제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

요약

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

초록

셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.

서문

셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계¹시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony^2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony⁴, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.

광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC, DeltaD, Notch1a, 등의 돌연변이 비동기 진동^5,6표시 합니다. 여자 또는 마우스 배아에서 노치 ligand 델타-like1 (Dll1) 뿐만 아니라 노치 변조기 미치광이 프린지 (Lfng)는 동기화 된 진동^7,,89필요 합니다. 그러나 유전자 규칙 역학의 기존의 섭 동의 시간적 해상도 조사 하는 데 충분 하지 않았기 때문에, 그것은 셀을 동적 정보 전송에 대 한 이러한 분자의 기능 기능을 테스트 하기 어려운 되었습니다는 2-3 h (ultradian 리듬)의 계획의 프로세스.

최근 포유류 세포¹⁰제어 및 모니터 유전자 표현 패턴을 통합된 방법을 개발 했습니다. 이 기술은 ultradian 시간의 척도에 주기적인 빛 조명에 의해 유도를 유전자 식 펄스의 수 있습니다. 이 프로토콜은 감광 세포 선 확립 및 라이브 셀 발광 셀 통신의 문맥에서 모니터링 하 여 기자 세포의 동적 응답을 관찰 하는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 많은 다른 신호 통로의 분석에 적용 됩니다.

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프로토콜

1. Tol2 시스템으로 안정적인 셀 라인의 세대

1. C2C12 셀에 transposase (Tol2) 식 벡터 (pCAGGS-mT2TP)와 Tol2 기반의 optogenetic 모듈의 플라스 미드 벡터 (그림 1A)를 transfect. 모든 단계, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 37 ° C (표 1), 5% CO₂, 그렇지 않으면 표시의 존재에서 페니실린 스 보충 DMEM 매체와 문화 셀.
   1. 셀 카운터, trypsinized 세포와 당 12-잘 접시에 잘 플레이트 5 x 10⁴ C2C12 세포 transfection 전에 1 일 계산.
   2. Lipofection 시 약을 사용 하 여 optogenetic Tol2 기반 벡터 (pAI177 또는 pAI218), 약물 선택 벡터 (pAI170)의 0.125 μ g과 pCAGGS mT2TP 벡터의 0.5 μ g의 0.375 μ g를 transfect 공동.
   3. Transfected 세포, trypsinize 그리고 그들을 transfection 후 1 일 100mm 문화 요리에 접시.
   4. 문화 매체 100 mg/mL hygromycin 보충 transfected 세포에 대 한 문화 매체를 교환 합니다.
   5. 3 일 취소 transfected 세포를 제거 하기 위한 문화 셀. 참고 중간 변경 필요 하지 않습니다.
2. Trypsinize transfected 세포 고 정화 선택을 위해 형광 단백질을 표현 하는 세포의 인구. 수신기 세포 pAI177를 들고, 그린 PE 채널 mCherry-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다. 사진에 민감한 보낸 셀 pAI218 운반, 송출 채널 iRFP713-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다.
3. (선택 사항) 표준 메서드를 제한 희석 또는 단일 셀 FACS에 의해 정렬 하 여 클론 세포 인구를 구축.

2. 사진-감도 인구 수준에서 설계 된 셀의 평가

참고:이 부분에서는 생 화 확 적인 분석 실험, 정량 등 서양 blotting에 의해 블루 빛 조명에 따라 Dll1 ligand 단백질의 동적 유도 확인 하려면 프로토콜을 설명 합니다.

1. 각각 두 가지 유형의 광원 없이 incubators 빛 유도 조건 또는 어두운 상태에 대 한 설정. 설치는 파란 LED 트랜스-조명 기, 그림 1B와 같이 노출 계를 사용 하 여의 빛 강도. 프로그램 타이밍 및 조명 (그림 1C)에 대 한 프로그래밍 가능한 일정 수를 단일 보드 마이크로-컨트롤러 제어 스크립트를 로드 하 여 빛 조명 기간
2. 셀 카운터 trypsinized 셀과 판 1.0 x 10⁵ 사진-민감한 보낸 셀 pAI218과 pAI170 35 m m 직경 플라스틱 문화 요리 (빛 조건에 대 한 이상 12 요리와 어두운 조건에 대 한 1 접시)에 고 요리를 설정 어둠/빛의 조건에 대 한 incubators 구분 합니다. 요리를 설정한 후 세포 lysates 수집까지 산부인과의 문을 유지.
3. 도금, 후 하나 30 일 시작 빛 조명 (셀 80% 이상이 될 것으로 예상 된다 confluent). 셀을 바람직하지 않은 사진-자극을 피하기 위해 빛을 노출 하지 마십시오.
   참고: 일정 조명에 대 한 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 지속적인된 조명 조건 (예. 1-분 기간 및 10 분 간격으로 40 µ / m²/s 빛 강도) 사진-유도, 그리고 그 강한 빛 조명에 대 한 간단한 검사는 셀에 대 한 충분 한가. 따라서, 조명에 대 한 무해 매개 변수 선택 되어 있는지 확인 합니다.
4. 도금, 후에 2 일 약 30 분 간격으로 세포 lysate 준비. 얼음, 그리고 세포 lysates 추가 분석을 위해 준비 시작을 인큐베이터에서 샘플 요리를 이동 합니다.

3. 인구 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: PMT에 의해 광 자극에 세포질 응답의 실시간 모니터링

1. Trypsinize 및 발신자와 수신기 셀의 숫자 표준 방법. 혼합 10⁴ 수신기와 1.25 x 10 x 2.5의⁵ 보낸 셀 (1:5 비율)의 1 mL 전체 볼륨을 준비 합니다.
   참고: 2:1, 1:1 또는 1:2 보낸 사람 수신기 비율 또한 작동 1.5 x 10의 전체 휴대폰 번호⁵. ¹⁰
2. 플레이트 1 m m의 소를 포함 하는 문화 매체와 셀에 24-잘 블랙 플레이트의 각 잘 혼합.
3. 플레이트 리더 luciferase 분석 결과 대 한 셀을 분석 하 고 출력 신호 기록 시스템에 대 한 너무 높은 되는지 확인.
   참고: 출력 신호 1 x 10⁶ 광자 수/s 보다 더 높은 경우에, 그들은 수 수 포화. 이 경우, 출력 신호는 1 x 10⁶ 광자 수/s 보다 낮은 최적의 값으로 소의 농도 줄일.
4. 기록 시스템에 접시를 설정 하 고 녹음 프로그램 (그림 1D) 시작. 예를 들어 녹음 후 18 h에서 빛 조명을 시작 합니다.
   참고: 임시 필터링와 같은 이동 평균 및 Savitzky Golay 필터링, 신호 트렌딩 웨이브 폼의 시각화를 위한 유용 피크 탐지.

4. 단일 셀 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: 실시간 Optogenetic 섭 동 통제 단일 세포 응답의 이미징

1. 플레이트 0.5 x 10⁵ 수신기 그리고 2.5 x 27 mm 직경 유리 베이스 35 m m 직경 요리에 10⁵ 보낸 사람 세포. 그 혼합 비율 및 총 세포 수 (셀 밀도) 올바르게 조정 됩니다 확인 하십시오.
2. 도금, 후에 1 일 교환 기록 매체의 2 mL와 매체 (페 놀 레드 무료 DMEM 매체 보충 5 %FBS, 페니실린-스와 1mm 소), 현미경에 유리-기본 요리를 설정. 필요한 경우, PBS (-)와 죽은 세포의 파편 세척 한다.
   참고: 그것은 어두운 상태에서이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.
3. 37 ° C, 5% CO₂환경 챔버를 장착 한 거꾸로 한 현미경을 설정 합니다.
4. 냉각된 CCD 카메라를 설정 합니다. 대상 값 (일반적으로-90 ° C) CCD 센서의 온도 아래로 냉각은 확인 하십시오.
5. 5 분 간격으로 이미지와 보다 더 288를 자동 수집 소프트웨어에 "다차원 Timelapse" 창에 대 한 매개 변수 설정 (하나 이상의 야간 녹화) 시간.
   1. "다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 발광 채널 및 느린 50 kHz 읽기 모드를 선택 하 고 4 × 4 4 민 노출 binning 설정. 읽기 모드 읽어 소리를 약하게 발광 발광 빛을 감지를 줄이기 위한 중요 한 느린 50 kHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 하십시오.
   2. "다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 형광 채널 및 고속 1mhz 읽기 모드를 선택 하 고 2 x 2 400 ms 노출 binning 설정. 읽기 모드 형광 영상에 필요한 시간을 줄이기 위해 빠른 1 MHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 합니다.
   3. 시간 경과 "취득" 버튼을 클릭 하 여 녹음 시작 합니다.
6. 다음과 같이 이미지 분석 소프트웨어, 시간 경과 영화에서 발광 채널의 단일 셀 자취를 추출 합니다. 먼저, 이미지 분석 소프트웨어를 이미지 데이터를 가져와서 발광 및 형광 스택 이미지를 확인 합니다. 발광 이미지에 대 한 ("SpikeNoise 필터"로 구현), 이전 및 다음 프레임의 시간 평균을 픽셀 값으로 바꿔 일시적으로 인접 한 이미지에서 픽셀의 농도 비교 하 여 우주선에서 파생 된 핫 픽셀 제거 이러한 처리 이미지 공간 스무 딩 필터를 적용 하 고 각 프레임에서 out-field 뷰의 배경 픽셀 값을 뺍니다. 그런 다음, "관심 영역"을 결정 (투자 수익) 각 시간 지점에서 형광 이미지에 각 셀에 대 한 투자 수익 발광 이미지를 적용 하 고 각 투자 수익의 발광 강도 측정.

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결과

우리는 LightOn 시스템^11,12, 2-3 h 주기와 유전 발진기의 연구에 포유류 세포에 있는 사진 유도 유전자 발현을 가능 하 게 적응. 이 시스템은 두 부분: 사진 유도할 수 있는 transcriptional 활성 제 hGAVPO 및 드라이브의 임의 유전자의 전사를 UAS 발기인 카세트. 사진 유도 유전자 발현의 타악기 활동을 가속, UAS 발기인 카세트에 polyA 시퀀스...

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토론

우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3' UTR 대체 시퀀스 및 대상 단?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson and Company	FACSAriaII SORP
Camera	Andor	iKon M-934
Microscope	Olympus	IX-81 ZDC
PMT device	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Blue LED illuminator	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Penicillin-streptomycin	Nacalai	26253-84
Fetal bovine serum	Sigma	172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate )	Hi-tech	303012
D-Luciferin Potassium Salt	Nacalai	20028-24
Light meter	LI-COR Biosciences	LI-250A
anti-HA-Peroxidase antibody	Roche	clone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibody	Wako	clone 2F3