JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكول تحليل خلية إلى نقل المعلومات متذبذبة بالتحكم أوبتوجينيتيك والعيش الرصد للتعبير الجيني. هذا النهج يوفر منبرا فريداً لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.

Abstract

ينبغي أن تستجيب الخلايا بشكل صحيح للبيئات، التي تتأثر بعوامل مختلفة من المحيطة بالخلايا المتغيرة وقتيا. الشق مما يشير إلى المسار هو واحد من هذه الآلية الجزيئية الأساسية للاتصالات خلية إلى خلية، والذي يلعب دوراً رئيسيا في التطور الطبيعي للأجنة. هذا المسار ينطوي نقل خلية إلى خلية المعلومات متذبذبة مع إيقاعات أولتراديان، ولكنه على الرغم من التقدم المحرز في تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وقد تم تحديا لتوضيح أثر التفاعلات متعددة الخلايا في الجينات متذبذبة ديناميات. نقدم هنا، على بروتوكول يسمح بالتحكم أوبتوجينيتيك ويعيش رصد أنماط التعبير الجيني بطريقة زمنية محددة. وكشف هذا الأسلوب بنجاح أن مدخلات دورية داخل الخلايا وبين الخلايا مما يشير إلى درجة انترين ذبذبات الجوهرية بمرحلة تحول في القرار خلية واحدة وضبط التردد. وهذا النهج ينطبق على تحليل السمات الدينامية لمختلف مسارات الإشارات، توفير منصة فريدة لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.

Introduction

خلية إلى خلية الاتصالات تلعب أدواراً حاسمة في الزخرفة الجنينية في العمليات الإنمائية. في أجنة الفقاريات، تتشكل هياكل ميتاميريك يسمى سميتس على طول المحور الأمامي الخلفي الجسم مع دقة زمنية دقيقة تحت مراقبة على مدار الساعة حفظ الوقت، يسمى تجزئة عقارب الساعة1. أثناء هذه العملية، يتم تحويل مجموعة من الخلايا بريسوميتيك mesoderm (PSM) دورياً إلى سميتس على نحو متزامن. تنطوي هذه العملية على التعبير الجيني متذبذبة متزامنة والخلايا PSM أن يتذبذب في مرحلة تشكل سميتس نفسه. وفترة التعبير الجيني متذبذبة حوالي 2 إلى 3 ح في الفئران وحوالي 30 دقيقة في الزرد. عند فصله، تفقد الخلايا PSM التزامن2،3، ولكن عندما تكون إعادة تجميعها، يمكن تنظيم ذاتي واسترداد السكان تتسق4، مما يوحي بأن اقتران خلية خلية مفتاح متزامنة ذبذبات.

كشفت الجهود المكثفة أن إشارات الجزيئات في مسار دلتا-الدرجة متصلة محكم بذبذبات متزامنة من الجينات على مدار الساعة تجزئة. أما مثبطات الدوائية أو طفرات وراثية من الدرجة الأولى مما يشير إلى لﻻستخدام سكان التذبذب. في الزرد، عرض طفرات من الدرجة الأولى مما يشير إلى عناصر، مثل ديلتاك وديلتاد و Notch1a، ذبذبات غير متزامن5،6. في الأجنة الفرخ أو الماوس، يجند الشق دلتا-like1 (Dll1) ليس فقط، بل أيضا هامش "حز المغير مجنونة" (لفنج) مطلوب لذبذبات متزامنة7،،من89. ومع ذلك، كان من الصعب لاختبار القدرة الوظيفية لهذه الجزيئات لنقل المعلومات الحيوية من خلية إلى أخرى، نظراً لأن قرارات مؤقتة من اضطراب التقليدية لديناميات تنظيم الجينات لم تكن كافية للتحقيق العمليات لفترات زمنية من 2-3 ح (إيقاعات أولتراديان).

قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب متكامل لمراقبة ورصد أنماط التعبير الجيني في خلايا الثدييات10. هذه التكنولوجيا تمكن الاستقراء البقول التعبير الجيني بالإضاءة الخفيفة دورية على جداول زمنية أولتراديان. ويمثل هذا البروتوكول الأساليب إنشاء خطوط الخلايا حساس ومراقبة ردود دينامية للخلايا مراسل التﻷلؤ خلية يعيش الرصد في السياقات من خلية إلى خلية الاتصالات. هذا الأسلوب المنطبق على تحليل العديد من مسارات الإشارات الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-جيل خطوط الخلايا مستقرة بنظام Tol2

  1. ترانسفيكت بلازميد ناقلات (الشكل 1A) من الوحدات النمطية المستندة إلى Tol2 أوبتوجينيتيك إلى جانب ناقلات التعبير ترانسبوساسي (Tol2) (بكاجس-mT2TP) إلى الخلايا C2C12. في كل الخطوات، خلايا الثقافة مع دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين-ستربتوميسين في 37 درجة مئوية (الجدول 1)، حضور 5% CO2، الإشارة إلى خلاف ذلك.
    1. عد الخلايا تريبسينيزيد مع خلية-عداد، ولوحة 5 × 104 C2C12 الخلايا الواحدة وكذلك في لوحة 12-جيدا قبل تعداء بيوم واحد.
    2. شارك ترانسفيكت ميكروغرام 0.375 ناقلات المستندة إلى Tol2 أوبتوجينيتيك (pAI177 أو pAI218) وميكروغرام 0.125 ناقل التحديد المخدرات (pAI170) و 0.5 ميكروغرام من ناقلات بكاجس-mT2TP باستخدام كاشف ليبوفيكشن.
    3. تريبسينيزي transfected الخلايا، ولوحة لهم في أطباق الثقافة 100 ملم يوم واحد بعد تعداء.
    4. تبادل الثقافة المتوسطة للخلايا ترانسفيكتيد للثقافة المتوسطة وتستكمل مع هيجروميسين 100 ملغ/مل.
    5. خلايا الثقافة لمدة 3 أيام للقضاء على الخلايا ترانسفيكتيد الأمم المتحدة. لاحظ أنه ليس من الضروري تغيير المتوسطة.
  2. تريبسينيزي transfected الخلايا، وتطهير عدد خلايا معربا عن البروتينات الفلورية للتحديد. لاستقبال الخلايا تحمل pAI177، تعيين بوابة الفرز إلى قناة الأخضر-PE لتنقية سكان الخلية مشري-إيجابية. للخلايا الحساسة صور المرسل تحمل pAI218، تعيين بوابة الفرز إلى قناة الجيش الشعبي الكونغولي لتنقية سكان الخلية iRFP713 إيجابية.
  3. (اختياري) وضع سكان خلية الاستنساخ بالأساليب القياسية، مثل تخفيف محدود أو خلية واحدة بالفرز حسب الأصول.

2-تقييم صور حساسية الخلايا المهندسة على مستوى السكان

ملاحظة: هذا الجزء يصف وضع بروتوكول للتحقق التعريفي دينامية Dll1 يجند البروتينات عند إضاءة الضوء الأزرق بفحوصات الكيمياء الحيوية، مثل قبكر والنشاف الغربية.

  1. قم بإعداد نوعين من الحاضنات مع أو بدون مصادر الضوء لشرط المستحثة بالضوء أو شرط الظلام، على التوالي. إنشاء ضوء كثافة الأزرق تقودها ترانس-إضاءة، كما هو مبين في الشكل 1 باء، باستخدام ضوء متر. توقيت البرنامج ومدة الإضاءة الخفيفة قبل تحميل عنصر تحكم نصي واحد-المجلس الصغير-تحكم تسمح الجداول القابلة للبرمجة للإضاءة (الشكل 1).
  2. عد الخلايا تريبسينيزيد مع خلية-عداد، ولوحة 1.0 × 105 المرسل المراعية لصور الخلايا تحمل pAI218 و pAI170 على أطباق الثقافة البلاستيك قطرها 35 ملم (الأطباق أكثر من 12 حالة خفيفة وطبق 1 لحالة الظلام) وتعيين الأطباق فصل حاضنات للظلام/الضوء الخافت. بعد إعداد أطباق، إبقاء أبواب حاضنات مغلقة حتى جمع ليساتيس الخلية.
  3. أيام ونصف بعد الطلاء، تبدأ الإضاءة الخفيفة (الخلايا ومن المتوقع أن يكون أكثر من 80% المتلاقية). لا تعرض الخلايا الضوء لتجنب التحفيز صور غير مرغوب فيها.
    ملاحظة: الجداول الزمنية للإضاءة يعتمد على غرض التجارب. علما أن شرط إضاءة مستمرة (مثلاً. 1-مين فترات مدة و 10 دقيقة مع 40 µmol/م2/ق الضوء-كثافة) هو كافية لفحص بسيط صور التعريفي، وأن الإضاءة الخفيفة قوي الضارة بالخلايا. وبالتالي، تأكد من تحديد المعلمات غير مؤذية للإضاءة.
  4. حوالي 2 أيام بعد الطلاء، تعد الخلية-مع فواصل 30 دقيقة. نقل تذوق أطباق من الحاضنات إلى على الجليد، والبدء في إعداد ليساتيس الخلية لمزيد من التحليل.

3-الدينامية المرسل والمتلقي في التحليل على مستوى السكان: في الوقت الحقيقي رصد الاستجابات الخلوية على التحفيز البصري ب PMT

  1. تريبسينيزي وعد الأرقام المرسل والمتلقي الخلايا مع الأساليب القياسية. إعداد 1 مل إجمالي حجم الاختلاط تعليق 2.5 × 104 المتلقي و 1.25 × 105 المرسل الخلايا (نسبة 1:5).
    ملاحظة: 2:1، 1:1، أو 1:2 المرسل والمتلقي نسب أيضا العمل مع عدد خلايا إجمالي 1.5 × 105. 10
  2. لوحة مختلطة خلايا في كل بئر من اللوحات السوداء 24-جيدا مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على لوسيفرين 1 مم.
  3. تحليل الخلايا على قارئ لوحة للانزيم لوسيفراس، والتأكد من أن إشارات الإخراج ليست عالية جداً لنظام التسجيل.
    ملاحظة: إذا كانت الإشارات الناتج أعلى من 1 × 106 فوتون التهم/s، أنهم قد المشبعة. وفي هذه الحالة، خفض تركيز لوسيفرين إلى القيم المثلى حيث تكون إشارات الإخراج أقل من 1 × 106 فوتون التهم/s.
  4. تعيين اللوحة في نظام التسجيل، وبدء برنامج تسجيل (الشكل 1). على سبيل المثال، بدء تشغيل الإضاءة الخفيفة في ح 18 بعد إعداد التسجيل.
    ملاحظة: التصفية الزمنية، مثل إشارات ديتريندينج مع تحريك في المتوسط و Savitzky-غولي التصفية، مفيدة لتصور أشكال موجه وذروة المكتشفة.

4. الفحص دينامية المرسل والمتلقي على مستوى خلية واحدة: في الوقت الحقيقي التصوير من الردود خلية واحدة تحت سيطرة اضطراب أوبتوجينيتيك

  1. لوحة 0.5 × 105 المتلقي و 2.5 × 105 المرسل الخلايا على أطباق قطرها 27 ملم-قطر-الزجاج-قاعدة 35 ملم. التأكد من أن نسب خلط وعدد مجموع خلايا (كثافة خلية) يتم تعديلها بشكل صحيح.
  2. يوم واحد بعد الطلاء، تبادل متوسطة مع 2 مل من تسجيل المتوسط (الفينول الحمراء المتوسطة دميم الحرة وتستكمل مع 5% FBS، البنسلين والستربتوميسين ولوسيفرين 1 ملم)، وتعيين طبق قاعدة الزجاج في المجهر. إذا لزم الأمر، تغسل حطام خلايا الميتة مع برنامج تلفزيوني (-).
    ملاحظة: من الأفضل للقيام بهذه الخطوة في حالة الظلام.
  3. قم بإعداد مجهر مقلوب مجهزة دائرة بيئية في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
  4. إعداد كاميرا CCD تبريد. التأكد من أن درجة الحرارة من اتفاقية مكافحة التصحر الاستشعار يتم تبريده إلى القيمة الوجهة (عادة،-90 درجة مئوية).
  5. تعيين معلمات لنافذة "Timelapse متعدد الأبعاد" في مجال البرمجيات الحصول تلقائياً التقاط الصور مع فترات مدة 5 دقائق وأكثر من 288 مرات (تسجيل بين عشية وضحاها أكثر من واحد).
    1. فتح إطار "Timelapse متعدد الأبعاد" وحدد قناة التﻷلؤ ووضع قراءة 50 كيلوهرتز بطيئة من القائمة المنسدلة وتعيين binning 4 × 4 مع التعرض 4-دقيقة. تأكد من تعيين وضع القراءة إلى وضع 50 كيلوهرتز بطيئة، هو أمر حيوي للحد من الضوضاء القراءة للكشف عن الضوء طرحه التي ينبعث منها قدر ضعيف.
    2. فتح إطار "Timelapse متعدد الأبعاد" وحدد قنوات الأسفار ووضع قراءة 1 ميغاهرتز بسرعة من القائمة المنسدلة وتعيين binning 2 × 2 مع التعرض 400 مللي ثانية. تأكد من تعيين وضع القراءة بطريقة سريعة 1 ميغاهرتز لتقليل الوقت المطلوب للتصوير بالأسفار.
    3. بدء الوقت الفاصل بين التسجيل بواسطة النقر فوق الزر "الحصول".
  6. استخراج آثار خلية واحدة من القنوات التﻷلؤ من الوقت الفاصل بين الأفلام ببرنامج تحليل الصور، كما يلي. أولاً، جعل الصور المكدس التﻷلؤ والأسفار عن طريق استيراد بيانات الصورة إلى برمجيات تحليل الصور. بالنسبة للصور التﻷلؤ، إزالة بكسل الساخنة المستمدة من الأشعة الكونية بمقارنة كثافة بكسل الصور وقتيا المتاخمة، واستبدال قيم بكسل المتوسط الزمني للإطارات السابقة والتالية (تنفذ كتصفية "سبيكينويسي")، تطبيق هذه الصور المجهزة لعامل تصفية تجانس مكانياً، وطرح قيم بكسل خلفية وجهات النظر أووتفيلد من كل إطار. ثم تحديد "منطقة الاهتمام" (ROI) لكل خلية في صورة فلورسنت عند كل نقطة الوقت، تطبيق عائد الاستثمار على الصور الإنارة، وقياس شدة الإنارة لكل عائد الاستثمار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

علينا تكييف ليتون النظام11،12، الذي يتيح التعبير الجيني الناجمة عن الصور في خلايا الثدييات، لدراسة التذبذب الوراثية مع تواتر ح 2 إلى 3. ويتألف هذا النظام من جزئين: هجافبو صور إيندوسيبلي المنشط النسخي وكاسيت UAS-مروج لمحرك أقراص النسخ من جينات ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لقد أظهرنا أسلوب لمراقبة ديناميات التعبير الجيني مع دورية ح 2 إلى 3. هذا الجدول الزمني أقصر بكثير من تلك الموجودة في النظم التقليدية الأخرى، بما في ذلك تيت في النظام ونظام ليتون الأصلي. المحددات الأساسية للوصول إلى المقاييس الزمنية أولتراديان إنصاف المستحثة بصور المنتجات الجزيئية ومرناس ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها JST، المعزوفة (بالنيابة)، والبحوث الأساسية افولوشونال العلوم والتكنولوجيا (JPMJCR12W2 ())، معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (وزارة التربية والتعليم والثقافة، والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان 26119708 (بالنيابة) و 16 ح 06480 ())، والعلمية البحث (أ) (جمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) 24240049 ())، والعلماء الشباب (A) (JSPS ح 15 05326 (بالنيابة))، ومعونات للبحث العلمي في مجالات مبتكرة "الأسفار لايف "يأمرون، واليابان، ومنهاج للتصوير" النهج الديناميكي "" النظام الذين يعيشون "من يأمرون، اليابان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
CameraAndoriKon M-934
MicroscopeOlympusIX-81 ZDC
PMT deviceChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Blue LED illuminatorOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicillin-streptomycinNacalai26253-84
Fetal bovine serumSigma172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )Hi-tech303012
D-Luciferin Potassium SaltNacalai20028-24
Light meterLI-COR BiosciencesLI-250A
anti-HA-Peroxidase antibodyRocheclone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibodyWakoclone 2F3

References

  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
  3. Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
  4. Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
  5. Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
  6. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
  7. Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
  8. Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141(2012).
  9. Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
  10. Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
  11. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
  12. Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  14. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3(2010).
  15. Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  16. Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved