Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.

Resumo

Células devem responder corretamente a temporalmente mudar ambientes, que são influenciadas por diversos fatores do entorno de células. O via de sinalização Notch é um dos tais máquinas moleculares essenciais para comunicação célula a célula, que tem um papel chave no desenvolvimento normal de embriões. Este caminho envolve uma transferência de célula para célula de informação oscilatória com ritmos ultradian, mas apesar do progresso em técnicas de biologia molecular, tem sido desafiador para elucidar o impacto das interações multicelulares no gene oscilatório dinâmica. Aqui, apresentamos um protocolo que permite o controle de optogenetic e monitoramento ao vivo de padrões de expressão de gene de forma temporal precisa. Esse método com êxito revelou que o intracelulares e intercelulares entradas periódicas de sinalização Notch entrain oscilações intrínsecas por ajuste de frequência e fase de deslocamento para a resolução de célula única. Esta abordagem é aplicável para a análise das características dinâmicas de várias vias de sinalização, fornecendo uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.

Introdução

Comunicação célula a célula desempenham um papel crítico na padronização embrionária em processos de desenvolvimento. Em embriões de vertebrados, as estruturas metameric chamadas somitas são formadas ao longo do eixo ântero-posterior corpo, com uma precisão temporal precisa sob o controle de um relógio de tempo de manutenção, o relógio de segmentação¹. Durante este processo, um grupo de células mesoderm presomitic (PSM) periodicamente são convertidos em somitas de forma síncrona. Este processo envolve a expressão de gene oscilatório sincronizada e células PSM que oscilam em fase formam as mesmas somitas. O período da expressão gene oscilatório é cerca de 2 a 3 h em camundongos e cerca de 30 min no zebrafish. Quando dissociado, células PSM perdem a sincronia de^2,3, mas quando eles são re-agregados, podem se auto-organizar e recuperar a população sincronia⁴, sugerindo que o acoplamento de celular é uma chave para o sincronizado oscilações.

Extensos esforços revelaram que moléculas sinalizadoras na via Notch-Delta estão firmemente conectadas a oscilações sincronizadas dos genes do tempo de segmentação. Ou inibidores farmacológicos ou mutações genéticas de sinalização Notch desynchronize a população dos osciladores. No zebrafish, mutantes de entalhe sinalização componentes, tais como DeltaC, DeltaD e Notch1a, exibem oscilações assíncronas^5,6. Em embriões de pintinho ou mouse, não só o ligante de entalhe Delta-like1 (Dll1), mas também o entalhe modulador Lunatic fringe (Lfng) é necessária para oscilações sincronizadas^7,8,9. No entanto, tem sido difícil testar a capacidade funcional de tais moléculas para transferência de informação dinâmica de uma célula para outra, porque resoluções temporais de perturbação convencional da dinâmica de regulamento do gene não foram suficientes para investigar o processos de escalas de tempo de 2 – 3 h (ritmos ultradian).

Recentemente desenvolvemos um método integrado para controlar e monitorar padrões de expressão de gene em células de mamíferos,¹⁰. Esta tecnologia permite que a indução de pulsos de expressão do gene por iluminação periódica em escalas de tempo ultradian. Este protocolo representa os métodos para estabelecer linhas de células fotossensíveis e observar respostas dinâmicas de células repórter por viver-pilha luminescência monitoramento nos contextos de comunicação célula a célula. Este método é aplicável para a análise de muitas outras vias de sinalização.

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Protocolo

1. geração de linhas de célula estável pelo sistema Tol2

1. Transfect vetores do plasmídeo (figura 1A) de módulos baseados em Tol2 optogenetic juntamente com o vetor de expressão transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) em células de C2C12. Em todas as etapas, as células de cultura com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina a 37 ° C (tabela 1), na presença de 5% CO₂, caso contrário indicado.
   1. Conte células trypsinized com um contador de célula e placa de 5 x 10⁴ C2C12 células por poço em uma placa de 12 um dia antes do transfection.
   2. Co transfect 0,375 μg de vetores baseados em Tol2 optogenetic (pAI177 ou pAI218), 0.125 μg de um vetor de seleção de drogas (pAI170) e 0.5 μg de vetor de pCAGGS-mT2TP usando o reagente de lipofection.
   3. Trypsinize células transfectadas e placa-los em pratos de cultura de 100 mm, um dia depois do transfection.
   4. Troca de meio de cultura para células transfectadas com meio de cultura suplementado com 100 mg/mL hptII.
   5. Células de cultura por 3 dias para eliminar as células transfectadas un. Note-se que a mudança média não é necessária.
2. Trypsinize células transfectadas e purificar a uma população de células expressando proteínas fluorescentes para a seleção. Para as células do receptor carregando pAI177, defina o classificação portão ao canal verde-PE para a purificação da população celular mCherry-positivo. Para as células foto-sensíveis ao remetente carregando pAI218, conjunto o portão classificação para canal APC para a purificação da população celular iRFP713-positivo.
3. (opcional) Estabelece uma população clonal de célula por métodos padrão, tais como diluição limitada ou célula única classificação por FACS.

2. avaliação de foto-sensibilidade das células projetadas a nível da população

Nota: Esta parte descreve um protocolo para verificar a dinâmica da indução de proteínas de ligante Dll1 com luz azul iluminação pelos ensaios bioquímicos, tais como qPCR e mancha ocidental.

1. Configurar dois tipos de incubadoras com ou sem fontes de luz para uma condição induzida por luz ou uma condição de escura, respectivamente. Set-up-intensidade de luz de um LED azul trans-iluminador, como mostrado na figura 1B, usando um medidor de luz. Horários do programa e a duração da iluminação por carregar um script de controle para um microcontrolador de placa única que permite horários programáveis para iluminação (Figura 1).
2. Contar células trypsinized com um contador de célula e placa de 1,0 x 10⁵ remetente foto-sensível células carregando pAI218 e pAI170 em pratos de plástico cultura de 35 mm de diâmetro (mais de 12 pratos para condição de luz e 1 prato para condição de escuro) e definir os pratos separar incubadoras para condições de claro/escuro. Após a criação de pratos, manter portas das incubadoras fechadas até coletando lisados celulares.
3. Dias de um ano e meio depois de chapeamento, começar a iluminação (células espera-se que mais de 80% confluentes). Não exponha as células à luz para evitar indesejáveis de foto-estimulação.
   Nota: Horários para iluminação depende da finalidade de experimentos. Observe que uma condição de iluminação sustentado (ex. 1-min duração e 10 min de intervalo com 40 µmol/m²/s-intensidade de luz) é suficiente para a verificação simples do foto-indução e essa iluminação forte é prejudicial para as células. Assim, certifique-se que inofensivo parâmetros para iluminação são selecionados.
4. Cerca de 2 dias após o chapeamento, prepare célula-lisado com intervalos de 30 minutos. Se provar pratos de incubadoras no gelo e começar a preparar lisados celulares para posterior análise.

3. dinâmica do remetente-receptor ensaio a nível de população: monitoramento em tempo real de respostas celulares após estimulação óptica por PGTO

1. Trypsinize e contar o número de remetente e as células do receptor com métodos padrão. Prepare um volume total de 1 mL da mistura a suspensão de 2.5 x 10⁴ receptor e 1,25 x 10⁵ células de remetente (proporção de 1:5).
   Nota: 2:1, 1:1, ou 1:2 rácios de remetente-receptor também trabalham com um número de celular total de 1,5 x 10⁵. ¹⁰
2. Prato misturada de células em cada poço de 24-poço pretos placas com meio de cultura contendo Luciferina de 1 mM.
3. Analisar as células no leitor de placas para ensaio de luciferase e confirmar que os sinais de saída não são demasiado elevados para o sistema de gravação.
   Nota: Se os sinais de saída são superiores a 1 x 10⁶ fóton contagens/s, eles podem ser saturados. Nesse caso, reduza a concentração de Luciferina de valores ótimos para que os sinais de saída são inferiores a 1 x 10⁶ fóton contagens/s.
4. Coloque a placa sobre o sistema de gravação e iniciar um programa de gravação (Figura 1). Por exemplo, inicie a iluminação às 18 h, depois de definir a gravação.
   Nota: Filtragem Temporal, tais como sinais detrending com móveis em média e Savitzky-Golay, filtragem, são úteis para visualização das formas de onda e detecções de pico.

4. ensaio de remetente-receptor dinâmico a nível de célula única: em tempo real imagens de célula única respostas sob o controle de Optogenetic das perturbações

1. Placa de 0,5 x 10⁵ receptor e 2,5 x 10⁵ células de remetente para pratos de diâmetro de 27 mm-diâmetro-vidro-base de 35mm. Certifique-se de que proporções de mistura e um número de celular total (uma densidade de célula) são ajustados corretamente.
2. Um dia depois de chapeamento, trocar o meio com 2 mL de meio de gravação (vermelho de fenol livre DMEM suplementado com 5% FBS, penicilina-estreptomicina e Luciferina de 1mm) e definir o prato de vidro-base no microscópio. Se necessário, lave os restos de células mortas com PBS (-).
   Nota: É preferível fazer esta etapa em uma condição de escura.
3. Configure um microscópio invertido equipado com uma câmara ambiental em 37 ° C e 5% de CO₂.
4. Colocar uma câmera CCD resfriada. Certifique-se de que a temperatura do sensor CCD é refrigerada para baixo para o valor de destino (normalmente, de-90 ° C).
5. Definir parâmetros para a janela de "Multi-Dimensional Timelapse" no software de aquisição automático para capturar imagens com intervalos de 5 min e mais de 288 vezes (mais do que uma gravação durante a noite).
   1. Abra a janela "Timelapse multi-dimensional", selecione um canal de luminescência e um modo de leitura de 50 kHz lento no menu suspenso e conjunto 4x4 binning com exposição de 4 min. Certifique-se de que o modo de leitura é definido como o modo lento de 50 kHz, que é fundamental para reduzir ruídos de leitura para detectar fracamente emitindo luz bioluminescente.
   2. Abra a janela "Timelapse multi-dimensional", selecione o menu pull-down canais de fluorescência e de um modo rápido de leitura de 1 MHz e defina 2x2 binning com exposição de 400 ms. Certifique-se de que o modo de leitura é definido como o modo rápido de 1 MHz para reduzir o tempo necessário para a imagem latente de fluorescência.
   3. Inicie o lapso de tempo de gravação clicando o botão "Adquirir".
6. Extrai monocelulares vestígios de canais de luminescência de lapso de tempo filmes pelo software de análise de imagem, como segue. Em primeiro lugar, fazer imagens de pilha de luminescência e fluorescência importando os dados de imagem de software de análise de imagem. Para imagens de luminescência, remover pixels quentes derivados de raios cósmicos, comparando as intensidades de pixels em imagens temporalmente adjacentes, substituindo os valores de pixel para a média temporal dos quadros anteriores e posteriores (implementado como "Filtro SpikeNoise"), aplicar estas imagens processadas a um filtro de suavização espacialmente e subtrair valores de pixel de fundo de out-field vistas de cada quadro. Em seguida, determinar uma "região de interesse" (ROI) para cada célula em uma imagem fluorescente em cada ponto de tempo, aplicar o ROI para imagens luminescentes, e medir a intensidade luminescente de cada ROI.

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Resultados

Adaptamos o LightOn sistema^11,12, que permite a expressão de foto-induzido do gene em células de mamíferos, para o estudo da genéticos osciladores com periodicidade de 2 a 3 h. Este sistema é composto por duas partes: a hGAVPO de foto-inducible ativador transcricional e uma gaveta de UAS-promotor para unidade da transcrição de genes arbitrários de interesse. Para acelerar a cinética pulsátil de expressão gênica induzid...

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Discussão

Nós mostramos um método para controlar a dinâmica de expressão de gene com uma periodicidade de 2 a 3 h. Esta escala de tempo é muito mais curta do que os de outros sistemas convencionais, incluindo o sistema de Tet-no e o sistema de luz original. Parâmetros-chave para alcançar os prazos ultradian são meias-vidas de foto-induzido moleculares produtos mRNAs e proteínas. Estes parâmetros cinéticos podem depender de espécies e tipos de células. Para afinar a cinética, substituir sequências Hes1 3' UTR com os ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson and Company	FACSAriaII SORP
Camera	Andor	iKon M-934
Microscope	Olympus	IX-81 ZDC
PMT device	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Blue LED illuminator	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Penicillin-streptomycin	Nacalai	26253-84
Fetal bovine serum	Sigma	172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )	Hi-tech	303012
D-Luciferin Potassium Salt	Nacalai	20028-24
Light meter	LI-COR Biosciences	LI-250A
anti-HA-Peroxidase antibody	Roche	clone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibody	Wako	clone 2F3