JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

Abstract

תאים צריך להגיב כראוי חנותם לסביבות משתנות, אשר מושפעים על ידי גורמים שונים של תאים המקיפים אותם. החריץ איתות הוא אחד כזה מכונות מולקולריות חיוני עבור תקשורת לתא, אשר ממלא את תפקידי המפתח בהתפתחות נורמלית של העוברים. מסלול זה כרוכה לתא העברה של מידע מתנדנדות עם מקצבים ultradian, אך למרות ההתקדמות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, זה מאתגר התירי את ההשפעה של אינטראקציות multicellular על ג'ין מתנדנדות דינמיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר optogenetic בקרה ופיקוח בשידור חי דפוסי ביטוי גנים באופן זמני מדויק. שיטה זו חשף בהצלחה תשומות תקופתיים תאיים, המערכת של חריץ איתות entrain תנודות מהותי על ידי תדר כוונון שלב הסטה ברזולוציה תא בודד. גישה זו ישימה על הניתוח של המאפיינים דינמי של איתות המסלולים השונים, מתן פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות multicellular.

Introduction

תקשורת לתא לשחק תפקידים חיוניים המתבנת עובריים בתהליכים התפתחותיים. ב העוברים בעלי. החוליות, המבנים metameric הנקרא somites נוצרות לאורך הציר הקדמי-אחוריים הגוף עם דיוק טמפורלית מדויק תחת השליטה של שעון זמן, קרא את השעון של פילוח1. במהלך תהליך זה, קבוצה של תאים presomitic והמזודרם (PSM) מעת לעת מומרים somites באופן סינכרוני. תהליך זה דורש ביטוי גנים מתנדנדות מסונכרן ויוצרים תאים PSM נעים בשלב של somites אותו. התקופה של ביטוי גנים מתנדנדות היא בסביבות 2-3 h בעכברים, בערך 30 דקות של דג זברה. הפומבית, PSM התאים מאבדים את2,synchrony3, אך כאשר הם צבורים מחדש, הם יכולים לארגן את עצמי, לשחזר את האוכלוסייה synchrony4, רומז תא-תא צימוד הוא מפתח מסונכרן תנודות.

המאמצים חשף כי מולקולות איתות בשביל חריץ דלתא מחוברים בחוזקה תנודות מסונכרן של גנים שעון פילוח. מעכבי תרופתי או מוטציות גנטיות של חריץ איתות בטל סינכרון האוכלוסייה מתנדים. דג זברה מוטנטים של חריץ איתות רכיבים, כגון DeltaC, DeltaD, Notch1a, להציג תנודות אסינכרוני5,6. עוברי צ'יק או עכבר, לא רק של ליגנד חריץ דלתא-like1 (Dll1), אלא גם הציצית החריץ אפנן המטורף (Lfng) נדרש תנודות מסונכרן7,8,9. עם זאת, זה קשה לבחון את יכולת תפקודית של מולקולות כאלה להעברת מידע דינאמי מתא לתא, כי החלטות הטמפורלי של ההפרעות המקובלת של ג'ין תקנה דינמיקה לא היו מספיק כדי לחקור תהליכים של צירי זמן של 2-3 h (מקצבים ultradian).

לאחרונה פיתחנו שיטה משולבת כדי לשלוט ולפקח ג'ין ביטוי תבניות תאים בתרבית של10. טכנולוגיה זו מאפשרת אינדוקציה של פולסים ביטוי הגן על ידי תאורה אור תקופתיים על פרקי זמן ultradian. פרוטוקול זה מייצג את שיטות ליצור שורות תאים פוטוסנסיטיבית ולבחון תגובות דינמי של הכתב תאים על ידי הפריה חוץ גופית לחיות תאים ניטור בהקשרים של התקשורת לתא. שיטה זו ישימה על הניתוח של רבים אחרים איתות המסלולים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. דור של שורות תאים יציב על ידי מערכת Tol2

  1. Transfect פלסמיד וקטורים (איור 1 א') של מודולים optogenetic מבוססי Tol2 יחד עם וקטור ביטוי transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) לתוך התאים C2C12. בכל השלבים, התרבות תאים בינונית DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס (טבלה 1), בנוכחות 5% CO2, אחרת מסומן.
    1. לספור תאים trypsinized עם תא-מונה, צלחת 5 x 10 תאים4 C2C12 לכל טוב בצלחת 12-. ובכן, יום אחד לפני תרביות תאים.
    2. שיתוף transfect μg 0.375 של וקטורים מבוסס-Tol2 optogenetic (pAI177 או pAI218), μg 0.125 של הווקטור מבחר סמים (pAI170) ו- 0.5 μg של וקטור pCAGGS-mT2TP על-ידי שימוש ריאגנט lipofection.
    3. Trypsinize transfected תאים, צלחת אותם 100 מ מ תרבות מנות יום לאחר תרביות תאים.
    4. חילופי תרבות בינונית עבור תאים transfected לבינונית תרבות בתוספת 100 מ"ג/מ"ל hygromycin.
    5. התרבות תאים במשך 3 ימים לחסל תאים transfected האו ם. שימו לב כי שינוי בינוני לא הכרחי.
  2. Trypsinize transfected תאים, לטהר אוכלוסיה של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט לבחירה. תאים מקלט נושאת pAI177, להגדיר את השער המיון לערוץ ירוק-PE לטיהור מאוכלוסיית תא mCherry-חיוביות. תאי צילום רגיש השולח נושא pAI218, להגדיר את השער המיון לערוץ APC לטיהור מאוכלוסיית תא iRFP713-חיוביות.
  3. (אופציונלי) צור אוכלוסיה המשובטים תא על-ידי בשיטות הרגילות, כגון דילול מוגבלת או תא בודד מיון לפי FACS.

2. הערכה של צילום-רגישות של תאים מהונדסים ברמת האוכלוסייה

הערה: החלק הזה מתאר פרוטוקול כדי לבדוק אם אינדוקציה דינמי של חלבונים ליגנד Dll1 על תאורה אור כחול מבחני ביוכימיים, כגון qPCR וסופג המערבי.

  1. להגדיר שני סוגי חממות עם או בלי מקורות אור תנאי אור-induced או תנאי כהה, בהתאמה. הגדרת אור בעוצמה של כחול-LED הטרנס-המאייר, כפי שמוצג באיור 1B, באמצעות מד האור. תזמוני תוכנית ומשך ההארה האור על-ידי טעינת תסריט-שליטה על יחיד פנסיון מיקרו-בקר המאפשר לתכנות לוחות זמנים עבור תאורה (איור 1C).
  2. לספור תאים trypsinized עם תא-מונה ותאים צלחת 1.0 x 105 צילום רגיש השולח נושא pAI218 ו- pAI170 על מנות תרבות פלסטיק בקוטר 35 מ מ (יותר מ-12 מנות עבור מצב אור ומנה 1 עבור תנאי כהה) ולהגדיר את הכלים הפרד חממות לתנאי תאורה/כהה. לאחר הגדרת מנות, לשמור על דלתות אינקובטורים סגור עד איסוף תא lysates.
  3. אחד וחצי ימים אחרי ציפוי, הפעלת תאורה אור (תאים צפויים להיות יותר מ- 80% confluent). לא לחשוף תאים להדליק כדי להימנע תמונה לא רצויה-גירוי.
    הערה: לוחות זמנים עבור תאורה תלויה המטרה של ניסויים. חשוב לציין כי תנאי תאורה מתמשכת (למשל. מרווחי משך ו- 10 דקות 1-מין עם 40 µmol/m2/s אור בעוצמה) מספיקה עבור בדיקה פשוטה של צילום-אינדוקציה, תאורה אור חזק כי הוא מזיק לתאים. לפיכך, להבטיח כי לא מזיק פרמטרים עבור תאורה נבחרים.
  4. כ- 2 ימים לאחר ציפוי, להכין תא-lysate עם 30-מין במרווחים. העבר מנות מדגם של חממות על הקרח, ולהתחיל להתכונן תא lysates ניתוח נוסף.

3. דינמי השולח-מקלט Assay ברמת האוכלוסייה: ניטור בזמן אמת של תגובות הסלולר על גירוי אופטי על-ידי PMT

  1. Trypsinize, לספור את המספרים של השולח ושל התאים מקלט בשיטות הרגילות. להכין 1-mL הנפח הכולל של ערבוב ההשעיה של 2.5 x 10 מקלט4 ו- 1.25 x 105 השולח תאים (היחס 1:5).
    הערה: 2:1, 1:1 או 1:2 יחסי שולח-מקלט גם לעבוד עם מספר בתא סכום של 1.5 x 105. 10
  2. צלחת מעורב בתאים כל טוב של לוחות 24-ובכן שחור עם תרבות בינוני המכיל 1 מ luciferin.
  3. לנתח את התאים על צלחת קורא עבור לוציפראז assay, וודא כי אותות הפלט אינם גבוהים מדי עבור מערכת הקלטה.
    הערה: אם אותות הפלט גבוה יותר מאשר פוטון6 עונה 1 פרק 10 ספירות/s, הם עשויים להיות רווי. במקרה זה, להפחית את ריכוז luciferin לערכים אופטימליים כך אותות הפלט הם נמוכים יותר עונה 1 פרק 106 פוטון ספירות/s....
  4. הגדר את הצלחת על מערכת הקלטה ולאחר הפעלת תוכנית הקלטה (איור 1D). לדוגמה, להתחיל תאורה אור-18 h לאחר הגדרת את ההקלטה.
    הערה: זמני סינון, כגון אותות detrending עם נע בממוצע ו- Savitzky-Golay סינון, שימושיים עבור ויזואליזציה של צורות גל לשיא גילויים.

4. דינמי השולח-מקלט Assay ברמה תא בודד: בזמן אמת הדמיה של תא בודד תגובות תחת השליטה של ההפרעות Optogenetic

  1. צלחת 0.5 x 105 מקלט, 2.5 x 10 תאים השולח5 על 27 מ מקוטר-זכוכית-בסיס 35 מ מ קוטר מנות. להבטיח את יחס ערבוב ומספר בתא סכום (צפיפות תא) מותאמים בצורה נכונה.
  2. יום אחד לאחר ציפוי, להחליף בינוני עם 2 מ"ל של המדיום הקלטה (פנול אדום בינוני DMEM חופשית בתוספת 5% FBS, סטרפטומיצין פניצילין, luciferin 1 מ מ), ולהגדיר את צלחת זכוכית בסיס על המיקרוסקופ. במידת הצורך, לשטוף את הלכלוך של תאים מתים עם PBS (-).
    הערה: עדיף לעשות צעד זה במצב כהה.
  3. להגדיר במיקרוסקופ הפוכה מצויד עם חדר סביבתי-CO 37 ° C ו-5%2.
  4. הגדר את מצלמת CCD מקורר. ודא כי הטמפרטורה של חיישן מצלמות מקורר לערך היעד (בדרך כלל,-90 ° C).
  5. להגדיר את הפרמטרים של "Multi-Dimensional Timelapse" חלון בתוכנה רכישה אוטומטית כדי ללכוד תמונות עם מרווחי 5 דקות ולא יותר 288 פעמים (הקלטה לילה אחד או יותר).
    1. תפתח חלון "Multi-Dimensional Timelapse", בחר ערוץ הפריה חוץ גופית ומצב read-out 50 קילוהרץ לאט מתוך התפריט הנפתח ולהגדיר 4 x 4 binning עם 4-מין חשיפה. ודא כי מצב read-out מוגדר למצב 50 קילוהרץ איטי, אשר חיוני להפחתת רעשים read-out לגילוי בחולשה פולטות אור זוהרים.
    2. תפתח חלון "Multi-Dimensional Timelapse", בחר ערוצי פלורסצנטיות, מצב read-out במהירות של 1 מגה-הרץ מתוך התפריט הנפתח ולהגדיר 2 x 2 binning עם 400 ms חשיפה. ודא כי מצב read-out מוגדר למצב 1 מגה-הרץ במהירות כדי להפחית את משך הזמן הנדרש עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
    3. להתחיל בצילום מואץ הקלטה על-ידי לחיצה על לחצן "רכוש".
  6. לחלץ תא בודד עקבות של הפריה חוץ גופית ערוצי סרטים בצילום מואץ על-ידי תוכנת ניתוח התמונה, כדלקמן. ראשית, להפוך תמונות בערימה הפריה חוץ גופית, זריחה על-ידי ייבוא נתוני התמונה לתוכנה ניתוח התמונה. לתמונות הפריה חוץ גופית, הסרת פיקסלים חם נגזר קרניים קוסמיות על-ידי השוואת עוצמות הפיקסלים בתמונות חנותם סמוכים, החלפת ערכי הפיקסלים לממוצע הטמפורלי של המסגרות הקודמים (מיושם על ידי "SpikeNoise מסנן"), להחיל תמונות מעובדים אלה מסנן החלקת במרחב, להחסיר רקע ערכי פיקסלים של out-field נופים מכל מסגרת. ואז להחליט "אזור בעל עניין" (ROI) עבור כל תא בתמונת פלורסנט בכל נקודה בזמן, להחיל את רועי לתמונות זורח, למדוד את עוצמת כל רועי מאיר עיניים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שינינו את בכוכב מערכת11,12, המאפשרת ביטוי גנים צילום-induced בתאי יונקים, במחקר של מתנדים גנטי עם 2 - 3 h תקופתיות. מערכת זו מורכבת משני חלקים: את hGAVPO activator תעתיק צילום-inducible ואת קלטת UAS-יזם כדי לכונן שעתוק של גנים שרירותי של עניין. כדי להאיץ את קינטיק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

. הראנו שיטה לשליטה dynamics ביטוי גנים עם תקופתיות של 2-3 h... סרגל הזמן הזה הוא הרבה יותר קצר מאשר אלה במערכות אחרות המקובלת, כולל מערכת ט'-על מערכת בכוכב המקורי. פרמטרים מרכזיים כדי להגיע בזמן ultradian-המאזניים הם מחצית החיים של צילום-induced מוצרים מולקולרית, mRNAs חלבונים. פרמטרים אלה קינטי עשוי תלויים ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמך על ידי JST, פרסטו (מלאכותית), ליבת המחקר אבולוציונית למדע וטכנולוגיה (JPMJCR12W2 (ר. ק)) מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן 26119708 (אינטליגנציה מלאכותית) ו- 16 H 06480 (ר. ק)), מדעי מחקר (א) (יפן החברה לקידום המדע (JSPS) 24240049 (ר. ק)), מדענים צעירים (א) (JSPS H 15 05326 (אינטליגנציה מלאכותית)), ואת מענק של הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים "זריחה חי הדמיה"של MEXT, יפן, פלטפורמה עבור גישות דינאמיות למערכת חיים מ MEXT, יפן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
CameraAndoriKon M-934
MicroscopeOlympusIX-81 ZDC
PMT deviceChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Blue LED illuminatorOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicillin-streptomycinNacalai26253-84
Fetal bovine serumSigma172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )Hi-tech303012
D-Luciferin Potassium SaltNacalai20028-24
Light meterLI-COR BiosciencesLI-250A
anti-HA-Peroxidase antibodyRocheclone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibodyWakoclone 2F3

References

  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
  3. Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
  4. Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
  5. Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
  6. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
  7. Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
  8. Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141(2012).
  9. Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
  10. Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
  11. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
  12. Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  14. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3(2010).
  15. Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  16. Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133optogeneticGAVPO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved