Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Résumé

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Résumé

Le recrutement des leucocytes à la blessure ou inflammation aux sites de blessures ou de dommages aux tissus a été étudié au cours de ces dernières décennies et a abouti à la notion de la cascade d’adhérence de leucocyte. Toutefois, l’exactes mécanismes moléculaires impliqués dans le recrutement des leucocytes n'ont pas encore été pleinement identifiés. Étant donné que le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et immunitaire recherche (auto-), nous présentons un simple test à flux laminaire pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence, et transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’essai in vitro peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires dans différents modèles d’inflammation vasculaire. Ce protocole décrit une analyse axée sur les hottes à flux laminaire à l’aide d’une chambre à flux parallèle et un microscope à contraste de phase inversé relié à une caméra pour étudier les interactions des leucocytes et des cellules endothéliales ou les plaquettes, qui peuvent être visualisés et enregistrées puis analysés en mode hors connexion. Les cellules endothéliales, les plaquettes ou les leucocytes peuvent être prétraités avec inhibiteurs ou des anticorps afin de déterminer le rôle des molécules spécifiques au cours de ce processus. Conditions de cisaillement, contrainte de cisaillement c.-à-d. artériel ou veineux, peuvent être facilement adaptées par la viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal.

Introduction

Sur blessure, inflammation ou infection, leucocytes répondent rapidement à pathogène ou dommages associés à - molecular patterns (PAMPs, DAMPs), transformer un état activé et sortir de la circulation sanguine aux sites d’inflammation et tissus des dommages. La capacité des leucocytes d’interagir avec leur environnement cellulaire et moléculaire est essentielle pour leur bon fonctionnement comme des cellules immunitaires, mise en évidence par des maladies génétiques comme le déficit d’adhésion leucocytaire¹. Adhésion leucocytaire a fait l’objet d’une enquête intense durant les dernières décennies, et il en est résulté dans le concept de la cascade d’adhérence de leucocyte dans le début des années 1990^2,3. Adhésion leucocytaire est initiée par la capture de sélectine médiée par des leucocytes à l’endothélium, provoquant les cellules à rouler sur la surface vasculaire. Ce roulement permet de leucocytes d’analyse pour l’endothélium lié aux indices migrateurs, par exemple, chimiokines, qui induisent l’activation des intégrines. Par la suite, les intégrines activés médient la liaison aux ligands endothéliales, entrainant l’arrestation de leucocyte ferme. Leucocytes puissent se préparer par la suite à extravasate en rampant et la diffusion, avant de pénétrer la monocouche endothéliale et transmigrant dans le tissu sous-jacent. Le concept de base de la cascade de leucocyte canonique a est restée pratiquement inchangée depuis son introduction, avec quelques étapes intermédiaires supplémentaire⁴. Néanmoins, les mécanismes moléculaires exacts et les rôles des nombreux joueurs impliqués dans le recrutement des leucocytes n’ont pas été clarifiées jusqu'à présent, et le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et (auto-) système immunitaire recherche.

Par exemple, au cours des maladies inflammatoires vasculaires telles que l’athérosclérose, augmenté le recrutement des leucocytes dans le développement de plaque bateau mur lecteurs. Les plaques d’athérome instables pourraient se rompre, menant à l’activation massive des plaquettes et du système de coagulation et par la suite à l’occlusion du vaisseau⁵. Cela peut entraîner des complications cardiovasculaires graves tels que l’infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral. En outre, dénudation endothéliale telle qu’elle se produit sur le plan clinique, par exemple après la pose d’un stent d’une artère coronaire, mène à une multitude d’interactions des leucocytes et des plaquettes à l’intérieur de mur de navire exposés (p. ex., constituants de la matrice et lisse cellules musculaires) et des leucocytes avec plaquettes couvrant les lésions vasculaires. Ces interactions sont importantes pour le développement ultérieur de la maladie, car les interactions monocyte-plaquettes pourraient conduire néo-intimale formation^6,7. En outre, les interactions leucocyte-plaquettaire médiée par les leucocytes intégrine Mac-1 (_Mde α β (₂) et plaquettes GPIbα ont récemment été identifiées comme les nouveaux pilotes de thrombose chez les souris⁸.

Compte tenu de la grande disponibilité de sang humain et des animaux comme une source de leucocytes et de plaquettes pour la recherche et le large éventail des molécules de la matrice isolés et lignées cellulaires immortalisées de leucocytes et d’origine vasculaire, il est possible de simuler des leucocytes interactions dans un écoulement dans un laboratoire, en utilisant spécialement conçu chambres de perfusion de flux. De nombreuses variantes ont été conçus au cours des dernières décennies, allant d’une situation de vide aux chambres de perfusion auto-adhésives. Toutes les variantes ont en commun que la partie immobile (par exemple, des cellules vasculaires ou protéines de la matrice) est Assemblée dans une plus grande chambre étanche équipée d’un canal prédéfini permettant une perfusion de liquides sur la partie immobile. En outre, avances en technologie de moulage a permis le développement de solutions sur mesure basées sur silice polymères⁹. La viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal principalement déterminent les caractéristiques de contrainte de cisaillement des flux perfusion périphérique¹⁰. Dans cet article, nous présentons une méthode in vitro pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence et la transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’avantage des méthodes présentées ici est qu’elles peuvent être effectuées à l’aide d’un microscope à fluorescence caméra connectée commune et ne nécessitent pas un expérimentateur de posséder des compétences techniques élevées. L’essai in vitro peut être manipulée à bien des égards (par exemple, en ajoutant des inhibiteurs ou en bloquant les anticorps) et n’est donc applicable dans différents modèles d’inflammation vasculaire et permet l’enquête d’adhérence fonctions protéiques ou le évaluation de composés spécifiques.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’éthique médicale et Animal conseils éthiques d’Université de Maastricht.

1. flow-Based Test avec des cellules humaines

1. Isolement des plaquettes du sang humain
   1. Prélever du sang veineux en anticoagulant citrate (3,2 %).
   2. Ajouter 1/15 volume d’acide Citrate Dextrose (ACD : citrate trisodique 80 mM, 52 mM d’acide citrique et 183 mM de glucose) dans le sang.
   3. Centrifuger à 350 g sans frein pendant 15 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).
   4. Transférer le surnageant dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1/20 volume d’ACD.
   5. Centrifuger à 1 110 g sans frein pendant 15 min obtenir plasma pauvre en plaquettes (PPP).
   6. Jeter le surnageant. Couper l’extrémité de l’embout de la pipette (1000 P), rendant grand alésage, quelles aides dans la prévention de l’activation plaquettaire et suspendre soigneusement le culot plaquettaire dans le même volume que la PRP en plaquettes tampon pH 6,6 (PB : 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % de glucose). Ajouter 1/20 volume de ACD et mélanger doucement.
   7. Pellet les plaquettes à 1 110 g sans frein pendant 15 min.
   8. Jeter le surnageant et suspendre soigneusement les plaquettes comme ci-dessus dans 1 mL de tampon de plaquettes (pH 7.5).
   9. Mesurer la concentration de plaquettes dans une dilution au 1/10 avec un analyseur de hématologie automatisé.
   10. Réglez le volume avec un tampon plaquettaire (pH 7.5) pour atteindre un nombre de 2 x 107/ml.
2. Isolement des cellules polynucléaires du sang humain (adapté de Brinkmann et al. ¹¹ )
   1. Dessiner 24 mL de sang dans l’héparine (10 U/mL) comme anticoagulant.
   2. Ajouter 6 mL de milieu de diatrizoate polysucrose-sodium 1,077 g/mL densité (voir Table des matières) à un tube conique de 15 mL et soigneusement la couche 5-6 mL sang sur le dessus.
   3. Centrifuger pendant 20 min à 800 x g sans frein.
   4. Aspirer et jetez la couche supérieure clair jaunâtre et transférer la phase inférieure de rougeâtre contenant des granulocytes dans frais tubes coniques 15 mL. Laver les cellules en ajoutant PBS contenant 2 mM EDTA pour un volume final de 14 mL et centrifugation pendant 10 min à 300 x g sans frein.
   5. Pendant ce temps, préparer un milieu de gradient de densité (p. ex.percoll, voir Table des matières) solution de travail en mélangeant 18 mL de milieu gradient de densité avec 2 mL 10 x solution stock de PBS. Diluer cette solution diluée avec du PBS (1 x) pour obtenir 4,25 mL chacune des solutions moyennes dégradées 85 %, 80 %, 75 %, 70 % et 65 %.
   6. Préparer 2 tubes coniques avec le gradient de densité en superposant 2 mL de chaque pourcentage moyen sur le dessus de l’autre. Commencez par la plus forte concentration et continuer dans l’ordre décroissant. Marquer les couches sur le tube avec un marqueur imperméable à l’eau.
   7. Soigneusement la couche 2 mL des suspensions cellulaires sur chacune des deux gradients préparés.
   8. Centrifuger pendant 20 min à 800 x g sans frein dans une centrifugeuse soigneusement équilibrée.
   9. Après centrifugation, enlever la couche supérieure et la plupart des 65 % (premier anneau) de couche avec PBMC et recueillir dans des tubes neufs le blanc restant interphases jusqu'à la couche de 85 % (second anneau, PMN).
   10. Laver les cellules en remplissant les tubes avec PBS 2 mM EDTA et centrifugation pendant 10 min à 300 x g sans frein.
   11. Retirez le surnageant et suspendre les cellules sédimentées (typiquement ≥ 95 % sont des PMN) dans 1 mL de tampon de Hank (pH 7,45), contenant 10 mM Hepes et 0,2 % de l’albumine humaine (tampon).
   12. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et suspendre des cellules à 1 x 106/ml.
   13. Continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3).
3. Préparation des plaquettes adhérentes - et les monocouches de cellules vasculaires
   1. Préparation de plat de culture cellulaire (cellules cultivées)
      1. Pré paration les récipients de culture de cellule 35 mm avec 1 mL de collagène de queue de rat diluée (30 µg/mL dilué dans du PBS filtré sur un filtre de 0,2 µm).
      2. Incuber 30 min à 37 ° C, jeter la solution de collagène et laver le plat une fois avec du PBS.
   2. Culture de cellules vasculaires en Pétri
      1. Détacher les primaires (p. ex., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) ou immortalisé les cellules vasculaires (p. ex., EA. Hy926, SVEC) cultivées au confluent dans une fiole de T75 avec 1,5 mL de solution de détachement cellulaire (par exemple, accutase). Ajouter 4,5 mL de milieu de culture approprié pour neutraliser la solution de détachement cellulaire et déterminer la concentration en cellules avec une cellule comptant chambre. Suspendre les cellules à 0,5 x 10⁵ cellules/mL dans le milieu approprié (par exemple, milieu de culture de cellules endothéliales complet).
      2. Ajouter 2 mL de suspension cellulaire à chaque plat de 35 mm. Culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ à humidifié jusqu’au confluent (en 24 à 48 h, selon le type de cellule).
   3. Préparation de lamelle de verre (plaquettes adhérentes)
      1. Immerger la lamelle de verre une fois dans HCl-EtOH (1,2 M / 50 % v/v).
      2. Rincer la lamelle 2 fois dans l’eau ultrapure.
      3. Sécher la lamelle sous N₂.
      4. Pré-couche la lamelle de verre avec 100 µL, conformément à la position du canal de la chambre de perfusion de collagène de queue de rat diluée de type I (30 µg/mL dilué dans du PBS filtré sur un filtre de 0,2 µm).
      5. Incuber 30 min à ta, jeter la solution de collagène et laver la lamelle 3 x avec du PBS.
      6. Bloquer la lamelle de collagène enduit avec 1 % de BSA dans HEPES pendant 0,5 h à température ambiante.
      7. Laver et sécher la lamelle et monter dans la chambre de perfusion. Isoler les plaquettes d’être humain ou du sang de souris comme indiqué à l’étape 1.1 ou 2.1, respectivement.
   4. Immobilisation des plaquettes
      1. Ajouter 70 µL d’une suspension de plaquettes 2 x 107/ml par canal et incuber pendant 1,5 h à 37 ° C et 5 % de CO₂.
      2. Soigneusement remplacer les plaquettes non adhérents avec solution de saturation (5 % de BSA dans HEPES) pendant au moins 30 min à RT. continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3).
   5. Stimulation de la monocouche cellulaire vasculaire
      1. Stimuler les cellules vasculaires en remplaçant les médias avec les supports neufs contenant 10 ng/mL facteur de nécrose tumorale α (TNFα) pendant 4 h à 37 ° C et 5 % de CO₂.

2. flow-based test avec cellules murines

1. Isolement des plaquettes du sang de souris
   1. Tirage de sang par ponction cardiaque à l’aide d’une aiguille de 21 G (environ 1 mL) d’anesthésiés (kétamine 80 mg/kg et la médétomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 semaines-vieilles souris (C57Bl/6) dans le citrate (3,2 %) comme anticoagulant.
   2. Ajouter du volume 1/6 de l’ACD.
   3. Centrifuger à 220 x g, freinage moyen pendant 5 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).
   4. Transférer le surnageant (~ 600 µL) plus 1/3 des globules rouges dans un nouveau tube
   5. Centrifuger à 95 g sans frein pendant 6 min.
   6. Transférer le surnageant (PRP) et mesurer la concentration de plaquettes dans une dilution au 1/10 dans un tampon de Tyrode (tampon TH : 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH₂PO₄* H₂O, 2 mM MgCl₂, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % le glucose) avec un analyseur de hématologie automatisé.
   7. Lavez les plaquettes en augmentant le volume de 1/25 d’ACD + 0.1 apyrase U/mL et centrifuger à 2 870 g, freinage moyen pendant 2 min.
   8. Jeter le surnageant et ajouter 600 µL de tampon de TH, volume 1/10 de l’ACD et 0,1 apyrase U/mL. Couper l’embout de la pipette (1000 P), rendant grand alésage, qui contribue à la prévention de l’activation plaquettaire et Suspendez doucement le culot.
   9. Centrifuger à 2 870 g, freinage moyen pendant 2 min
   10. Jeter le surnageant et Suspendez doucement les plaquettes dans un tampon de TH.
   11. Régler le volume avec le tampon de TH pour atteindre un nombre de 2 x 107/ml.
2. Préparation des monocouches de plaquettes adhérentes
   1. Préparer la lamelle de verre (plaquettes adhérentes) selon les 1.3.3.
3. Immobilisation des plaquettes
   1. Ajouter 100 µL d’une suspension de plaquettes 2 x 107/ml par canal et incuber pendant 1,5 h à 37 ° C et 5 % de CO₂.
   2. Soigneusement remplacer les plaquettes non adhérents avec solution de saturation (5 % de BSA dans HEPES) pendant au moins 30 min à RT. continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3)
4. Stimulation de la monocouche de plaquettes de souris
   1. Avant la perfusion des leucocytes (étape 3.3), stimuler les plaquettes par perfusion de thrombine (0,5 nM) dans un tampon HHHSA pendant 3 min à 37 ° C.

3. marquage fluorescent et la Perfusion des leucocytes (PMN ou THP-1 pour homme et RAW264.7 ou les Monocytes de souris primaire pour Murine Flow-Based Test)

1. Marquage fluorescent
   1. Étiqueter les leucocytes (1 x 106/ml) avec la tache de la cellule-perméants vert fluorescent d’acide nucléique (1 µM). Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
   2. Laver les cellules avec du PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et suspendre les cellules à une concentration de 0,5 x 10⁶ cellules/mL (5 mL / condition de test, selon la vitesse d’écoulement) dans du tampon d’essai.
2. Flux de préparation de dosage chambre
   1. Pour adhésion leucocytaire sur une monocouche de cellules, jetez le milieu de culture cellulaire du plat et le monter dans la chambre de flux. Raccordez le tuyau sur la seringue. Pour adhésion leucocytaire sur plaquettes immobilisées, connecter le micro slide à la seringue. Préchauffer un bain-marie à 37 ° C.
   2. Prenez une seringue de perfusion (50 mL), installation de seringue sur le support de la seringue et ensemble, retirer la pompe sur mode. Régler le débit de la pompe à 0 mL, puis affectez-lui le diamètre 26,70 mm pour la seringue de 50 mL.
   3. Brancher un connecteur luer de coudé à une extrémité de la tubulure. Placez un coupleur de verrouillage luer de la seringue et raccordez le tuyau avec le connecteur luer de coude au raccord luer lock. Branchez l’extrémité du tube gratuit à la chambre de flux.
3. Adhérence et la perfusion de leucocytes
   1. Pour adhésion leucocytaire sur une monocouche de cellules, jetez le milieu de culture cellulaire du plat et le monter dans la chambre de flux. Raccordez le tuyau sur la seringue. Pour adhésion leucocytaire sur plaquettes immobilisées, connecter le micro slide à la seringue.
   2. Pour la perfusion de leucocytes et l’adhérence sur un vasculaire- ou monocouche plaquettaire, déposer le deuxième tube dans un tube conique de 50 mL contenant du tampon et remplissage de tubes avec pipette de 1 mL, puis squeeze la tubulure et connectez-le à une chambre à flux.
   3. Avant la perfusion de leucocyte, ajouter 3 mM CaCl₂ et 2 mM MgCl₂ à la suspension cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
   4. Perfuse du tampon d’essai avant la perfusion de cellules pour chasser l’air possible de la chambre et le tube.
   5. Fermer les extrémités de tube en serrant leur serré et passer le tuyau du tampon au suspension cellulaire, empêchant l’enfermement de bulles d’air. Perfuse cellules avec contrainte de taux/cisaillement débit adéquat jusqu'à ce qu’arrivent les premières cellules.
   6. Perfuse cellules avec débit adéquat taux/cisaillement pendant 2 min et capturer au moins 6 photos entre 2 à 6 min de roulement et adhérentes des cellules avec un microscope à contraste/fluorescence phase inverse (par exemple, EVOS-FL) grossissement de 100 connectés pour une caméra CCD ou CMOS.
      NOTE : Taux/cisaillement de flux dépend de dimensions de chambre de flux et de la viscosité du perfusat. Chambre de perfusion utilisé ici (voir la Table des matières) :
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ : contrainte de cisaillement (1 dyn/cm²)
      Η : viscosité (0,015 dyn * s/cm²)
      Φ: débit (0,67 mL/min)
4. Dé-adhésion leucocytaire
   1. Pour de-adhesion, passent le tuyau du suspension cellulaire au tampon en pressant sur le tube, empêchant les bulles d’air de devenir pris au piège.
   2. Détacher les cellules par perfusion avec du tampon avec un débit adéquat taux/cisaillement (cf. 3.3.7 Note).
5. Transmigration des leucocytes
   1. Pour la transmigration des leucocytes, perfuse leucocytes (étape 3) jusqu'à ce qu’une quantité suffisante de leucocytes adhèrent (~ 50-champ de cellules/affichage).
   2. Remplacer suspension leucocytes avec du tampon d’essai.
   3. Enregistrer les cellules transmigrer en time-lapse toutes les 10 à 15 s pendant 30 à 60 min à 37 ° C.

Résultats

Pour étudier l’adhésion endothéliale-leucocytaire, fluorescent étiquetés cellules THP-1 ont été perfusés pendant une monocouche endothéliale TNFα - ou non-stimulés pendant 2 min à 3 dyne/cm². Le nombre total de cellules adhérentes de monocytaire a été déterminé après 2 min de perfusion en capturant 6 champs indépendants sur une période de 2 à 6 min. Les cellules adhérentes ont été quantifiés dans au moins 6 photos prises avec un microscope à contrast...

Discussion

Ce dosage in vitro est une méthode simple pour étudier les mécanismes sous-jacents de recrutement des leucocytes au cours de l’inflammation vasculaire, mais il y a certains points critiques à noter. La première condition pour réaliser avec succès ce test est la perfusion des leucocytes sur un intact et anastomosé vasculaires ou monocouche plaquettaire. Ceci peut être réalisé en enduisant préalable des surfaces avec du collagène de type I. En général, lorsque vous travaillez avec des cellules vas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood