Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Resumen

Células deben responder correctamente al cambio temporal de entornos, que están influidos por varios factores desde que rodea las células. La muesca que se vía de señalización es una de dichas máquinas moleculares esenciales para la comunicación de célula a célula, que juega un papel clave en el desarrollo normal de embriones. Esta vía consiste en una transferencia de célula a célula de información oscilatoria con Ritmos ultradianos, pero a pesar de los avances en técnicas de biología molecular, ha estado desafiando a dilucidar los efectos de interacciones multicelulares gen oscilatoria dinámica. Aquí, presentamos un protocolo que permite optogenetic control y seguimiento directo de los patrones de expresión génica de manera temporal precisa. Este método con éxito reveló que entradas periódicas intracelulares e intercelulares de la señalización de Notch arrastrar las oscilaciones intrínsecas por sintonización de frecuencias y fase de cambio en la resolución de unicelulares. Este enfoque es aplicable para el análisis de las características dinámicas de varias vías de señalización, ofreciendo una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Introducción

Comunicación de célula a célula juega papeles críticos en modelar embrionario en procesos de desarrollo. En embriones de vertebrados, las estructuras metaméricos, llamadas somitas se forman a lo largo del eje corporal antero-posterior con una precisa exactitud temporal bajo el control de un reloj de tiempo, llamado el reloj de segmentación¹. Durante este proceso, un grupo de células del mesoderm presomitic (PSM) se convierten periódicamente en somitas en forma sincrónica. Este proceso implica la expresión génica oscilatoria sincronizada y forma de las células PSM que oscilan en fase el mismo somitas. El período de la expresión génica oscilatoria es alrededor de 2 a 3 h en ratones y unos 30 min en el pez cebra. Cuando disociado, PSM células pierden la sincronía^2,3, pero cuando son nuevamente agregadas, puede auto-organizarse y recuperar la población sincronía⁴, sugiriendo que el acoplamiento de la célula es una clave para la sincronización oscilaciones.

Esfuerzos extensos revelaron que moléculas de señalización en la vía de Notch Delta están conectadas firmemente a las oscilaciones sincronizadas de los genes de reloj de segmentación. Inhibidores farmacológicos o mutaciones genéticas de la señalización de Notch desincronizando la población de los osciladores. En el pez cebra, mutantes de la muesca señalización componentes como DeltaC, DeltaD y Notch1a, Mostrar oscilaciones asincrónicas^5,6. En embriones de pollo o el ratón, el ligando de Notch Delta-like1 (Dll1), sino también el muesca modulador Lunatic fringe (Lfng) se requiere para oscilaciones sincronizadas^7,8,9. Sin embargo, ha sido difícil para poner a prueba la capacidad funcional de estas moléculas para la transferencia de información dinámica de célula a célula, porque las resoluciones temporales de perturbación convencional de la dinámica de regulación gen no eran suficientes para investigar la procesos de escalas de tiempo de 2-3 h (Ritmos ultradianos).

Recientemente hemos desarrollado un método integrado para controlar y supervisar patrones de expresión de genes en células de mamíferos¹⁰. Esta tecnología permite la inducción de pulsos de expresión del gene por iluminación de luz periódica en escalas de tiempo ultradianos. Este protocolo representa los métodos para establecer líneas de células fotosensibles y observar respuestas dinámicas de las células de reportero por luminiscencia de células vivas en los contextos de la comunicación de célula a célula. Este método es aplicable para el análisis de muchas otras vías de señalización.

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Protocolo

1. generación de líneas celulares estables por el sistema de Tol2

1. Transfectar vectores plásmido (figura 1A) de módulos basados en Tol2 optogenetic junto con el vector de expresión de la transposasa (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) en las células C2C12. En todas las etapas, células en cultivo con medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina a 37 ° C (tabla 1), en presencia de 5% CO₂, denotada lo contrario.
   1. Contar células tripsinizaron con un contador de células y placa de 5 x 10⁴ C2C12 células por pocillo en una placa de 12 pozos un día antes de la transfección.
   2. Co transfectar 0,375 μg de vectores basados en Tol2 optogenetic (pAI177 o pAI218), 0.125 μg de un vector de la selección de medicamentos (pAI170) y 0,5 μg de pCAGGS-mT2TP vector utilizando reactivo lipofection.
   3. Trypsinize células transfected y les placa de en platos de cultivo de 100 mm un día después de la transfección.
   4. Cambio de medio de cultivo para células transfected a medio de cultivo suplementado con 100 mg/mL Higromicina.
   5. Células en cultivo durante 3 días eliminar transfected las células. Tenga en cuenta que medio cambio no es necesario.
2. Trypsinize células transfected y purificar una población de células que expresan proteínas fluorescentes para la selección. Para las células del receptor con pAI177, establezca la puerta de la clasificación en canal verde-PE para la purificación de la población de células mCherry-positiva. Para las células fotosensibles remitente llevar pAI218, establezca la puerta de la clasificación en canal APC para la purificación de la población de células iRFP713-positiva.
3. (opcional) Establecer una población clonal de la célula por métodos estándar, tales como dilución limitada o unicelulares clasifica por FACS.

2. evaluación de la foto-sensibilidad de las células de ingeniería a nivel de población

Nota: Esta parte describe un protocolo para comprobar la inducción dinámica de proteínas de ligando Dll1 con iluminación de luz azul por ensayos bioquímicos, tales como qPCR y Western blotting.

1. Establecer dos tipos de incubadoras con o sin fuentes de luz para una condición inducida por la luz o una afección oscurezca, respectivamente. Configuración-intensidad de la luz de un LED azul trans-iluminador, como se muestra en la figura 1B, utilizando un medidor de luz. Programa horarios y duración de iluminación de luz cargando un script de control a un micro-controlador de una placa que permite horarios programables para la iluminación (figura 1).
2. Contar las células tripsinizaron con un contador de células y placa de 1.0 x 10⁵ emisor fotosensible células con pAI218 y pAI170 en los platos de la cultura plástica de 35 mm de diámetro (más de 12 platos de condición de luz y 1 plato de condición oscura) y los platos en incubadoras para condiciones de luz/oscuridad se separan. Después de la creación de platos, mantenga las puertas de las incubadoras cerraron hasta recoger lysates de la célula.
3. Uno y medio días después de la galjanoplastia, empezar a luz (las células se esperan que más del 80% confluente). No se exponga a la luz para evitar indeseable foto-estimulación de las células.
   Nota: Horarios de iluminación depende del propósito de los experimentos. Tenga en cuenta que una condición de iluminación continua (por ej. intervalos de duración y 10 minutos de 1 minuto con 40 μmol/m²/s-intensidad de la luz) es suficiente para un simple control de inducción de foto y esa iluminación luz fuerte es perjudicial para las células. Así, asegúrese de que se seleccionan parámetros inofensivos para la iluminación.
4. Aproximadamente 2 días después de la galjanoplastia, preparar cell-lisado con intervalos de 30 min. Hacia platos muestra de incubadoras en hielo y comienza a preparar los lysates de la célula para su posterior análisis.

3. dinámica de emisor y receptor ensayo a nivel de población: monitoreo en tiempo real de respuestas celulares al estímulo óptico por PMT

1. Trypsinize y cuenta el número de remitente y el receptor las células con métodos estándar. Preparar un volumen total de 1 mL de la mezcla de suspensión de 2.5 x 10⁴ receptor y 1.25 x 10⁵ células de remitente (proporción 1:5).
   Nota: 2:1, 1:1, o 1:2 relación de emisor-receptor también funciona con un número total de células de 1.5 x 10⁵. ¹⁰
2. Placa mixta células en cada pocillo de las placas de 24 pocillos negras con medio de cultivo con luciferin 1 mM.
3. Analizar las células en el lector de placas para ensayo de luciferasa y confirmar que las señales de salida no son demasiado altas para el sistema de grabación.
   Nota: Si las señales de salida son mayores que 1 x 10⁶ fotones cuenta/s, puede estar saturados. En ese caso, disminuir la concentración de luciferin valores óptimos para que las señales de salida son menores que 1 x 10⁶ fotones cuentas/s.
4. Coloque la placa en el sistema de grabación y comenzar un programa de grabación (figura 1). Por ejemplo, iniciar la iluminación de la luz a las 18 h después de configurar la grabación.
   Nota: Filtrado Temporal, tales como señales robustos con móviles promedio y Savitzky-Golay filtrado, son útil para la visualización de formas de onda y las detecciones de pico.

4. dinámica de emisor y receptor análisis a nivel unicelular: en tiempo real imágenes de unicelular respuestas bajo el Control de perturbación Optogenetic

1. Placa de 0,5 x 10⁵ receptor y 2.5 x 10⁵ células de remitente en platos de base 27 mm vidrio diámetro 35 mm de diámetro. Asegurarse de que proporciones de mezcla y un número de celular total (una densidad de la célula) están ajustadas correctamente.
2. Un día después de la galjanoplastia, intercambio medio con 2 mL de medio de grabación (rojo de fenol libre DMEM suplementado con 5% FBS, penicilina-estreptomicina y luciferin de 1 mM) y el plato base de cristal en el microscopio. Si es necesario, eliminar restos de células muertas con PBS (-).
   Nota: Es preferible hacer este paso en una condición oscura.
3. Configurar un microscopio invertido, dotado de una cámara a 37 ° C y 5% CO₂.
4. Configurar una cámara CCD refrigerada. Asegúrese de que se haya enfriado la temperatura del sensor CCD en el valor de destino (normalmente,-90 ° C).
5. Establecer parámetros para la ventana de "Lapso de tiempo multidimensional" en el software de adquisición automática para capturar imágenes con intervalos de 5 min y más de 288 veces (más de una grabación durante la noche).
   1. Abrir ventana de "Lapso de tiempo multidimensional", seleccione un canal de la luminiscencia y un modo de lectura lenta de 50 kHz en el menú desplegable y ajuste binning 4 x 4 con 4 min de exposición. Asegúrese de que el modo de lectura se establece en el modo lento de 50 kHz, que es crítico para la reducción de ruidos de lectura para detectar la débil emisión luz bioluminiscente.
   2. Abrir ventana de "Lapso de tiempo multidimensional", seleccione canales de fluorescencia y un modo rápido de lectura de 1 MHz en el menú desplegable y sistema 2 x 2 binning con exposición de 400 ms. Asegúrese de que el modo de lectura se establece en el modo rápido de 1 MHz para reducir el tiempo necesario para la proyección de imagen de la fluorescencia.
   3. Start Time-lapse de grabación haciendo clic en "Adquirir".
6. Extraiga el unicelular rastros de canales de luminiscencia de películas Time-lapse por software de análisis de imagen, como sigue. En primer lugar, hacer imágenes de pila de luminiscencia y fluorescencia mediante la importación de los datos de imagen a software de análisis de imagen. Imágenes de luminiscencia, quitar píxeles calientes derivados de los rayos cósmicos mediante la comparación de las intensidades de los píxeles de imágenes temporal adyacentes, reemplazando los valores de píxel para el promedio temporal de los fotogramas anteriores y siguientes (implementado como filtro"SpikeNoise"), Estas imágenes procesadas se aplica un filtro espacial suavizado y restar valores de píxeles de fondo de out-field vistas de cada fotograma. A continuación, determinar una "región de interés" (ROI) para cada celda en una imagen fluorescente en cada momento, el retorno de la inversión se aplica a imágenes luminiscentes, y medir la intensidad luminiscente de cada retorno de la inversión.

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Resultados

Adaptamos el LightOn sistema^11,12, que permite la expresión del gen foto-inducida en células de mamíferos, el estudio de los osciladores genéticos con periodicidad de 2 - 3 h. Este sistema consta de dos partes: el hGAVPO activador transcripcional inducible por la foto y un cassette de promotor de UAS a transcripción unidad arbitraria genes de interés. Para acelerar la cinética pulsátil de la expresión génica inducida por...

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Discusión

Mostramos un método para controlar la dinámica de expresión de genes con una periodicidad de 2 a 3 h. Esta escala de tiempo es mucho más corta que los de otros sistemas convencionales, incluyendo el sistema Tet y el original sistema de LightOn. Parámetros clave para llegar a las escalas de tiempo ultradianos son la vida media de productos molecular inducida por la foto, mRNAs y proteínas. Estos parámetros cinéticos pueden depender de las especies y tipos celulares. Para afinar la cinética, sustituir secuencias d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson and Company	FACSAriaII SORP
Camera	Andor	iKon M-934
Microscope	Olympus	IX-81 ZDC
PMT device	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Blue LED illuminator	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Penicillin-streptomycin	Nacalai	26253-84
Fetal bovine serum	Sigma	172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )	Hi-tech	303012
D-Luciferin Potassium Salt	Nacalai	20028-24
Light meter	LI-COR Biosciences	LI-250A
anti-HA-Peroxidase antibody	Roche	clone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibody	Wako	clone 2F3