Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Abstract

Cellule devono rispondere correttamente a cambiare temporaneamente gli ambienti, che sono influenzati da vari fattori da cellule circostanti. Il via di segnalazione di Notch è uno di tali macchinari molecolari essenziali per le comunicazioni cellula--cellula, che svolge ruoli chiave nello sviluppo normale degli embrioni. Questa via comporta un trasferimento di cellula--cellula di informazioni oscillatorie con Oscillazioni ultradiane, ma nonostante i progressi nelle tecniche di biologia molecolare, è stato impegnativo per delucidare l'impatto delle interazioni multicellulari sul gene oscillatoria dinamica. Qui, presentiamo un protocollo che consente la gestione di optogenetica e monitoraggio in tempo reale di espressione genica in modo temporale preciso. Questo metodo con successo ha rivelato che intracellulari e intercellulari ingressi periodici della tacca di segnalazione entrain oscillazioni intrinseche di frequenza di sintonizzazione e fase spostando la risoluzione di singole cellule. Questo metodo è applicabile per l'analisi delle caratteristiche dinamiche delle varie vie di segnalazione, fornendo una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Introduzione

Comunicazione della cellula--cellula giocano un ruolo critico nel patterning embrionale in processi di sviluppo. In embrioni vertebrati, le strutture metamerica chiamate somiti si formano lungo l'asse antero-posteriore corpo con una precisione temporale precisa sotto il controllo di un orologio di tempo di mantenimento, chiamato la segmentazione dell'orologio¹. Durante questo processo, un gruppo di cellule del mesoderma presomitic (PSM) periodicamente vengono convertiti in somiti in modo sincrono. Questo processo coinvolge l'espressione genica di oscillatori sincronizzati e cellule PSM che oscillano in fase formano dei metameri stessi. Il periodo dell'espressione genica oscillatorio è circa 2-3 h in topi e a circa 30 min in zebrafish. Quando dissociate, PSM cellule perdono la sincronia^2,3, ma quando sono ri-aggregati, possono auto-organizzarsi e recuperare la popolazione sincronia⁴, suggerendo che l'accoppiamento cellula-cellula è una chiave per il sincronizzato oscillazioni.

Gli sforzi profusi hanno rivelato che le molecole di segnalazione nella via del Delta-Notch strettamente collegate alle oscillazioni sincronizzate dei geni orologio segmentazione. O inibitori farmacologici o mutazioni genetiche della tacca di segnalazione desincronizzarsi la popolazione degli oscillatori. In zebrafish, mutanti della tacca di segnalazione componenti, quali DeltaC, DeltaD e Notch1a, visualizzano asincrona oscillazioni^5,6. Negli embrioni di pulcino o il mouse, non solo il ligando Notch Delta-like1 (Dll1), ma anche il tacca modulatore Lunatic fringe (Lfng) è richiesto per oscillazioni sincronizzata^7,8,9. Tuttavia, è stato difficile testare la funzionalità di tali molecole per il trasferimento di informazioni dinamiche da cella a cella, perché risoluzioni temporali di perturbazione convenzionale della dinamica di regolazione genica non erano sufficienti per indagare il processi di tempistiche di 2 – 3 h (ultradiane).

Recentemente abbiamo sviluppato un metodo integrato per controllare e monitorare pattern di espressione genica in cellule di mammifero¹⁰. Questa tecnologia consente ad induzione di impulsi di espressione genica di illuminazione a luce periodici su scale di tempo ultradiane. Questo protocollo rappresenta i metodi per stabilire linee di cellule fotosensibili e osservare le risposte dinamiche delle cellule reporter di luminescenza di cellule vive di monitoraggio nei contesti delle comunicazioni cellula--cellula. Questo metodo è applicabile per l'analisi di molte altre vie di segnalazione.

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Protocollo

1. generazione di linee cellulari stabili dal sistema Tol2

1. Transfect vettori plasmidici (Figura 1A) di moduli basati su Tol2 optogenetica insieme con il vettore di espressione transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in cellule C2C12. In tutte le fasi, le cellule di cultura con medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina-streptomicina a 37 ° C (tabella 1), in presenza di 5% CO₂, altrimenti indicato.
   1. Contare tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 5x10⁴ C2C12 cellule per pozzetto in un piatto di 12-pozzetti un giorno prima di transfezione.
   2. Co-transfect 0,375 μg di vettori basati su Tol2 optogenetica (pAI177 o pAI218), 0,125 μg di un vettore di selezione della droga (pAI170) e 0,5 μg di pCAGGS-mT2TP vettoriale utilizzando lipofezione reagente.
   3. Tripsinizzano cellule trasfettate e impiattatelo in piastre di coltura di 100 mm, un giorno dopo la trasfezione.
   4. Cambio di coltura per cellule trasfettate per cultura supplementato con igromicina 100 mg/mL.
   5. Cellule di coltura per 3 giorni eliminare le cellule non trasfettate. Si noti che il cambiamento medio non è necessaria.
2. Tripsinizzano cellule trasfettate e purificare una popolazione di cellule che esprimono le proteine fluorescenti per la selezione. Per le cellule ricevitore pAI177, impostata il cancello ordinamento canale verde-PE per la purificazione della popolazione delle cellule mCherry-positivi. Per le cellule fotosensibili mittente pAI218, impostata il cancello ordinamento canale APC per la purificazione della popolazione delle cellule iRFP713-positivi.
3. (opzionale) Stabilire una popolazione clonale delle cellule con i metodi standard, ad esempio diluizione limitato o singolo-cella ordinamento di FACS.

2. valutazione della sensibilità della foto di cellule ingegnerizzate a livello della popolazione

Nota: Questa parte descrive un protocollo per controllare la dinamica induzione delle proteine di ligando Dll1 su illuminazione luce blu di saggi biochimici, quali qPCR e Western blotting.

1. Impostare due tipi di incubatori con o senza fonti di luce per una condizione indotta dalla luce o una condizione di buio, rispettivamente. Set-up luce-intensità di un blu-trans-illuminatore LED, come illustrato nella Figura 1B, utilizzando un misuratore di luce. Gli orari del programma e la durata dell'illuminazione dal caricamento di uno script di controllo a un micro-controller monoscheda che consente orari programmabili per l'illuminazione (Figura 1).
2. Conta cellule tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 1.0 x 10⁵ mittente fotosensibile cellule portando pAI218 e pAI170 su piastre di coltura in plastica di diametro 35 mm (più di 12 piatti per condizione di luce e 1 piatto per condizione di buio) e impostare i piatti separare gli incubatori per condizioni di buio/luce. Dopo aver impostato piatti, tenere porte di incubatrici chiuse fino al collezionismo lisati cellulari.
3. Giorni di un anno e mezzo dopo il placcaggio, avviare illuminazione luce (cellule dovrebbero essere più di 80% confluenti). Non esporre le cellule alla luce per evitare indesiderata foto-stimolazione.
   Nota: Gli orari per l'illuminazione dipende dallo scopo di esperimenti. Si noti che una condizione di illuminazione costante (ad es. 1-min intervalli di durata e 10 min con 40 µmol/m2/s-intensità luce) è sufficiente per un semplice controllo della foto-induzione e quel forte illuminazione luce è dannoso per le cellule. Così, di assicurarsi che siano selezionati i parametri innocui per l'illuminazione.
4. Circa 2 giorni dopo il placcaggio, preparare delle cellule-lisato con intervalli di 30 min. Spostare assaggiare piatti dalle incubatrici sul ghiaccio e iniziare a preparare i lisati cellulari per ulteriori analisi.

3. dinamica mittente-destinatario test a livello di popolazione: monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari dopo stimolazione ottica di PMT

1. Tripsinizzano e contare i numeri del mittente e le cellule del ricevitore con metodi standard. Preparare un volume totale di 1 mL di sospensione di 2,5 x 1,25 x 10 e 10⁴ ricevitore di miscelazione cellule mittente⁵ (rapporto 1:5).
   Nota: 2:1, 1:1, o rapporti di 1:2 mittente-destinatario anche lavorano con un numero totale di cellule di 1.5 x 10⁵. ¹⁰
2. Piatto miscelati di cellule in tutti i pozzetti di piastre nere 24 pozzetti con mezzo di coltura contenente luciferina di 1 mM.
3. Analizzare le cellule il lettore di piastre per l'analisi di luciferase e confermare che i segnali in uscita non sono troppo elevati per il sistema di registrazione.
   Nota: Se segnali di uscita sono superiori a 1 x 10⁶ fotone conteggi/s, essi possono essere saturo. In tal caso, ridurre la concentrazione di luciferina a valori ottimali in modo che segnali di uscita sono inferiori a 1 x 10⁶ fotone conteggi/s.
4. Mettere la piastra sul sistema di registrazione e avviare un programma di registrazione (Figura 1). Ad esempio, avviare illuminazione luce a 18 h dopo aver impostato la registrazione.
   Nota: Filtro temporale, quali i segnali di detrending con lo spostamento in media e Savitzky-Golay filtraggio, sono utile per la visualizzazione delle forme d'onda e rilevamenti di picco.

4. dinamica mittente-destinatario l'analisi a livello di singola cellula: in tempo reale di Imaging delle risposte di singola cellula sotto il controllo di optogenetica perturbazione

1. Ricevitore⁵ piastra di 0,5 x 10 e 2,5 x 10 celle di mittente di⁵ piatti di diametro 35 mm 27-mm-diametro-vetro-base. Garantire che rapporti di miscelazione e un numero totale di cellule (una densità cellulare) siano regolati correttamente.
2. Un giorno dopo il placcaggio, cambio mezzo con 2 mL di supporto di registrazione (rosso fenolo libero DMEM supplementato con 5% FBS, penicillina-streptomicina e luciferina di 1 mM) e impostare il piatto di vetro-base sul microscopio. Se necessario, lavare i detriti di cellule morte con PBS (-).
   Nota: È preferibile fare questo passaggio in una condizione di buio.
3. Impostare un microscopio invertito, dotato di una camera climatica a 37 ° C e 5% CO₂.
4. Impostare una fotocamera CCD raffreddata. Accertarsi che la temperatura del sensore CCD è raffreddata al valore di destinazione (in genere,-90 ° C).
5. Impostare i parametri per "Multi-dimensional Timelapse" finestra nel software di acquisizione automatica di catturare immagini con intervalli di 5 min e più di 288 volte (più di una registrazione durante la notte).
   1. Aprire "Multi-dimensional Timelapse" finestra, selezionare un canale di luminescenza e una modalità di lettura lenta 50 kHz dal menu pull-down e impostare 4x4 binning con esposizione di 4 min. Accertarsi che la modalità di lettura è impostata la modalità lenta 50 kHz, che è fondamentale per ridurre i rumori di lettura per rilevare debolmente che emettono luce bioluminescente.
   2. Aprire "Multi-dimensional Timelapse" finestra, selezionare canali di fluorescenza e una modalità di lettura di 1 MHz veloce dal menu pull-down e impostare 2 x 2 binning con esposizione di 400 ms. Assicurarsi che la modalità di lettura è impostata la modalità veloce di 1 MHz per ridurre il tempo necessario per l'imaging di fluorescenza.
   3. Start Time-lapse di registrazione cliccando su "Acquire".
6. Estrarre tracce unicellulare di canali di luminescenza da filmati time-lapse di software di analisi di immagine, come segue. Prima di tutto la luminescenza e fluorescenza immagini dello stack importando i dati di immagine al software di analisi di immagine. Per le immagini di luminescenza, rimuovere pixel caldi derivata da raggi cosmici confrontando le intensità dei pixel nelle immagini temporaneamente adiacente, sostituendo i valori di pixel per la media temporale dei fotogrammi precedenti e successivi (implementato come filtro"SpikeNoise"), applicare queste immagini elaborate a un filtro spazialmente e sottrarre i valori dei pixel di sfondo di giocatori visite da ogni fotogramma. Quindi, stabilire una "regione di interesse" (ROI) per ogni cella su un'immagine fluorescente in ogni momento, applicare il ROI immagini luminescenti e misurare l'intensità luminescente di ogni ROI.

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Risultati

Abbiamo adattato il LightOn sistema^11,12, che consente l'espressione genica di foto-indotta in cellule di mammifero, allo studio della genetiche oscillatori con periodicità di 2 - 3 h. Questo sistema è composto da due parti: il hGAVPO foto-inducible attivatore trascrizionale e una cassetta di UAS-promotore alla trascrizione di unità di arbitrari geni di interesse. Per accelerare la cinetica pulsatile di espressione genica indot...

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Discussione

Abbiamo mostrato un metodo per controllare le dinamiche di espressione genica con una periodicità di h 2 o 3. Questa scala temporale è molto più breve rispetto a quelle di altri sistemi convenzionali, tra cui il sistema Tet-On e il sistema LightOn originale. Parametri chiave per raggiungere le scale temporali ultradiane sono emivite di prodotti molecolari indotti da foto, mRNA e proteine. Questi parametri cinetici possono dipendere di specie e tipi di cellule. Per la sintonizzazione la cinetica, sostituendo sequenze H...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson and Company	FACSAriaII SORP
Camera	Andor	iKon M-934
Microscope	Olympus	IX-81 ZDC
PMT device	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Blue LED illuminator	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Penicillin-streptomycin	Nacalai	26253-84
Fetal bovine serum	Sigma	172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )	Hi-tech	303012
D-Luciferin Potassium Salt	Nacalai	20028-24
Light meter	LI-COR Biosciences	LI-250A
anti-HA-Peroxidase antibody	Roche	clone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibody	Wako	clone 2F3