以层流为基础的检测培养血管细胞和粘附血小板白细胞的研究

摘要

在血管壁损伤或炎症期间, 白细胞与血管细胞和血小板相互作用。在这里, 我们描述了一种简单的基于层流的检测方法来表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。

摘要

近几十年来, 在伤害或组织损伤部位对白细胞的招募进行了调查, 并导致了白细胞黏附性级联的概念。然而, 尚未充分确定参与白细胞招募的确切分子机制。由于白细胞的招募仍然是感染, 炎症, 和 (自动) 免疫研究领域的一个重要课题, 我们提出了一个简单的层流基础的分析研究的基础机制的黏附力, 脱粘, 并在静脉和动脉血流机制下的白细胞轮回。体外分析可用于研究在不同的血管炎症模型中, 白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。该协议描述了一种基于层流的检测方法, 使用平行流腔和倒置相衬显微镜连接到一个相机, 研究白细胞和内皮细胞或血小板的相互作用, 然后再进行可视化和记录。离线分析。内皮细胞、血小板或白细胞可以用抑制剂或抗体进行预处理, 以确定特定分子在这个过程中的作用。剪切条件,即动脉或静脉剪切应力, 可以很容易地适应的粘度和流速的灌注液和高度的渠道。

引言

在受伤, 炎症, 或感染, 白细胞迅速反应病原体-或损害相关的分子模式 (PAMPs, 抑), 转变成一个活化状态, 并从血液流到炎症和组织损伤部位。白细胞与细胞和分子环境相互作用的能力, 对于它们作为免疫细胞的正确功能是必不可少的, 如白细胞黏附缺陷¹所突出的基因紊乱。白细胞黏附一直是在过去几十年的激烈调查的主题, 这导致了白细胞粘附级联在二十世纪九十年代代初^2,3的概念。白细胞黏附是由选择素介导的白细胞捕获到内皮细胞引发的, 从而导致了血管表面的滚动。这种滚动使白细胞扫描血管内皮细胞的迁移线索,例如, 趋化因子, 诱导激活的整合。随后, 活化整合介导与内皮配体的结合, 导致坚固白细胞的拘捕。白细胞随后会通过爬行和传播来准备 extravasate, 然后穿透内皮细胞单层和 transmigrating 进入底层组织。标准白细胞级联的基本概念自引入以来基本上保持不变, 有些中间步骤添加了⁴。然而, 目前还没有阐明参与白细胞招募的许多参与者的确切分子机制和作用, 而白细胞的招募仍然是感染、炎症和 (自动) 免疫领域的一个重要课题。研究。

例如, 在血管炎症性疾病, 如动脉粥样硬化, 增加白细胞招募到血管壁驱动斑块发展。不稳定的动脉粥样硬化斑块可能会破裂, 导致血小板和凝血系统的大规模活化, 随后阻断血管⁵。这可能导致严重的心血管后果, 如心肌梗死或中风。此外, 在临床上发生内皮剥脱,例如冠状动脉支架术后, 导致大量的白细胞和血小板相互作用于暴露的血管壁内部 (例如, 基质成分和平滑肌细胞) 和与血小板覆盖血管损伤的白细胞。这些相互作用是重要的进一步发展的疾病, 因为单核细胞-血小板相互作用可能驱动新生内膜^形成6, 7.此外, 白细胞整合素 Mac-1 (α_Mβ₂) 和血小板 GPIbα介导的血小板-白细胞相互作用最近被确定为小鼠⁸中血栓形成的新驱动因素。

鉴于人类和动物血液作为研究的白细胞和血小板来源的广泛存在, 以及分离基质分子和白细胞和血管起源的永生化细胞系的广泛存在, 模拟白细胞是可行的。在实验室环境中, 使用特别设计的流灌注室进行相互作用。在过去的几十年中, 许多变种已经被设计出来, 从真空驱动到自粘式灌注室不等。所有变体都有共同之处, 即不动部分 (例如, 培养的血管细胞或基质蛋白) 被组装成一个更大的防漏室, 装有预先定义的通道, 使液体在静止的部分上灌注。此外, 成型技术的进步使得基于硅树脂的定制解决方案的开发成为了⁹。流化液的粘度和流速以及通道的高度, 主要决定了流量灌注装置的剪切应力特性¹⁰。在本文中, 我们提出了一个体外方法来研究在静脉和动脉流机制下白细胞黏附、脱粘和轮回的机制。这里提出的方法的优点是, 它们可以使用普通的摄像机连接荧光显微镜进行, 并且不需要实验者拥有高的技术熟练程度。体外分析可以通过多种方式进行操作 (例如, 添加抑制剂或阻断抗体), 因而适用于不同的血管炎症模型, 并允许对黏附蛋白功能的研究或对特定化合物的评价。

研究方案

这里描述的所有方法都得到了马斯特里赫特大学医学伦理和动物伦理委员会的批准。

1. 以人体细胞为基础的流动检测方法

1. 人血液中血小板的分离
   1. 在枸橼酸 (3.2%) 抗凝血中提取静脉血液。
   2. 添加1/15 酸柠檬酸葡萄糖 (80 毫米柠檬酸三钠, 52 毫米柠檬酸和183毫米葡萄糖) 的血液。
   3. 离心机在 350 x g 无刹车15分钟获得富含血小板的血浆 (PRP)。
   4. 将上清液转移到15毫升锥形管上, 加入1/20 体积的加性。
   5. 离心机在1110克无刹车15分钟, 获得血小板不良血浆 (PPP)。
   6. 放弃上清。切断末端的吸管提示 (P 1000), 使其宽孔, 这有助于预防血小板活化, 并小心地暂停血小板颗粒在同一体积的 PRP 血小板缓冲 pH 值 6.6 (PB: 136 毫米氯化钠, 10 毫米 Hepes, 2.7 毫米氯化钾, 2 毫米氯化镁₂, 0.1% 牛血清白蛋白和0.1% 葡萄糖)。添加1/20 卷的加和轻轻混合。
   7. 在1110克无刹车的情况下将血小板颗粒15分钟。
   8. 在1毫升血小板缓冲液中去掉上清, 并小心地将血小板悬浮在上面 (pH 值 7.5)。
   9. 用自动血液分析仪测定1/10 稀释液中的血小板浓度。
   10. 用血小板缓冲 (pH 值为 7.5) 调整音量以达到 2 x 10⁷/毫升的计数。
2. 从人血液中分离中性粒细胞 (从 Brinkmann等) 中提取。¹¹ )
   1. 在肝素 (10 U/毫升) 中抽出24毫升血液作为抗凝血剂。
   2. 添加6毫升的1.077 克/毫升密度聚蔗糖钠葡介质 (见材料表) 到15毫升圆锥管, 并小心地5-6 毫升全血在上面。
   3. 离心机为20分钟, 在 800 x g 无刹车。
   4. 吸入并丢弃透明黄顶层, 将含有粒细胞的下红色相转移到新鲜的15毫升锥形管中。通过将含有2毫米 EDTA 的 PBS 添加到最终体积为14毫升, 并在 300 x g 处无刹车的离心机中冲洗细胞。
   5. 同时, 准备一个密度梯度介质 (例如, percoll, 见材料表) 工作解决方案, 混合18毫升密度梯度介质与2毫升 10x PBS 股票解决方案。用 PBS (1x) 稀释这个工作解决方案, 以获得85%、80%、75%、70% 和65% 梯度介质溶液的4.25 毫升。
   6. 用密度梯度制备2锥形管, 将每一个中等百分比的2毫升分层排列在彼此之上。以最高浓度开始, 并继续递减顺序。用防水标记标记管上的层。
   7. 小心层2毫升的细胞悬浮在两个准备梯度。
   8. 离心机20分钟在 800 x g 不刹车在一个仔细地平衡离心机。
   9. 离心后, 去除顶层和65% 层 (第一环) 与 PBMCs, 并收集到新的管白色剩余的 interphases, 直到85% 层 (第二环, 中性粒)。
   10. 用 PBS 2 毫米 EDTA 填充管, 并在 300 x g 处无刹车的离心机进行10分钟冲洗。
   11. 取出上清, 并暂停沉淀细胞 (通常≥95% 是中性粒蛋白) 在1毫升的汉克的缓冲 (pH 7.45), 含有10毫米 Hepes 和0.2% 人白蛋白 (化验缓冲区)。
   12. 使用 hemocytometer 计数单元格, 并在 1 x 10⁶/mL 处挂起单元格。
   13. 继续荧光标记和白细胞灌注 (步骤 3.3)。
3. 粘附血小板和血管细胞膜的制备
   1. 细胞培养皿制备 (培养细胞)
      1. 预涂35毫米细胞培养皿与1毫升稀释的鼠尾胶原蛋白 (30 µg/毫升稀释在 PBS 过滤超过0.2 µm 过滤器)。
      2. 孵育30分钟在37摄氏度, 放弃胶原蛋白溶液, 并洗一次与 PBS 的菜肴。
   2. 培养皿中血管细胞的培养
      1. 分离主 (例如、HUVEC、HAoEC、HAoSMC) 或永生化血管细胞 (例如, EA。Hy926, SVEC) 生长在一个 T75 瓶与1.5 毫升细胞脱离解决方案 (例如, accutase) 汇合。添加4.5 毫升适当的生长培养基, 以中和细胞脱离溶液, 并确定细胞浓度与细胞计数室。在适当的生长培养基中悬浮 0.5 x 10⁵细胞/mL 细胞 (例如, 完全内皮细胞生长培养基)。
      2. 添加2毫升的细胞悬浮到每35毫米菜。在37°c 的湿润孵化器中培养细胞, 5% CO₂直到汇合 (根据细胞类型 24–48 h)。
   3. 玻璃盖玻片制备 (粘附血小板)
      1. 将玻璃盖玻片浸入盐酸-乙醇 (1.2 米/50% v/v)。
      2. 用超纯水冲洗盖玻片2次。
      3. 在 N₂下干燥盖玻片。
      4. 预涂玻璃盖玻片与100µL, 根据稀释大鼠尾胶原的灌注室通道的位置 (30 µg/毫升稀释在 PBS 过滤0.2 µm 过滤器)。
      5. 孵育30分钟在 RT, 放弃胶原蛋白溶液, 并清洗盖玻片3x 与 PBS。
      6. 阻断胶原蛋白涂层盖玻片与 1% BSA 在 HEPES 0.5 小时的 RT。
      7. 把盖玻片洗乾净, 把它装入灌注室。分别在步骤1.1 或2.1 中概述了从人或鼠血液中分离出的血小板。
   4. 血小板固定化
      1. 添加70µL 2 x 10⁷/毫升血小板悬浮每通道, 并孵育 1.5 h 在37°c 和 5% CO₂。
      2. 用阻断溶液 (HEPES 中的 5% BSA) 仔细替换非黏附血小板, 在 RT 中至少30分钟. 继续荧光标记和白细胞灌注 (步骤 3.3)。
   5. 血管细胞单层刺激
      1. 用含有 10 ng/毫升肿瘤坏死因子α (TNFα) 的新鲜培养基在37摄氏度和 5% CO₂上替换培养基, 以刺激血管细胞。

2. 以小鼠细胞为基础的流动检测方法

1. 小鼠血液中血小板的分离
   1. 使用21克针 (约1毫升) 从麻醉 (氯胺酮80毫克/千克和 medetomidine 0.3 毫克/千克) 6–8周老鼠 (3.2%) 作为抗凝剂, 用心脏穿刺抽血。
   2. 添加1/6 卷的加总。
   3. 离心机在 220 x g, 中制动5分钟, 获得富含血小板的血浆 (PRP)。
   4. 将上清 (~ 600 µL) 加1/3 红细胞移植到新管上
   5. 离心机在 95 x g 无刹车6分钟。
   6. 转移上清 (PRP) 和测量血小板浓度在1/10 稀释 Tyrode 的缓冲 (TH 缓冲: 136 毫米氯化钠、5毫米 Hepes、2.7 毫米氯化钾、0.42 毫米 NaH₂PO₄* H₂O、2毫米氯化镁₂、0.1% 牛血清白蛋白和0.1%葡萄糖) 与全自动血液分析仪。
   7. 通过增加1/25 容积的加 0.1 U/毫升 apyrase, 和离心机在2870克, 中制动器2分钟, 洗涤血小板。
   8. 丢弃上清, 并添加600µL 的缓冲液, 1/10 卷的加成, 0.1 U/毫升 apyrase。切断吸管尖 (P 1000), 使其宽孔, 这有助于防止血小板活化, 并轻轻地暂停颗粒。
   9. 离心机在2870克, 中制动器为2分钟
   10. 去掉上清, 轻轻地将血小板悬浮在缓冲液中。
   11. 使用 TH 缓冲区调整卷以实现 2 x 10⁷/mL 的计数。
2. 粘附血小板单分子膜的制备
   1. 按1.3.3 制备玻璃盖玻片 (粘附血小板)。
3. 血小板固定化
   1. 添加100µL 2 x 10⁷/毫升血小板悬浮每通道, 并孵育 1.5 h 在37°c 和 5% CO₂。
   2. 用阻断溶液 (HEPES 中的 5% BSA) 仔细替换非黏附血小板, 在 RT 中至少30分钟. 继续荧光标记和白细胞灌注 (步骤 3.3)
4. 小鼠血小板单层的刺激作用
   1. 在白细胞灌注前 (步骤 3.3), 在37摄氏度的 HHHSA 缓冲液中灌注凝血酶 (0.5 nM), 刺激血小板。

3. 荧光标记和灌注白细胞 (人和 RAW264.7 或小鼠单核细胞的中性粒或 THP-1, 用于小鼠流动检测)

1. 荧光标记
   1. 标记白细胞 (1 x 10⁶/毫升) 与细胞 permeant 绿色荧光核酸染色 (1 µM)。在37摄氏度孵化细胞30分钟。
   2. 用 PBS 以 300 x g 为5分钟的离心清洗细胞, 并将细胞悬浮到浓度为 0.5 x 10 的⁶细胞/mL (每个测试条件下的5毫升, 取决于流速) 在化验缓冲器中。
2. 流动室化验准备
   1. 对于细胞单层上的白细胞黏附, 从盘子中丢弃细胞培养基, 并将其组装到流动室中。将油管连接到注射器上。对于固定化血小板的白细胞黏附, 将微滑块与注射器连接。预热水浴到37°c。
   2. 取一个灌注注射器 (50 毫升), 在注射器支架上安装注射器, 并在退出模式下设置泵。将泵容积设置为0毫升, 并将直径设置为26.70 毫米, 用于50毫升注射器。
   3. 将弯头鲁尔连接器连接到油管的一端。将鲁尔锁耦合器放到注射器上, 并将油管与弯头鲁尔接头连接至鲁尔锁接头。将自由油管端连接到流室。
3. 白细胞灌注和黏附力
   1. 对于细胞单层上的白细胞黏附, 从盘子中丢弃细胞培养基, 并将其组装到流动室中。将油管连接到注射器上。对于固定化血小板的白细胞黏附, 将微滑块与注射器连接。
   2. 对于白细胞灌注和粘附在血管-或血小板单层, 将第二管插入一个50毫升圆锥管, 其中包含检测缓冲器和填充油管与1毫升吸管, 然后挤压油管和连接到一个流动室。
   3. 在白细胞灌注之前, 添加3毫米 CaCl₂和2毫米氯化镁₂到细胞悬浮和孵育5分钟在37°c。
   4. 灌注在细胞灌注前检测缓冲液, 以去除腔室和导管中可能的空气。
   5. 关闭管结束时, 挤压他们紧, 并切换油管从化验缓冲区到细胞悬浮, 防止气泡被困。灌注细胞具有适当的流速/剪切应力, 直到第一个细胞到达。
   6. 灌注细胞与适当的流速/剪切应力为2分钟, 并捕获至少6在滚动和贴壁细胞之间的2–6分钟与倒置相对比/荧光显微镜 (例如, EVOS-佛罗里达州) 使用100X 放大连接数字 CCD 或 CMOS 相机。
      注: 流速/剪切应力取决于灌流液的流动室尺寸和粘度。用于此处使用的灌注腔 (请参阅材料表):
      τ =η* 97.1 *Φ
      τ: 剪切应力 (1 dyn/厘米²)
      η: 粘度 (0.015 dyn/厘米²)
      Φ: 流速 (0.67 毫升/分)
4. 白细胞脱粘
   1. 对于脱粘, 从细胞悬浮液中切换油管, 通过挤压油管来检测缓冲液, 防止气泡被困住。
   2. 用适当的流速/剪切应力 (见3.3.7 注), 用检测缓冲器分离细胞。
5. 白细胞轮回
   1. 对于白细胞轮回, 灌注白细胞 (步骤 3), 直到足够数量的白细胞坚持 (~ 50 细胞/查看领域)。
   2. 用化验缓冲器代替白细胞悬浮液。
   3. 记录 transmigrating 细胞的时间间隔每 10–15 s 为30–60分钟在37摄氏度。

结果

为研究内皮-白细胞黏附, 荧光标记 THP-1 细胞在3达因/cm²的 TNFα或非刺激的内皮层中灌注2分钟。通过在2-6 分钟内捕获6个独立的字段, 在2分钟的灌注后确定黏附单核细胞细胞总数。在至少6张用倒置相对比/荧光显微镜 (例如, EVOS) 拍摄的图片中, 用10X 放大器连接到数字 CCD 或 CMOS 相机, 并将平均值表示为粘附细胞/mm²。TNFα内皮细胞刺激后, THP-1 的骤停与静...

讨论

此体外检测是一种直接的方法, 用于研究血管炎症过程中白细胞招募的基本机制, 但还有一些关键的问题需要注意。成功执行这项检测的第一项要求是在完整的、汇合的血管或血小板单层上灌注白细胞。这可以通过预先涂覆胶原 i 型的表面来实现。一般来说, 在使用主血管细胞的时候, 用推荐的含胶原酶的分离溶液轻轻地拆下细胞是很重要的 (请参阅材料表), 这种方法不那么严格,...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood