷2 x 10 per canale e incubare per 1,5 h a 37 ° C e 5% CO₂.
      2. Sostituire con attenzione le piastrine non aderente con soluzione bloccante (5% BSA in HEPES) per almeno 30 min a RT. Continue con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3).
   5. Stimolazione del monostrato cellulare vascolare
      1. Stimolare le cellule vascolari sostituendo i media freschi fluidi contenenti 10 ng/mL fattore di necrosi tumorale α (TNFα) per 4 h a 37 ° C e 5% CO₂.

2. flow-based test con cellule Murine

1. Isolamento delle piastrine da sangue del topo
   1. Disegnare sangue dalla puntura cardiaca utilizzando un ago 21 G (~ 1 mL) da anestetizzati (ketamina 80 mg/kg e medetomidina 0,3 mg/kg) 6 – 8 settimana-vecchi topi (C57Bl/6) in citrato (3,2%) come anticoagulante.
   2. Aggiungere volume 1/6 di ACD.
   3. Centrifuga a 220 x g, freno medio per 5 min ottenere plasma ricco di piastrine (PRP).
   4. Trasferire il surnatante (~ 600 µ l) più 1/3 dei globuli rossi ad un nuovo tubo
   5. Centrifugare a 95 x g senza freno per 6 min.
   6. Trasferire il surnatante (PRP) e misurare la concentrazione di piastrine in una diluizione di 1: 10 nel buffer di Tyrode (buffer di TH: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH₂PO₄* H₂O, 2 mM MgCl₂, albumina di siero bovino 0,1% e 0,1% glucosio) con un analizzatore automatizzato di ematologia.
   7. Lavare le piastrine aggiungendo volume 1/25 di ACD + 0,1 apyrase U/mL e centrifugare a 2.870 g, freno medio per 2 min.
   8. Scartare il surnatante e aggiungere 600 µ l di tampone di TH, 1/10 di volume di ACD e 0.1 apyrase U/mL. Tagliare la punta di dispensare (P 1000), rendendolo ampio foro, che aiuta nella prevenzione dell'attivazione della piastrina e delicatamente sospendere il pellet.
   9. Centrifugare a 2.870 g, freno medio per 2 min
   10. Scartare il surnatante e delicatamente sospendere le piastrine nel buffer di TH.
   11. Regolare il volume con buffer di TH per ottenere un conteggio di 2 x 107/ml.
2. Preparazione di monostrati aderente della piastrina
   1. Preparare il vetrino coprioggetti (aderente piastrine) secondo 1.3.3.
3. Immobilizzazione delle piastrine
   1. Aggiungere 100 µ l di una sospensione di piastrine/ml⁷2 x 10 per canale e incubare per 1,5 h a 37 ° C e 5% CO₂.
   2. Sostituire con attenzione le piastrine non aderente con soluzione bloccante (5% BSA in HEPES) per almeno 30 min a RT. Continue con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3)
4. Stimolazione di monostrato di piastrine del mouse
   1. Prima di aspersione dei leucociti (punto 3.3), stimolare le piastrine di aspersione della trombina (0,5 nM) nel buffer di HHHSA per 3 min a 37 ° C.

3. Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (PMN o THP-1 per umani e RAW 264.7 o monociti del Mouse primario per l'analisi di flusso-base murino)

1. Contrassegno fluorescente
   1. Etichettare i leucociti (1 x 10⁶/mL) con la macchia di acido nucleico cellulare-permeante fluorescente verde (1 µM). Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.
   2. Lavare le cellule con PBS per centrifugazione a 300 x g per 5 min e sospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 10⁶ cellule/mL (5 mL ogni condizione di test, a seconda della portata) nel tampone.
2. Preparazione di analisi di flusso camera
   1. Per l'adesione del leucocita su un monostrato di cellule, scartare il mezzo di coltura cellulare dal piatto e assemblarlo in camera di flusso. Collegare la siringa. Per l'adesione del leucocita sulle piastrine immobilizzate, collegare la micro diapositiva alla siringa. Pre-riscaldare a bagnomaria a 37 ° C.
   2. Prendere una siringa di aspersione (50 mL), installare siringa sul titolare di siringa, set ritirare la pompa su e modalità. Impostare il volume di pompa a 0 mL e impostare il diametro a 26,70 mm per la siringa da 50 mL.
   3. Collegare un connettore luer a gomito a un'estremità del tubo. Posizionare un accoppiatore di blocco luer della siringa e collegare il tubo con il connettore luer a gomito per l'accoppiatore di luer lock. Collegare l'estremità libera della tubazione alla camera di flusso.
3. Adesione e l'aspersione del leucocita
   1. Per l'adesione del leucocita su un monostrato di cellule, scartare il mezzo di coltura cellulare dal piatto e assemblarlo in camera di flusso. Collegare la siringa. Per l'adesione del leucocita sulle piastrine immobilizzate, collegare la micro diapositiva alla siringa.
   2. Per aspersione del leucocita e adesione sopra un vascolare- o monostrato di piastrine, posizionare il secondo tubo in una provetta conica 50 mL contenente tampone di dosaggio e riempimento della tubazione con pipetta da 1 mL, poi spremere il tubo e collegarlo a una camera di flusso.
   3. Prima dell'aspersione del leucocita, aggiungere 3 mM CaCl₂ e 2 mM MgCl₂ alla sospensione cellulare e incubare per 5 min a 37 ° C.
   4. Irrorare il tampone prima dell'aspersione delle cellule per rimuovere l'aria possibile dall'aula e tubazione.
   5. Chiudere le estremità del tubo stringendo loro stretto e passare tubi da tampone del saggio di sospensione cellulare, impedendo che le bolle d'aria intrappolata. Irrorare le cellule con flusso appropriato tasso/sollecitazione di taglio fino a quando arrivano le prime cellule.
   6. Irrorare le cellule con flusso appropriato tasso/shear stress per 2 min e catturare almeno 6 immagini tra 2 – 6 min di rotolamento e aderente cellule con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es., EVOS-FL) con 100 ingrandimenti collegato fotocamera digitale CCD o CMOS.
      Nota: Flusso tasso/sollecitazione di taglio dipende da dimensioni camera di flusso e viscosità di perfusato. Per aspersione camera utilizzata qui (Vedi Tabella materiali):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: sollecitazione di taglio (1 dine/cm²)
      Η: viscosità (0,015 dyn * s/cm²)
      Φ: portata (0,67 mL/min)
4. De-adesione del leucocita
   1. Per de-adhesion, passare la tubazione dalla sospensione cellulare a tampone schiacciando il tubo, impedendo la diventando intrappolate bolle d'aria.
   2. Staccare le cellule mediante perfusione con tampone del saggio con un'appropriato flusso tasso/sollecitazione di taglio (Vedi 3.3.7 Nota).
5. Trasmigrazione leucocitaria
   1. Per trasmigrazione leucocitaria, irrorare leucociti (passaggio 3) fino a una quantità adeguata di leucociti aderiscono (~ 50 cellule/vista campo).
   2. Sostituire sospensione del leucocita con tampone del saggio.
   3. Registrare le cellule trasmigra da lasso di tempo ogni 10 – 15 s per 30 – 60 min a 37 ° C.

Risultati

Per studiare l'adesione del leucocita endoteliale, cellule THP-1 fluorescente identificate sono state irrorate sopra un monostrato endoteliale TNFα o non stimolato per 2 min a 3 dyne/cm². Il numero totale delle cellule monocytic aderenti era risoluto dopo 2 min di aspersione catturando 6 campi indipendenti per un periodo di 2-6 min. Le celle aderenti sono state quantificate in almeno 6 immagini catturate con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es.

Discussione

Questo test in vitro è un semplice metodo per indagare i meccanismi di reclutamento leucocitario durante l'infiammazione vascolare, ma ci sono alcuni punti critici deve essere notato. Il primo requisito per eseguire correttamente questo dosaggio è la perfusione dei leucociti sopra un intatto e confluenti vascolari o monostrato di piastrine. Questo può essere ottenuto previo rivestimento delle superfici con collagene di tipo I. In generale, quando si lavora con cellule primarie vascolari, è importante staccar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood