JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для анализа к ячейке передачи колебательного информации по optogenetic управления и жить мониторинга экспрессии генов. Этот подход обеспечивает уникальную платформу для тестирования функциональное значение динамического ген выражение программ в многоклеточных систем.

Аннотация

Клетки должны должным образом реагировать на височно меняющихся средах, которые находятся под влиянием различных факторов от окружающих клеток. Паз, сигнальный путь является одной из таких важнейших молекулярных механизмов для коммуникаций в ячейке, которая играет ключевую роль в нормальное развитие зародышей. Этот путь включает в себя к ячейке передачи колебательного информации с Ультрадианных ритмов, но несмотря на прогресс в методы молекулярной биологии, она была сложной для выяснения влияния многоклеточных взаимодействия колебательных гена динамика. Здесь мы представляем протокол, который позволяет optogenetic контроль и живой мониторинг картин выражения гена в височной точно. Этот метод успешно показал, что межклеточной и внутриклеточной периодические входы сигнализации Notch увлекают внутренние колебания перестройкой частоты и фазы, переход на одну ячейку резолюции. Этот подход применим к анализ динамических особенностей различных сигнальных путей, предоставляя уникальную платформу для тестирования функциональное значение динамического ген выражение программ в многоклеточных систем.

Введение

К ячейке коммуникации играют решающую роль в эмбриональных патронирования в процессы развития. В позвоночных эмбрионы выпол структуры, называемые сегменты формируются вдоль оси передней задней тела с прецизионной точностью височной под контролем времени поддержанию часы, под названием сегментации будильник1. В ходе этого процесса группы клеток presomitic мезодермы (PSM) периодически преобразуются в сегменты в синхронном режиме. Этот процесс включает экспрессии генов синхронизированные колебательных и PSM клетки, которые колеблются в фазе образуют же сегменты. Период экспрессии генов колебательной составляет около 2-3 ч в мышах и около 30 мин в данио рерио. При отрыве, PSM клетки теряют синхронности2,3, но когда они вычисляются повторно, они могут самостоятельно организовать и восстановить населения синхронности4, о том, что муфта ячеек ключ для синхронизированных колебания.

Активные усилия показали, что сигнальных молекул в Дельта-Notch пути тесно связаны с синхронизированной колебания сегментации будильник генов. Фармакологических ингибиторы или генетические мутации Notch сигнализации десинхронизироваться населения осцилляторы. В данио рерио мутанты Notch сигнализации компоненты, такие как DeltaC, DeltaD и Notch1a, отображения асинхронных колебаний5,6. В мыши или куриных эмбрионов не только лиганд Notch Дельта like1 (Dll1), но и Notch модулятор Lunatic fringe (Lfng) является обязательным для синхронизированных колебания7,8,9. Однако, было трудно для тестирования функциональных возможностей таких молекул для передачи динамической информации от ячейки к ячейке, потому что временных резолюций обычных возмущений гена регулирование динамики не были достаточными для расследования процессы сроки 2-3 ч (Ультрадианных ритмов).

Мы недавно разработали комплексный метод для контроля и мониторинга картин выражения гена в mammalian клетках10. Эта технология позволяет индукции импульсов выражение гена путем периодического света освещение Ультрадианных временных масштабах. Этот протокол представляет методы для создания светочувствительных клеток линии и наблюдать динамических ответов репортер клеток, клеток люминесценции мониторинга в контексте сообщений к ячейке. Этот метод применим для анализа многих других сигнальных путей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. поколение стабильных клеточных линий по системе Tol2

  1. Transfect векторы плазмиды (рис. 1A) модулей на основе Tol2 optogenetic вместе с вектором выражения Транспозаза (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) в C2C12 клетки. На всех этапах, культуры клеток с DMEM среднего дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и пенициллин стрептомицина при 37 ° C (таблица 1), при наличии 5% CO2, в противном случае обозначать.
    1. Граф trypsinized клетки с-счетчик соматических клеток и Клемная 5 x 104 C2C12 клеток на хорошо в пластине 12-Ну один день до transfection.
    2. Совместное transfect 0,375 мкг векторов на основе Tol2 optogenetic (pAI177 или pAI218), 0,125 мкг вектора выбора препарата (pAI170) и 0,5 мкг вектора pCAGGS-mT2TP с помощью липофекция реагента.
    3. Trypsinize transfected клеток и пластины их в 100 мм культуры блюда один день после transfection.
    4. Обмен питательной среды для transfected клеток питательной среды, дополняется 100 мг/мл hygromycin.
    5. Культура клетки для 3 дней, чтобы устранить ООН transfected клеток. Обратите внимание, что средние изменения нет необходимости.
  2. Trypsinize transfected клеток и очистить популяция клеток, выражая флуоресцентных белков для отбора. Для приемника клетки, несущие pAI177 значение сортировки ворота Грин-PE канал для очистки mCherry положительных клеток населения. Для отправителя фото чувствительные клетки, несущие pAI218 установите APC канал для очистки iRFP713-положительных клеток населения сортировки ворота.
  3. (необязательно) Создание клоновых клеток населения стандартными методами, например ограниченный разрежения или одну ячейку Сортировка по СУИМ.

2. Оценка фото чувствительность инженерии клеток на уровне населения

Примечание: Эта часть описывает протокол для проверки динамических индукции Dll1 лигандом белков на синий свет освещение путем биохимических анализов, например ПЦР и Западный blotting.

  1. Настроить два типа инкубаторов с или без источников света для свет индуцированной состояние или условие темный, соответственно. Настройки света интенсивность сине транс осветитель, как показано на рисунке 1B, используя свет метр. Программу тайминги и продолжительность света освещения путем загрузки сценария управления одной плате микро-контроллер, позволяющий программируемых расписаний для освещения (рис. 1 c).
  2. Граф trypsinized клетки с-счетчик соматических клеток и пластины 1.0 x 105 фото чувствительных отправителя клетки, несущие pAI218 и pAI170 на 35-мм диаметр пластиковых культуры блюда (более чем 12 блюд для освещенности и 1 блюдо для темного состояния) и блюда в отдельные инкубаторы для темный/освещенности. После настройки блюда, держите двери закрыты до сбора lysates клетки инкубаторов.
  3. Один с половиной дней после покрытия, начать света освещение (клетки, как ожидается, будет более чем на 80% вырожденная). Не подвергайте клетки к свету, чтобы избежать нежелательных фото стимуляции.
    Примечание: Расписания для освещения зависит от цели экспериментов. Обратите внимание, что условие постоянной подсветки (например. интервалы 1-мин продолжительность и 10 мин с 402мкмоль/m/s света света) достаточна для простой проверки фото индукции, и что сильный свет освещение вредно для клеток. Таким образом убедитесь, что выбраны безвредные параметры для освещения.
  4. Около 2 дней после покрытия, подготовьте lysate клетки-с интервалом 30 мин. Перейти попробовать блюда из инкубаторов на льду и начните подготовку lysates клетки для дальнейшего анализа.

3. Динамическая отправитель получатель Assay на уровне населения: мониторинг в реальном времени клеточных реакций на оптических стимуляции, PMT

  1. Trypsinize и подсчитать количество отправителя и получателя клетки с стандартными методами. Подготовьте общий объем 1 мл смешивания подвеска 2,5 х 104 приемника и 1,25 x 105 отправителя клетки (соотношение 1:5).
    Примечание: 1:1, 2:1 или 1:2 отправитель получатель соотношения также работать с общей ячейки, количество 1,5 x 105. 10
  2. Тарелка смешанного клеток в каждой скважине 24-ну черный плит с питательной среды, содержащие люциферин 1 мм.
  3. Анализировать на читателя пластины для assay Люцифераза ячейки и подтвердить, что выходные сигналы не являются слишком высокими для записи системы.
    Примечание: Если выходные сигналы выше, чем 1 x 106 Фотон графов/s, они могут быть насыщенным. В этом случае снижают концентрацию люциферин оптимальные значения, так что выходные сигналы ниже, чем 1 x 106 Фотон графов/сек.
  4. Установить пластины на системе записи и начать запись программы (рис. 1 d). Например Начните света освещение в 18 ч после установки записи.
    Примечание: Временной фильтрации, такие как detrending сигналов с движущейся усреднения и Савицкий-Голея фильтрации, полезны для визуализации формы волны и пик обнаружений.

4. динамическое отправитель получатель Assay на уровне одной ячейки: в реальном времени визуализации одноклеточных ответов под контролем Optogenetic возмущений

  1. Пластина 0,5 x 105 приемник и 2,5 x 105 отправителя клетки на 27-мм диаметр стекло base 35 мм диаметр блюда. Убедитесь, что коэффициенты смешивания и числа общей ячейки (плотность клеток) правильно отрегулирован.
  2. Один день после покрытия, Обмен средний с 2 мл носитель записи (фенол красный бесплатно DMEM среднего дополнена 5% FBS, пенициллин стрептомицином и люциферин 1 мм) и установить стекло база блюдо на микроскопе. При необходимости промойте мусора омертвевших клеток с PBS (-).
    Примечание: Желательно сделать этот шаг в темное состояние.
  3. Настройка инвертированным микроскопом, оборудованные экологической палаты при 37 ° C и 5% CO2.
  4. Настройка Охлаждаемый ПЗС-камеры. Убедитесь, что температура фотоприемника охладится до конечного значения (как правило, от-90 ° C).
  5. Задать параметры для окна «Многомерного Timelapse» автоматическое приобретение программного обеспечения для захвата изображений с интервалами 5 мин и более 288 раз (более одной ночи записи).
    1. Откройте окно «Многомерного Timelapse», выберите канал люминесценции и медленный режим считывания 50 кГц из выпадающего меню и установите 4 x 4 биннинга с 4-мин экспозиции. Убедитесь, что режим считывания медленный режим 50 кГц, который имеет решающее значение для сокращения считывания шумы для обнаружения слабо излучающих биолюминесцентных свет.
    2. Откройте окно «Многомерного Timelapse», выберите каналы флуоресценции и быстрый режим считывания 1 МГц из выпадающего меню и установите 2 x 2 биннинга с воздействием 400 мс. Убедитесь, что режим считывания в быстрый режим 1 МГц для сокращения времени, необходимого для флуоресценции изображений.
    3. Начало покадровой записи, нажав кнопку «Приобрести».
  6. Извлечь одноклеточных следы люминесценции каналов из покадровой фильмы, программное обеспечение для анализа изображений, следующим образом. Во-первых сделать люминесценции и флуоресценции стека изображений путем импорта данных изображения программное обеспечение для анализа изображений. Для изображений свечения удалите горячей пикселей, производные от космических лучей путем сравнения интенсивности пикселей в височно рядом изображения, заменяя значения пикселов для временной среднего предыдущего и следующего кадров (реализованный как «SpikeNoise фильтр»), применить эти обработанные изображения к пространственно сглаживающий фильтр и вычитания значения пикселов фон разных мнений каждого кадра. Затем, определить «регион интерес» (ROI) для каждой ячейки на флуоресцентного изображения в каждой точке времени, применяются ROI светящиеся изображения, и измерить светящиеся интенсивности каждого ROI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы адаптировали Лайтон системы11,12, что позволяет выражение фото индуцированной гена в mammalian клетках, к изучению генетических осцилляторов с периодичностью 2 - 3-h. Эта система состоит из двух частей: Фото индуцибельной transcriptional активатор hG...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы показали метод для контроля динамики выражения гена с периодичностью 2-3 ч. Эта шкала времени намного короче, чем в других обычных систем, включая системы тет-на и оригинальная система Лайтон. Основные параметры для достижения Ультрадианных время весы являются полураспада фото индуц?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана JST, PRESTO (А.И.), основных исследований для эволюционной науки и техники (JPMJCR12W2 (р.к.)), субсидий для научных исследований в инновационных областях (Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония 26119708 (А.И.) и 16 H 06480 (р.к.)), научные исследования () (Япония общества для поощрения науки (JSP) 24240049 (р.к.)) и молодых ученых (A) (JSP-страницы 15 H 05326 (А.И.)) и субсидий для научных исследований в инновационных областях «флуоресцирования Live imaging» МПКСНТ, Японии и платформы для динамического подходов для жизни системы от МПКСНТ, Япония.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
CameraAndoriKon M-934
MicroscopeOlympusIX-81 ZDC
PMT deviceChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Blue LED illuminatorOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicillin-streptomycinNacalai26253-84
Fetal bovine serumSigma172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )Hi-tech303012
D-Luciferin Potassium SaltNacalai20028-24
Light meterLI-COR BiosciencesLI-250A
anti-HA-Peroxidase antibodyRocheclone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibodyWakoclone 2F3

Ссылки

  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
  3. Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
  4. Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
  5. Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
  6. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
  7. Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
  8. Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141(2012).
  9. Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
  10. Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
  11. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
  12. Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  14. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3(2010).
  15. Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  16. Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133optogeneticGAVPONotch

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены