JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Özet

Hücreleri düzgün geçici hücreleri çevreleyen gelen çeşitli faktörler tarafından etkilenmiştir ortamlar değişen yanıt vermesi. Yol sinyal çentik gibi temel moleküler makine normal embriyo gelişiminde önemli roller oynayan hücre hücre iletişim için biridir. Bu yolu bir hücre hücre transfer ultradian ritimleri ile salınım bilgi içerir, ancak moleküler biyoloji teknikleri ilerlemeye rağmen bu çok hücreli etkileşimler salınım gen üzerinde etkisini aydınlatmak için zor oldu dinamiği. Burada, optogenetic kontrol ve canlı gen ifade şekillerinin kesin bir zamansal biçimde izleme izin veren bir protokol mevcut. Bu yöntem başarıyla çentik sinyal, hücre içi ve hücreler arası periyodik giriş frekans ayarlama ve tek hücreli çözünürlükte değişen faz tarafından iç salınımlar trene binmek ortaya koydu. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlayan çeşitli sinyal yolları dinamik özelliklerini analiz için geçerlidir.

Giriş

Hücre hücre iletişim gelişim süreçlerinde embriyonik desenlendirme kritik rol oynamaktadır. Omurgalı embriyo metameric yapıları somites olarak adlandırılan bölümleme saat1adı verilen bir zaman tutma saat kontrol altında kesin bir zamansal doğruluk ile ön-arka gövde ekseni boyunca oluşur. Bu işlem sırasında bir grup presomitic mesoderm (PSM) hücre düzenli olarak dönüştürülür somites zaman uyumlu bir şekilde. Bu işlem eşzamanlı salınım gen ekspresyonu içerir ve aynı somites aşamasında salınım PSM hücreleri oluşturur. Salınım gen ekspresyonu yaklaşık 2-3 h farelerde ve yaklaşık 30 dk içinde Zebra balığı dönemidir. Ayrışmış PSM hücreleri senkronizasyonu2,3kaybetmek, ama yeniden toplanmış oldukları zaman, onlar kendi kendine organize etmek ve nüfus senkronizasyonu4hücre-hücre kaplin eşitlenmiş için bir anahtar olduğunu düşündüren, yeniden elde etmek titreşimler.

Geniş çabaları Delta-çentik yolu sinyal molekülleri segmentasyon genlerine eşitlenmiş salınım için sıkıca bağlandığından emin saptandı. Farmakolojik inhibitörleri veya çentik sinyal, Genetik mutasyonlar osilatörler nüfusu desynchronize. Zebra balığı, DeltaC, DeltaD ve Notch1a, gibi bileşenleri sinyal çentik mutantlar zaman uyumsuz salınımlarını5,6görüntüler. Eşitlenmiş salınımlarını7,8,9için piliç ya da fare embriyo, sadece çentik ligand Delta-like1 (Dll1) aynı zamanda çentik modülatör deli fringe (Lfng) gereklidir. Gen düzenlemesi dinamikler geleneksel pertürbasyon zamansal çözünürlük araştırmak için yeterli değildi çünkü ancak, hücre hücre böyle molekülleri dinamik bilgi aktarımı için fonksiyonel yeteneğini test etmek zor olmuştur zaman ölçeği 2-3 h (ultradian ritimleri) süreçleri.

Biz son zamanlarda kontrol ve monitör gen ifade desenleri memeli hücreleri10entegre bir yöntem geliştirdik. Bu teknoloji, ultradian zaman-ölçeklerde periyodik ışık aydınlatma tarafından gen ifade darbeleri indüksiyon sağlar. Bu iletişim kuralı ışığa duyarlı hücre hatları kurmak ve hücre-hücre iletişim bağlamlarda izleme canlı hücre ışıldama tarafından muhabiri hücre dinamik yanıtlar gözlemlemek için yöntemleri gösterir. Bu yöntem diğer birçok sinyal yolları analiz için geçerlidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. nesil istikrarlı hücre hatları ile Tol2 sistemi

  1. Plazmid vektörel çizimler (şekil 1A) transposase (Tol2) ifade vektör (pCAGGS-mT2TP) ile birlikte optogenetic Tol2 tabanlı modüllerin C2C12 hücrelere transfect. Tüm adımlar, kültür hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve penisilin-streptomisin 37 ° c (tablo 1), aksi takdirde belirtilen % 5 CO2, huzurunda ile takıma DMEM orta ile.
    1. Trypsinized hücreleri hücre sayacı ile ve iyi bir 12-şey plaka başına plaka 5 x 104 C2C12 hücre transfection önce bir gün sayısı.
    2. Optogenetic Tol2 tabanlı vektörel çizimler (pAI177 veya pAI218), 0,125 μg ilaç seçimi vektörünün (pAI170) ve pCAGGS-mT2TP vektör 0.5 μg 0.375 μg lipofection reaktif kullanarak ortak transfect.
    3. Transfected hücre trypsinize ve onları bir gün transfection sonra 100 mm kültür yemekleri plakası.
    4. Exchange kültür orta kültür 100 mg/mL hygromycin ile desteklenmiş orta transfected hücreler için.
    5. Kültür hücreleri un transfected hücreleri ortadan kaldırmak 3 gündür. Orta değiştirmek gerekli olmadığını unutmayın.
  2. Transfected hücre trypsinize ve floresan proteinler seçimi için ifade hücreleri nüfusu arındırmak. PAI177 taşıyan alıcı hücreler için sıralama kapısı arıtma mCherry pozitif hücre nüfusunun yeşil-PE kanala ayarlayın. PAI218 taşıyan fotoğraf duyarlı gönderen hücreler için sıralama kapısı arıtma iRFP713 pozitif hücre nüfusunun APC kanala ayarlayın.
  3. (isteğe bağlı) Klonal hücre nüfus sınırlı seyreltme veya tek hücreli FACS tarafından sıralama gibi standart yöntemleri kurmak.

2. fotoğraf-nüfus düzeyinde mühendislik hücreleri hassasiyeti değerlendirilmesi

Not: Bu bölümü qPCR ve Western Blot gibi biyokimyasal testleri tarafından mavi ışık aydınlatma üzerine Dll1 ligand proteinlerin dinamik indüksiyon kontrol etmek için bir protokolünü açıklar.

  1. İnkübatörler veya ışık kaynakları olmadan ışık kaynaklı koşul veya karanlık bir koşul için iki tür sırasıyla ayarlayın. Set-up ışık-yoğunluğu bir mavi LED trans-ışık ölçer kullanarak ışığı, şekil 1B, gösterildiği gibi. Program zamanlamaları ve bir tek platalı mikro-denetleyicisine aydınlatma (şekil 1 c) için programlanabilir programları sağlayan bir denetim komut yükleme tarafından Işık Aydınlatma süresi.
  2. Hücre sayacı ile trypsinized hücreleri ve pAI218 ve pAI170 35-mm çaplı plastik kültür yemekleri (ışık durumu için 12'den fazla yemekler ve karanlık durum için 1 çanak) taşıyan plaka 1.0 x 105 fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri saymak ve bulaşıkları ayarla İnkübatörler karanlık/ışık koşulları için ayırın. Yemekler kadar ayarladıktan sonra hücre lysates toplama kadar kapalı İnkübatörler kapıları tutun.
  3. Bir buçuk gün sonra kaplama, başlangıç ışık aydınlatma (hücrelerin % 80'den fazla olması bekleniyor Konfluent). İstenmeyen fotoğraf-stimülasyon önlemek için gün ışığına yapan hücreleri göstermek yok.
    Not: Aydınlatma için zamanlama deneyler bilerek bağlıdır. Unutmayın bir sürekli aydınlatma koşulu (e.g. 1-min süresi ve 10 dk aralıklarla 40 µmol/m2/s ışık-yoğunluğu ile) fotoğraf-indüksiyon ve o güçlü ışık aydınlatma basit bir denetim hücrelere zararlıdır için yeterlidir. Böylece, aydınlatma için zararsız parametreleri seçili olduğuna emin olun.
  4. Yaklaşık 2 gün sonra kaplama, cep-lysate 30 dk aralıklarla hazırlayın. Örnek yemekleri İnkübatörler on Ice ve hücre lysates daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlanıyor başlangıç için hareket ettirin.

3. dinamik Gönderici-alıcı tahlil nüfus düzeyinde: Devresel_ödeme tarafından optik stimülasyon üzerine hücresel tepkilerin gerçek zamanlı izleme

  1. Trypsinize ve standart yöntemlerle göndereni ve alıcısı hücre sayıları saymak. 1-mL süspansiyon 2, 5 x 104 alıcı ve 1,25 x 105 gönderen hücreleri (1:5 oranı) karıştırma Toplam hacim hazırlayın.
    Not: iş 2:1, 1:1, ya da 1:2 Gönderici-alıcı oranları da 1.5 x 10 toplam hücre sayısı ile5. 10
  2. Plaka kültür orta ile 1 mM biyoluminesans içeren hücrelerde 24-şey siyah plakaların her şey karışık.
  3. Plaka okuyucu luciferase tahlil için hücrelerdeyse analiz ve çıkış sinyalleri kayıt sistemi için çok yüksek olmadığını doğrulayın.
    Not: Eğer çıkış sinyalleri 1 x 106 foton sayar/sn yüksek, onlar doymuş. Bu durumda, çıkış sinyalleri 1 x 106 foton sayar/sn düşük olan biyoluminesans en uygun değerlere konsantrasyonu azaltma.
  4. Plaka üzerinde kayıt sistemi ayarlayın ve bir kayıt programı (şekil 1 d) başlatın. Örneğin, ışık aydınlatma 18 h kayıt ayarladıktan sonra başlar.
    Not: Geçici filtreleme ortalama ve Çetinkaya-deniyordun filtreleme, hareketli detrending sinyalleri gibi dalga formları görselleştirme için yararlı ve tespitlerde zirve.

4. dinamik Gönderici-alıcı tahlil tek hücre düzeyinde: gerçek zamanlı Optogenetic pertürbasyon kontrol altında tek hücreli tepkilerin görüntüleme

  1. Plaka 0.5 x 105 alıcı ve 2. 5 x 27, mm, çapı, cam, taban 35 mm çap yemekleri üzerine 105 gönderen hücreleri. Bu karışım oranları ve bir toplam hücresini sayı (bir hücre yoğunluğu) doğru olarak ayarlanır emin olun.
  2. Bir gün kaplama sonra orta kayıt orta 2 mL ile döviz (fenol kırmızısı ücretsiz DMEM orta % 5 ile desteklenmiş FBS, penisilin-streptomisin ve 1 mM biyoluminesans) ve cam-base çanak mikroskobunun ayarlayın. Gerekirse, PBS (-) ile ölü hücreleri enkaz dışarı yıkamak.
    Not: Bu adımı karanlık bir durumda yapmak için tercih edilir.
  3. Bir çevre odası 37 ° C ve % 5 CO2ile donatılmış bir ters mikroskobu ayarlayın.
  4. Soğutulmuş bir CCD kamera ayarla. CCD sensör sıcaklığını hedef değeri (genellikle,-90 ° C) soğuduktan emin olun.
  5. Otomatik Alım yazılımında görüntüler 5 dk aralıklarla ve daha fazla 288 yakalamak için "Çok boyutlu Timelapse" pencere için parametreleri belirleme (birden fazla gecede kayıt) zamanlar.
    1. "Çok boyutlu Timelapse" penceresini açın, bir ışıldama kanal ve yavaş 50 kHz okuma modu aşağı açılır menüden seçin ve 4 x 4 4-min pozlama ile binning ayarla. Okuma modu zayıf yayan kollarındaki ışık algılamak için okuma sesleri azaltmak için önemlidir yavaş 50 kHz modu için ayarlandığından emin olun.
    2. "Çok boyutlu Timelapse" penceresini açın, Floresans kanalları ve hızlı 1 MHz okuma modu aşağı açılır menüden seçin ve 2 x 2 400 ms pozlama ile binning ayarla. Okuma modu hızlı 1 MHz moduna Floresans görüntüleme için gereken süreyi azaltmak için ayarlandığından emin olun.
    3. "Al" düğmesini tıklatarak kayıt hızlandırılmış başlatın.
  6. Tek hücreli izleri ışıldama kanalları hızlandırılmış film görüntü analiz yazılımı tarafından aşağıdaki gibi ayıklayın. Öncelikle, ışıma ve floresan yığın görüntüleri görüntü analiz yazılımı için görüntü veri alarak olun. Işıma görüntüler için gelen kozmik ışınları zamansal ortalamasına ("SpikeNoise filtre" olarak uygulanan), önceki ve sonraki kare piksel değerlerini yerine geçici bitişik görüntülerde piksel yoğunluklarda karşılaştırarak elde edilen sıcak piksel kaldırmak Bu işlenmiş görüntüler bir dağınık şekilde düzeltme uygulamak ve arka plan piksel değerlerini out-field sayısı her çerçeveden çıkarın. Sonra bir "bölge" ilgi belirlemek (ROI) her hücre, her zaman bir noktada floresan image için yatırım Getirisi Işıksaçan resimler için geçerlidir ve her yatırım Getirisi Işıksaçan yoğunluğunu ölçmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu ile 2 - 3 h periodicity genetik osilatörler çalışma memeli hücrelerinde sağlayan aydınlatacağı sistemi11,12, uyarlanmış. Bu sistemi iki bölümden oluşur: fotoğraf-indüklenebilir transkripsiyon harekete geçirmek hGAVPO ve sürücü transkripsiyon ilgi rasgele genlerin için UAS organizatörü kaset. Fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu pulsatil Kinetik hızlandırmak için UAS ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gen ifade dynamics periyodik olarak 2-3 h ile denetlemek için bir yöntem gösterdik. Bu zaman-ölçek Tet tarih sistemi ve özgün aydınlatacağı sistemi de dahil olmak üzere diğer geleneksel sistemleri daha çok kısadır. Ultradian zaman ölçekleri ulaşmak için anahtar parametreleri yarı-hayat moleküler ürünleri fotoğraf kaynaklı, mRNA'ların ve proteinler vardır. Bu kinetik parametrelerin hücre tipleri ve türler üzerinde bağlı olabilir. Dizileri ve hedef proteinlerin işlevlerini değiştirmez Kin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser evrimsel bilimi ve teknolojisi (JPMJCR12W2 (yazar)), Grant-in-Aid (Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT), Japonya yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için JST, PRESTO (AI), çekirdek araştırma tarafından desteklenmiştir 26119708 (yapay zeka) ve 16 H 06480 (yazar)), bilimsel araştırma (A) (Japonya toplum bilim (JSP'ler) 24240049 teşviki (yazar)) ve genç bilim adamları (A) (JSP'ler 15 H 05326 (yapay zeka)) ve yenilikçi alanlarda "floresan bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid Canlı MEXT, Japonya ve Platform için dinamik yaklaşımlar yaşayan için MEXT, Japonya görüntüleme sistemi".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
CameraAndoriKon M-934
MicroscopeOlympusIX-81 ZDC
PMT deviceChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Blue LED illuminatorOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicillin-streptomycinNacalai26253-84
Fetal bovine serumSigma172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )Hi-tech303012
D-Luciferin Potassium SaltNacalai20028-24
Light meterLI-COR BiosciencesLI-250A
anti-HA-Peroxidase antibodyRocheclone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibodyWakoclone 2F3

Referanslar

  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
  3. Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
  4. Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
  5. Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
  6. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
  7. Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
  8. Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141(2012).
  9. Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
  10. Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
  11. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
  12. Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  14. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3(2010).
  15. Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  16. Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 133optogenetic y ntemiger ek zamanl g r nt lemeluciferase muhabirGAVPOsal n m ifadeentik sinyal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır