Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Özet

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Özet

Lökosit yaralanma veya iltihap sitelerine yaralanma veya doku hasarı üzerine alımı son yıllarda incelenmiş ve lökosit yapışma cascade kavramında sonuçlandı. Ancak, lökosit işe dahil tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak tespit edilmiştir değil. Lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık araştırma alanında önemli bir konu kalır bu yana, biz temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için basit bir laminar akış tabanlı tahlil mevcut ve hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin. Vitro tahlil lökosit ve damar iltihabı farklı modellerde hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, lökosit ve endotel hücreleri veya görüntülenir ve sonra kaydedilen trombosit etkileşimleri çalışmaya paralel akış odası ve bir ters faz kontrast mikroskobu bir kameraya bağlı kullanarak bir laminar akış tabanlı tahlil açıklar çevrimdışı analiz. Endotel hücreleri, trombosit veya lökosit inhibitörleri veya bu işlem sırasında belirli molekülleri rolünü belirlemek için antikorlar ile pretreated. Kesme koşulları, Yani atardamar veya toplardamar kesme stres, kolayca viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği tarafından adapte edilebilir.

Giriş

Yaralanma, iltihap veya enfeksiyon lökosit hızlı patojen veya hasar-ilişkili için moleküler desen (PAMPs, DAMPs), aktif bir duruma değiştirmek ve inflamasyon ve doku hasarı sitelere kan akışı dışarı hareket yanıt. Onların hücresel ve moleküler çevre ile etkileşim olanağı lökositlerin lökosit yapışma eksikliği¹gibi genetik bozukluklar tarafından vurgulanmış olarak bağışıklık hücreleri olarak onların doğru işlevi için esastır. Lökosit yapışma son on yıl boyunca yoğun soruşturma konusu olmuştur ve bu erken 1990'larda^2,3lökosit yapışma cascade kavramı sonuçlandı. Lökosit yapışma lökositlerin endotel vasküler yüzey üzerinde rulo için hücreleri neden selektin-aracılı yakalama tarafından başlatılır. Bu inişli çıkışlı lökositlerin endotel bağımlı göçmen cues, örneğin, integrinler aktivasyonu teşvik kemokinler için taramak sağlar. Daha sonra aktif integrinler firma lökosit durması sonucu bağlama endotel ligandlar için aracılık. Lökosit daha sonra tarama ve endotel monolayer delici ve temel dokusuna transmigrating önce yayarak extravasate hazırlayabilirsiniz. Kurallı lökosit cascade temel kavramı sunulmasından bu yana büyük ölçüde değişmeden kalmıştır, bazı ara adımlar ile⁴ekledi. Yine de, tam moleküler mekanizmaları ve lökosit işe dahil birçok oyuncu rollerini şu ana kadar açıklık olmuştur değil ve lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık alanında önemli bir konu kalır araştırma.

Örneğin, ateroskleroz gibi vasküler inflamatuar hastalıklar sırasında gemi duvar sürücüler plak gelişme içine lökosit işe arttı. Kararsız aterosklerotik plaklar rüptürü, trombosit ve koagülasyon sisteminin büyük harekete geçirmek ve daha sonra⁵damar tıkanıklığı. Bu kalp krizi veya felç gibi ciddi kardiyovasküler sonuçlara yol açabilir. Buna ek olarak, klinik olarak, olarak endotel denudation oluşur örneğin bir koroner arter uygulaması sonra yol açar lökosit ve trombosit maruz damar duvar iç (örneğin, matris bileşenleri ve pürüzsüz etkileşimler çok sayıda kas hücreleri) ve vasküler yaralanma kapsayan trombosit ile lökositlerin. Bu etkileşimler monosit-trombosit etkileşimleri neointima oluşumu^6,7sürücü olarak daha da geliştirilmesi hastalık için önemlidir. Buna ek olarak, trombosit-lökosit etkileşimleri lökosit integrin Mac-1 (α_Mβ₂) aracılı ve trombosit GPIbα trombozu fareler⁸roman sürücüleri olarak son zamanlarda belirlenmiştir.

İnsan ve hayvan kan geniş durumu lökosit ve trombosit bir kaynak olarak araştırma ve izole matris molekülleri geniş yelpazede ve lökosit ve vasküler kökenli ölümsüzleştirdi hücre hatları için göz önüne alındığında, lökosit benzetimini yapmak için uygun etkileşimler bir laboratuvar ayarı, özel olarak tasarlanmış akışı perfüzyon Chambers'ı kullanarak akış altında. Adl değişik vakum odaklı kendinden yapışkanlı perfüzyon odalarına kadar geçen on yıl boyunca tasarlanmıştır. Tüm türevleri ortak yönü hareketsiz bölümü (örneğin, kültürlü damar hücreleri veya matris proteinler) önceden tanımlanmış bir kanal perfüzyon sıvıların hareketsiz bölümü üzerinde etkinleştirme ile donatılmış büyük bir sızıntı geçirmez odasına monte var. Buna ek olarak, teknoloji kalıp gelişmeler silis polimerler⁹tarihinde alan ısmarlama çözümler geliştirme etkin. Viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği esas olarak akış perfüzyon aygıt¹⁰makaslama stres özelliklerini belirlemek. Bu makalede, biz bir temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için vitro yöntemi ve Hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin mevcut. Burada sunulan yöntemleri onlar ortak kamera bağlı floresan mikroskop kullanılarak yapılır ve yüksek teknik yeterlilik Uluslararas› bir Denemecileri gerektirmeyen avantajdır. Vitro tahlil (inhibitörleri ekleyerek veya antikor engellemeörneğin,), birçok yönden manipüle edilebilir ve böylece damar iltihabı farklı modellerinde geçerli ve yapışma incelenmesi protein işlevleri sağlar veya belirli bileşikler değerlendirilmesi.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada tıbbi etik ve Maastricht University of hayvan etik kurulları tarafından onaylanmıştır.

1. akış tabanlı tahlil insan hücreleri ile

1. İnsan kanı düşük trombosit yalıtım
   1. Venöz kan sitrat (% 3,2) antikoagülan çizin.
   2. Asit sitrat dekstroz hacmi 1/15 ekleyin (ACD: 80 mM TRISODYUM sitrat, 52 mM sitrik asit ve 183 mM glikoz) kan.
   3. 350 x g fren trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.
   4. 15 mL konik tüp süpernatant nakletmek ve eklemek ACD hacmi 1/20.
   5. 1110 g fren trombosit zavallı plazma (PPP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.
   6. Süpernatant atmak. Damlalıklı ipucu (P 1000) sonunda kesti, yapım o geniş, hangi AIDS önleme trombosit aktivasyon delik ve dikkatle trombosit tampon pH 6,6 PRP olarak aynı birimindeki trombosit Pelet askıya (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl₂, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz). ACD hacmi 1/20 ekleyin ve karışımı yavaşça.
   7. Trombosit 1110 g fren 15dk için olmadan, cips.
   8. Süpernatant atın ve dikkatli olarak trombosit yukarıda 1 mL trombosit arabellek (pH 7.5) askıya alma.
   9. Bir otomatik Hematoloji analyzer ile 1/10 seyreltme trombosit konsantrasyon ölçmek.
   10. 2 x 10⁷/mL sayısını elde etmek için trombosit arabelleği (pH 7.5) ile ses düzeyini ayarlayın.
2. Yalıtım polimorfonükleer hücre insan kanı (uyarlama Brinkmann vd. ¹¹ )
   1. Kan 24 mL heparin (10 U/mL) antikoagülan olarak çizin.
   2. 1.077 g/mL yoğunluk polysucrose sodyum diatrizoate orta 6 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL konik tüp ve dikkatle üst katmanı 5-6 mL tam kan.
   3. Santrifüj fren olmadan 800 x g de 20 dk için.
   4. Aspire edin ve açık sarımsı üst tabaka atmak ve granülosit taze 15 mL konik tüpler içine içeren alt kırmızımsı faz transfer. Hücreleri son hacmi 14 mL ve santrifüj fren olmadan 300 x g de 10 dakika için 2 mM EDTA içeren PBS ekleyerek yıkayın.
   5. Bu arada, bir yoğunluk gradient orta hazırlamak (örneğin, percoll, bkz: Malzemeler tablo) PBS hisse senedi çözüm x 2 mL 10 ile 18 mL yoğunluk gradient orta karıştırma tarafından çalışma çözüm. Bu çalışma çözüm PBS ile seyreltik (1 x 4.25 mL her biri % 85, % 80'i, % 75, % 70 ve % 65 degrade orta çözümler elde etmek için).
   6. 2 konik tüpler yoğunluğu gradyan ile üst üste orta her yüzde 2 mL katman tarafından hazırlayın. En yüksek konsantrasyon ile başlarlar ve azalan düzende. Tüp katmanları bir su geçirmez marker ile işaretleyin.
   7. Dikkatli bir şekilde her iki hazır degradeler hücre süspansiyonlar 2 mL katman.
   8. Santrifüj vasıl 800 x g dikkatli bir şekilde dengeli bir santrifüj fren olmadan 20 dk için.
   9. Üst katmanı ve % 65 çoğunu Santrifüjü sonra Kaldır katman (ilk halka) ile PBMCs ve interphases % 85 katman kadar kalan beyaz yeni tüpler içine toplamak (ikinci halka, PMN).
   10. Hücreleri PBS 2 mM EDTA ile tüplerin ve santrifüj fren olmadan 300 x g, 10 dk kadar doldurarak yıkayın.
   11. Hank'in arabelleği (pH 7,45), içeren 10 mM Hepes ve % 0,2 insan albumini (tahlil arabellek) 1 mL posalı hücrelerde (genellikle ≥95% olan PMN) askıya alma ve süpernatant çıkarın.
   12. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1 x 10⁶/mL hücreleri askıya alma.
   13. Floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile devam.
3. Yapisan trombosit - ve vasküler hücre-monolayers hazırlanması
   1. Hücre kültür yemek hazırlama (kültürlü hücreleri)
      1. 35 mm hücre kültür yemekleri 1 mL sulandırılmış sıçan kuyruk kollajen (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL) ile önceden kat.
      2. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atın ve bir kez PBS ile çanak yıkama.
   2. Kültür vasküler hücre kültür yemekleri
      1. İlköğretim (örneğin, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) veya (örneğin, EA. ölümsüzleştirdi damar hücreleri ayırma Hy926, SVEC) izdiham içinde bir T75 şişesi 1.5 mL hücre dekolmanı çözümü (örneğin, accutase) ile büyüdü. Hücre dekolmanı çözüm nötralize ve odası sayma bir hücreyle hücre konsantrasyonu belirlemek için uygun büyüme orta 4.5 mL ekleyin. Senaryo Özeti 10⁵ hücre/mL uygun büyüme orta (örneğin, tam endotel hücre büyüme orta) x 0.5 askıya alma.
      2. Hücre süspansiyon 2 mL her 35 mm çanak ekleyin. Oksijen kuluçka %5 CO₂ 37 ° C'de hücreler (hücre türüne bağlı olarak 24-48 h alarak) izdiham kadar kültür.
   3. Cam coverslip hazırlık (yapışık trombosit)
      1. Bir kez içinde HCl-alkol cam coverslip bırakın (1, 2 M / % 50 v/v).
      2. Coverslip 2 kez ultrasaf su içinde yıkayın.
      3. Coverslip altında N₂kuru.
      4. Öncesi kat cam coverslip ile seyreltilmiş sıçan kuyruk kollajen perfüzyon TMMOB kanal konumunu uygun olarak 100 µL tip ı (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL).
      5. RT, 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atmak ve coverslip 3 yıkama x PBS ile.
      6. Blok kolajen kaplı coverslip HEPES RT. 0,5 h için % 1 BSA ile
      7. Yıkama ve coverslip kuru ve perfüzyon odasına monte edin. Trombosit insan üzerinden veya adım 1.1 ya da 2.1, sırasıyla belirtildiği gibi fare kan ayırma.
   4. Trombosit immobilizasyon
      1. Kanal başına 2 x 10⁷/mL trombosit süspansiyon, 70 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO₂1,5 saat için kuluçkaya.
      2. Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile değiştirin.
   5. Vasküler hücre monolayer uyarılması
      1. Vasküler hücre 10 ng/mL tümör nekrozis faktör α (TNFα) içeren taze medya ile medya değiştirerek CO₂37 ° C ve %5 4 h için teşvik etmek.

2. akış tabanlı tahlil fare hücreleri ile

1. Trombosit fare kandan yalıtım
   1. Kardiyak delik üzerinden 21 G iğne (~ 1 mL) kullanarak çizmek kan anestezi (ketamin 80 mg/kg ve medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 hafta-yaşlı fareler (C57Bl/6) sitrat (% 3,2) antikoagülan olarak.
   2. ACD hacmi 1/6 ekleyin.
   3. 220 x g, santrifüj, trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 5 min için orta fren.
   4. Süpernatant (~ 600 µL) 1/3 kırmızı kan hücrelerinin yeni bir tüp transferi
   5. 95 x g 6 min için fren olmadan, santrifüj kapasitesi.
   6. Süpernatant (PRP) aktarmak ve trombosit konsantrasyon Tyrode'nın tampon 1/10 seyreltme ölçmek (TH arabellek: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH₂PO₄* H₂O, 2 mM MgCl₂, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz) bir otomatik Hematoloji analyzer ile.
   7. Trombosit ACD + 0.1 U/mL apyrase 1/25 hacmi ekleyerek yıkama ve 2,870 g, 2 min için orta fren de santrifüj kapasitesi.
   8. Süpernatant atın ve 600 µL TH arabellek, ACD hacmi 1/10 ve 0.1 U/mL apyrase ekleyin. Damlalıklı ipucu (P 1000) off kesmek, yapım o geniş, trombosit aktivasyon önlenmesinde yardımcı olur ve yavaşça Pelet askıya taşıyordu.
   9. Santrifüj 2,870 g de, 2 min için orta fren
   10. Süpernatant atın ve yavaşça trombosit TH arabellekte askıya alma.
   11. 2 x 10⁷/mL sayısını elde etmek için TH arabelleği ile ses düzeyini ayarlayın.
2. Yapisan trombosit monolayers hazırlanması
   1. Cam coverslip (yapışık trombosit) 1.3.3 göre hazırlayın.
3. Trombosit immobilizasyon
   1. Kanal başına 2 x 10⁷/mL trombosit süspansiyon, 100 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO₂1,5 saat için kuluçkaya.
   2. Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile eski yerine koymak ile
4. Fare trombosit monolayer uyarılması
   1. Önce perfüzyon lökositlerin (Adım 3,3), trombosit Trombin perfüzyon tarafından teşvik (0.5 nM) HHHSA arabelleği için 37 ° C'de 3 dk.

3. floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (PMN veya THP-1 insan ve RAW264.7 için veya birincil fare monosit fare akış tabanlı tahlil için)

1. Floresan etiketleme
   1. Lökosit (1 x 10⁶/mL) hücre permeant yeşil flüoresan nükleik asit leke (1 µM) ile etiketleyin. 37 ° C'de 30 dk için hücreleri kuluçkaya
   2. PBS ile hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 5 min için de yıkama ve 0.5 x 10⁶ hücre/mL (5 mL test durumuna bağlı olarak akış hızı başına) tahlil arabellekte bir konsantrasyon hücrelere askıya alma.
2. Akış odası tahlil hazırlık
   1. Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın. Önceden bir su banyosu ile 37 ° c sıcak
   2. Bir perfüzyon şırınga (50 mL), yükleme şırınga tenkıye tutucusu ve pompa çekilme kümesi modu almak. Pompa birimi için 0 mL ve 50 mL şırınga için 26.70 mm çapı ayarlayın.
   3. Tüp tek bir amaç için bir dirsek radarı konektörüne takın. Radarı kilit bağlantı için belgili tanımlık tenkıye yerleştirin ve tüp radarı kilit coupler dirsek radarı konektörüne bağlayın. Ücretsiz tüp ucunu akışı odasına bağlayın.
3. Lökosit perfüzyon ve yapışma
   1. Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın.
   2. Lökosit perfüzyon ve üzerinde bir vasküler adezyon için-ya da trombosit monolayer, ikinci tüp tahlil tampon ve 1 mL damlalıklı ile boru dolgu içeren bir 50 mL konik tüp içine yerleştirin sonra tüp sıkmak ve akış odasına bağlayın.
   3. Lökosit perfüzyon önce 3 mM CaCl₂ ve 2 mM MgCl₂ hücre süspansiyon ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
   4. Tahlil arabellek perfüzyon olası hava odası ve kablo kanalları kaldırmak için hücre önce sıvı.
   5. Onları sıkı sıkarak tüp biter kapatın ve hücre süspansiyon, tuzağa üzerinden hava kabarcıkları önlenmesi için tahlil arabellek üzerinden tüp geçiş. İlk hücreleri gelene kadar uygun akış hızı/makaslama stres içeren hücreler sıvı.
   6. Uygun akış hızı/makaslama stres 2 min için hücrelerle sıvı ve 2-6 dk bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ile çalışırken ve yapışık hücrelerinin arasında en az 6 resim yakalama 100 X büyütme kullanarak bağlı bir CCD veya CMOS kamera için.
      Not: Akış odası boyutları ve perfusate viskozite akış hızı/makaslama stres bağlıdır. Burada kullanılan perfüzyon odası için (bkz. Tablo malzeme):
      Τη= * 97.1*Φ
      Τ: yamultma stres (1 dyn/cm²)
      Η: viskozite (0,015 dyn * s/cm²)
      Φ: akış hızı (0.67 mL/dk)
4. Lökosit de-yapışma
   1. De-adhesion için tahlil arabelleğine hücre süspansiyon gelen tüp hava kabarcıkları sıkışmış olma engelleyen Borulama, sıkarak geçin.
   2. Hücreleri tarafından perfüzyon ile tahlil arabellek uygun akış hızı/makaslama stres (bkz: 3.3.7 Not) ile bağlantısını kesin.
5. Lökosit hicret
   1. Lökosit hicret için lökosit (Adım 3) sıvı yeterli bir miktar lökositlerin uygun kadar (~ 50 hücreler/görünüm alanı).
   2. Lökosit süspansiyon tahlil arabellek ile değiştirin.
   3. Transmigrating hücreleri zaman atlamalı tarafından her 10-15 s 37 ° C'de 30-60 dk kayıt

Sonuçlar

Endotel lökosit yapışma çalışmaya fluorescently etiketli THP-1 hücreleri üzerinde 3 din/cm²2 min için TNFα - veya sigara-uyarılmış endotel monolayer periosteum. Yapisan Monositik hücre toplam sayısı perfüzyon 2 dk sonra 6 bağımsız alan 2-6 dk bir süre içinde yakalama tarafından tespit edilmiştir. Yapışık hücreleri en az 6 resimleri bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ele quantified bağlantılı CCD veya CMOS kame...

Tartışmalar

Bu vitro tahlil vasküler enflamasyon sırasında lökosit alımı temel mekanizmaları araştırmak için basit bir yöntemdir, ancak dikkat edilmesi gereken bazı kritik nokta. Bu tahlil başarıyla gerçekleştirmek için ilk perfüzyon lökosit bir sağlam ve Konfluent vasküler veya trombosit monolayer gereksinimdir. Bu önceden kaplama kollajen türü olan yüzeylerin tarafından ben elde edilebilir. Genel olarak, birincil damar hücreleri ile çalışırken, yavaşça önerilen collagenase içeren dekolma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood