Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا للتحقيق في المؤشرات الحيوية التعبير مرناً للخلايا المستمدة من السمحاق (PDCs) الناجم عن فيتامين ج (فيتامين ج) و 1, 25-ديهيدروكسي فيتامين د [1,25-(OH)2د3]. وبالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم قدرة PDCs تفرق في أوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس و adipocytes.

Abstract

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) الموجودة في مجموعة متنوعة من الأنسجة، ويمكن أن تكون متباينة في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا الاوستيوبلاستس. بين مصادر MSCs الأسنان، هو السمحاق أنسجة يسهل الوصول إليها، والتي تم تحديدها لاحتواء MSCs في طبقة كامبيوم. إلا أن هذا المصدر لم حتى الآن على نطاق واسع تدرس.

فيتامين د3 و 1,25-(OH)2د3 ثبت لتحفيز في المختبر التمايز من MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل فيتامين ج الكولاجين تشكيل والعظام نمو الخلايا. ومع ذلك، حقق أي دراسة بعد آثار فيتامين (د)3 وفيتامين ج على MSCs.

نقدم هنا، وسيلة لعزل MSCs من السمحاق السنخية البشرية، والنظر في الفرضية القائلة بأن 1,25-(OH)2د3 قد بذل تأثير أوستيويندوكتيفي على هذه الخلايا. ونحن أيضا التحقيق في وجود MSCs في السمحاق السنخية البشرية وتقييم التصاق الخلايا الجذعية وانتشار. لتقييم قدرة فيتامين ج (كعنصر تحكم) وتركيزات مختلفة من 1,25-(OH)2د3 (10−10و 10−9، 10−8و 10−7 م) لتغيير مفتاح المؤشرات الحيوية مرناً في العظام التعبير مرناً MSCs معزولة عن الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)، سيالوبروتين (BSP) وعامل الربط الأساسية ألفا-1 (CBFA1)، الكولاجين-1 osteocalcin (OCN) يتم قياس استخدام الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (RT-PCR).

Introduction

على الرغم من أن العديد من التقنيات ذات الصلة قد وضعت في السنوات الأخيرة، العظام التعمير تظل محدودة بقيود متعددة، وتقدير مدى إعادة البناء الضرورية وكثيراً ما يستحيل. تكبير الأنسجة الثابت مطلوب لتحقيق الأهداف الجمالية والفنية على حد سواء بالإضافة إلى نسبة نجاح الطويل الأجل مواتية. وتشمل الأساليب المستخدمة عادة لمثل هذه الإجراءات تطعيم العظم الغازي و allogenic، إكسينوجرافتينج، وتطعيم العظم اللوبلاستيك. بين مختلف أنواع الفساد العظام، وترقيع العظام الغازي تعتبر الأكثر فعالية. ومع ذلك، كانت المانحة الموقع الاعتلال والشبهة الأوعية الدموية والأنسجة محدودية توافر1 العوائق الرئيسية لتطعيم العظم الغازي. وباﻹضافة إلى ذلك، ارتبطت ترقيع العظام allogenic وتكثيفها بانتقال المرض. وحاليا، ترقيع العظام الاصطناعية تستخدم على نطاق واسع لحل هذه المشاكل. ومع ذلك، مع افتقارها إلى الإمكانات أوستيوجينيك، النتائج السريرية قد تفاوتت تفاوتاً كبيرا. المواد، مثل السليلوز المرتبطة بتقلب حجم، والعدوى، والافتقار إلى القوة.

تكبير العظام باستخدام هندسة الأنسجة قد ولدت قدرا كبيرا من الاهتمام. في هذا الأسلوب، الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في البداية تستخدم لتعزيز التمايز osteoblast، التي يتم زرعها ثم إلى موقع فقدان العظام لتحقيق إصلاح العظام. ويطبق هذا الإجراء حاليا في العلاج بالخلايا. تحقيق إعادة إعمار العظام باستخراج كمية محدودة من الأنسجة أبسط وأقل الغازية مقارنة بالأساليب الأخرى.

الدور المحتمل ل MSCs كأداة للعلاج يستند إلى الخلية التي تهدف إلى تجديد الأسنان مصلحة ناشئة بين مختلف المجموعات البحثية. وقد أكدت الدراسات أن MSCs يمكن أن تكون متباينة من الأنواع التالية من الأنسجة: نخاع العظام والأغشية الدهنية، الزليلي، بيريسيتي، العظم ترابيكولار، الحبل السري البشري وأنسجة الأسنان2،3. وتشمل المصادر الشائعة ل MSCs نخاع العظام والأنسجة الدهنية وأنسجة الأسنان. بالمقارنة مع MSCs المستمدة من نخاع العظام والأنسجة الدهنية، مزايا الخلايا الجذعية طب الأسنان هي سهولة الحصول عليها وأقل معدلات الاعتلال بعد الحصاد. بالمقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، MSCs المستمدة من أنسجة الأسنان تظهر نونيمونوجينيك ولا ترتبط بالشواغل الأخلاقية المعقدة3.

وفي عام 2006، أوصت "الجمعية الدولية" للعلاج باستخدام المعايير التالية لتحديد MSCs: أولاً، MSCs يجب أن تكون قادرة على ربط للبلاستيك. ثانيا، يجب أن تكون MSCs الإيجابية المستضدات السطحية CD105 و CD73 و CD90 والسلبية للعلامات وحيدات، الضامة، والخلايا ب الإضافة إلى مولدات المكونة للدم CD45 و CD344. MSCs كمعيار نهائي، يجب أن يكون قادراً على التفريق في الأنواع الثلاثة التالية من الخلايا تحت الظروف القياسية من التمايز في المختبر : خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes chondrocytes4. وحتى الآن، تم عزل ستة أنواع من الخلايا الجذعية البشرية الأسنان وتتميز. النوع الأول كان معزولاً من الأنسجة البشرية اللب وتسمى الخلايا الجذعية لب الأسنان بعد الولادة5. في وقت لاحق، تم عزل ثلاثة أنواع إضافية من MSCs الأسنان وتتميز: الخلايا الجذعية من سينظف الأسنان المتساقطة6و أربطة اللثة7الحليمة قمي8. في الآونة الأخيرة، المستمدة من جريب الأسنان9و المستمدة من أنسجة اللثة10براعم الأسنان الجذعية cells(DBSCs)11ذروية كيسه MSCs (هبسي-MSCs)12 حددت أيضا.

وكان فريدينستين أول تعريف MSCs13. MSCs يحمل إمكانية انتشار عالية ويمكن التلاعب بها للتفريق بين قبل يجري زرعها، مما يوحي بأن هم المرشحين المثالي لإجراءات التجدد10.

على الرغم من أن معظم الدراسات قد استخدمت النخاع العظمى كمصدر للخلايا الجذعية، الخلايا المستمدة من السمحاق (PDCs) كما تم استخدامه مؤخرا14. السمحاق أكثر سهولة مما نخاع العظام. ولذلك، هذا الأسلوب، نستخدم سمحاق السنخية للقضاء على الحاجة إلى شقوق إضافية أثناء الجراحة وتقليل الاعتلال بوستسورجيكال في المرضى. السمحاق هو النسيج الضام التي تشكل بطانة الخارجي للعظام الطويلة، وتضم اثنين من طبقات مختلفة: الطبقة الليفية الخارجية تتألف من الخلايا الليفية، والكولاجين والألياف المرنة15، وطبقه كامبيوم الغنية بالخلايا الداخلية في الاتصال المباشر مع سطح العظم. طبقة كامبيوم يحتوي على محتوى خلية مختلطة، أساسا الليفية16وخلايا الاوستيوبلاستس17بيريسيتيس18يتدنى حرجة المحددة ك MSCs19،،من2021. وقد أفادت معظم الدراسات أن PDCs قابلة للمقارنة، أن لم يكن متفوقة، على الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم (بمسكس) في العظام شفاء وتجديد22،،من2324. يمكن الوصول إليها بسهولة السمحاق والمعارض فعالية التجدد ممتازة. ومع ذلك، ركزت دراسات القليلة على ال26،25،سمحاق27.

وفيما يتعلق بإصلاح العظام، ينطوي الممارسة السريرية الحالية زرع الخلايا السلف periosteal تضخيم داخل السقالات الداعمة. ركزت الدراسات التي أجريت مؤخرا على الحصول على الخلايا الجذعية في المناطق المعيبة وتستخدم الخلايا السلف ل تجديد الأنسجة20. كما توقع أطباء الأسنان التطبيق المستقبلي للتجدد العظام اللثة في علاجات اللثة وزراعة الأسنان. فيما يتعلق بالموقع، والجهات المانحة يمكن حصادها في السمحاق بسهولة بجراحي طب الأسنان العام. يقارن هذا مشجعا للغاية ضد الخلايا اللحمية في النخاع، كما يمكن الوصول إليها في السمحاق أثناء الجراحة الفموية الروتينية. وهكذا، والهدف من هذه الدراسة هو لوضع بروتوكول لحصاد PDCs ولتقييم مورفولوجيا والمرفقات، والبقاء، وتكاثر الخلايا الجذعية البشرية السمحاق.

والايضات فيتامين (د) يؤثر في فيفو العظام المعدنية ديناميكية التوازن. وأفادت إحدى الدراسات أن2د 24R,25-(OH)3 النموذج النشط من فيتامين (د) أمر ضروري للتفريق بين أوستيوبلاستيك البشرية MSCs (همسكس)28. ينظم التوازن العظام وإصلاح شبكة من فيتامين (د)3 نواتج الأيض، من الذي 1,25-(OH)2د3 (الكالسيتريول) هو الأكثر بيولوجيا نشطة وذات الصلة في التنظيم لصحة العظام. فيتامين د3 ضروري تكلس29. وأوضحت الهيئات امبريويد في الفئران في دراسة واحدة باستخدام الفئران كونمينغ بيضاء عمرها 2 د، أن مكملات فيتامين (ج) وفيتامين (د) عززت فعالية التفريق بين خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من ESC30. ضمن أنشطته البيولوجية الأخرى، 1,25-(OH)2د3 يحفز التمايز في المختبر من همسكس إلى خلايا الاوستيوبلاستس، التي يمكن رصدها استناداً إلى الزيادة في نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) أو الجينات OCN التعبير.

وقد كشف دراسات قليلة علاقة جرعة واستجابة للعلاجات مجتمعة مع 1,25-(OH) وفيتامين ج2د3 في PDCs البشرية مع تركيز بوجه خاص على هندسة الأنسجة العظام. ولذلك، في هذه الدراسة، ندرس التركيزات المثلى لمعاملة مفردة أو مجتمعة من 1,25-(OH)2د3 وفيتامين (ج) لحفز التفريق بين osteogenic PDCs البشرية. والهدف من هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان عدد سكان خلية المعزولة من السمحاق السنخية الأسنان يحتوي على الخلايا التي تحتوي النمط الظاهري ماجستير وما إذا كان يمكن التوسع في الثقافة (في المختبر) هذه الخلايا ومتباينة لتشكيل النسيج المطلوب . وبالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم قدرة PDCs تفرق في أوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس و adipocytes. الجزء الثاني من هذه الدراسة تقييم آثار فيتامين ج و 10−1010−9، 10−8و 10−7 ، 1,25-(OH) م2د3 على نشاط osteogenic PDCs. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة تقييم وظائف فيتامين ج و 1,25-(OH)2د3 خلال التفريق بين PDCs أوستيوبلاستيك بنشاط حزب العمال الأسترالي، والجينات برو أوستيوجينيك، مثل حزب العمال الأسترالي، الكولاجين-1، OCN، BSP، و CBFA1. وبالإضافة إلى ذلك، تحدد هذه الدراسة الشروط أوستيويندوكتيفي الأمثل للبشرية PDCs استناداً إلى هذه النتائج.

Protocol

وأقر بروتوكول الدراسة "المؤسسية استعراض المجلس تشانغ الأمنيون التذكارية المستشفى". وقدمت جميع المشاركين الموافقة الخطية.

1-إعداد الأنسجة

  1. حصاد الأنسجة بيريوستيل من المرضى أثناء جراحة الأسنان (الشكل 1). بعد تفكير رفرف تحت التخدير الموضعي، يأخذ قطعة من نسيج سمحاق العظام السنخية باستخدام فاصل periosteal31.
  2. بعد الحصاد، تخزين شرائح الأنسجة periosteal حوالي 5 مم × 2 مم في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) مع يو/مليلتر 300 البنسلين و 300 ملغ/مل من ستربتوميسين. نقل الأنسجة إلى المختبر خلال 24 ساعة.
  3. فرم الشظايا الأنسجة periosteal السنخية مع المشارط حتى مفروم جيدا والمحافظة على العينات في المرور 0 المتوسطة (التي تتألف من 300 يو/مليلتر من البنسلين و 300 ملغ/مل ستربتوميسين، α-الفنزويلية، ونسبة 5% مصل بقرى الجنين [FBS]) المزروع في حاضنة في 37 درجة مئوية مع هوميديفيد الهواء (ثاني أكسيد الكربون 5%). في الحاضنة، إعداد حوض الماء للحفاظ على رطوبة.
  4. تغيير المتوسطة بعد 3 أيام ومرتين في الأسبوع بعد ذلك.
  5. عندما وصلت الخلايا سوبكونفلوينسي (80%)، الإفراج عن الخلايا ملتصقة مع 200 ميليلتر من التربسين 0.25% في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق ومن ثم استخدام 4.5 مل متوسطة إلى إنهاء رد فعل.
  6. لوحة الخلايا مرة أخرى في المتوسط مرور جديدة 1 (α-الفنزويلية، 10% FBS، 100 وحدة/مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين). لوحة هو 5 × 103 الخلايا (كما عد من هيموسيتوميتير).
  7. أداء كل مرور اللاحقة بعد تحقيق التقاء 80%31من الخلايا.
    ملاحظة: في البداية، سوف تكون المتوسطة البرتقالي الأحمر. وبعد ثلاثة أيام تقريبا، يجب تغيير اللون المتوسط إلى ظل مصفر. الوقت مضاعفة الخلايا تقريبا ح 30-40، التي تحتاج إلى 7 أيام للأجيال 3-5.
  8. وتستكمل الثقافة PDCs معزولة في α-الفنزويلية مع 10% FBS، يو مليلتر 100 من البنسلين، و 100 مغ/مل من ستربتوميسين في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2).
  9. مراقبة نمو الخلايا يوميا واستبدال المتوسطة النمو مرتين في الأسبوع. استخدام خلايا الجيل الثالث إلى الخامس لتجارب إضافية.

2-التدفق الخلوي

  1. الحصاد 1 × 106 الخلايا عن طريق الهضم التربسين:
    1. إضافة 200 ميليلتر من 0.25% التربسين. بعد 3 دقائق، استخدام 4.5 مل من الثقافة المتوسطة التي تحتوي على FBS لإنهاء رد فعل التربسين وجمعها عن طريق الطرد المركزي (1500 لفة في الدقيقة، 5 دقائق، 22 درجة مئوية).
    2. تغسل الكريات الخلية باستخدام ثلاث مرات 1 x DPBS. ريسوسبيند الخلايا في 200 1 x ميليلتر permeabilization المخزن المؤقت. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
  2. فحص العلامات السطحية أعرب أعرب من PDCs من خلال التدفق الخلوي (الأسفار تنشيط الخلية الفرز)32. استخدام الأجسام المضادة (ماب) ضد CD19 (fluorescein isothiocyanate (فيتك))، CD34 (فيتك)، CD44 (Phycoerythrin [بي])، CD45 (فيتك)، CD73 (PE)، CD90 (اللوفيكوسيانين [APC])، CD146 (PE) وقامت-1 (أليكس)، والدكتور هلا (فيتك)32.
    1. إضافة الأجسام المضادة للعينات والثقافة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. تغسل الخلايا مع 1 x DPBS ثلاث مرات.
    3. إصلاح الخلايا باستخدام 2% فورمالدهايد والمضي قدما في التدفق الخلوي التحليل32.

3-خلية المرفقات والبقاء مع أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والتمايز تشوندروجينيك

الحث على التمايز في الخلايا في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتشوندروجينيك الأنساب باستزراع الخلايا periosteal في كل المعابر الثلاثة على ألواح ستة-جيدا مع وسائل الإعلام التمايز محددة.

  1. للتفريق بين أوستيوجينيك، ثقافة الخلايا في α-الفنزويلية في كثافة الخلايا 5000 كل بئر على ألواح الثقافة ستة آبار.
    1. على تحقيق التقاء 80%، ثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط التي تحتوي على α-الفنزويلية، 5% FBS، β-جليسيروفوسفاتي (10 ملم)، 10−7 م الديكساميتازون (0.1 مم)، و 5 مل حمض الأسكوربيك (100 أم). الثقافة مراقبة سلبية في وسائل الإعلام التي تتألف من α-MEM و 5% FBS.
    2. تغيير الوسائط مرتين في الأسبوع.
    3. بعد 4 أسابيع، تقييم إمكانات الخلايا تفرق في نسب أوستيوجينيك واسطة تلطيخ الخلايا باستخدام مقايسة فون كوسي، الذي يميز بين وجود رواسب متكلسة في ثقافة33.
      1. إضافة الفورمالين 10% لتحديد. خلال 30 دقيقة، إضافة نترات الفضة 5% وعلاج تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء على ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
      2. إضافة 5% Na2حتى4 أربع مرات، مما يسمح 3 دقائق لكل رد فعل. وأخيراً، غسل الخلايا مرتين بماء مقطر.
        ملاحظة: فون كوسي تلطيخ رد فعل هطول الأمطار حيث تتفاعل أيونات الفضة والفوسفات حضور المواد الحمضية؛ هذا الأسلوب المصبوغة ليست محددة للكالسيوم. في هذه الدراسة، عندما كانت تعامل الخلايا يتم التحقيق مع محلول نترات الفضة، الكالسيوم – الذي يخفض بقوة الأشعة فوق البنفسجية – محله الفضة، التي أصبحت تظهر الفضي المعدني.
  2. أديبوجينيك التفريق، ثقافة الخلايا في كثافة الخلايا 5000 كل بئر على ستة آبار الثقافة لوحات تتضمن α-الفنزويلية.
    1. على تحقيق التقاء 80%، ثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط التي تحتوي على α-الفنزويلية، 5% FBS، 0.5 مم 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (100 مغ/مل)، البنسلين 1%، 10−6 م الديكساميتازون (1 مم) والإنسولين (5 ملغ/مل) الاندوميتاسين (60 ملم).
    2. الثقافة مراقبة سلبية في وسائل الإعلام التي تتألف من α-MEM و 5% FBS.
    3. بعد 6 – 9 أسابيع، استخدام النفط س الأحمر وصمة عار الخلايا وإبراز قطرات الدهن، وبالتالي تحديد وجود التمايز أديبوجينيك33:
      1. إضافة الفورمالين 10% لتحديد. خلال 30 دقيقة، وصمة عار الخلايا التي تحتوي على 0.5% النفط يا أحمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ويغسل الخلايا ثلاث مرات مع الايزوبروبانول 60% لمدة 3 دقائق في كل مرة؛ وأخيراً، غسل الخلايا بالماء المقطر.
        ملاحظة: الزيت الأحمر س ليسوتشرومي صبغة ديازو (تذوب) تستخدم لتلطيخ الدهون محايدة، أساسا استرات triacylglycerol والبروتين الدهني، ونسبة الكولسترول في الدم. الصبغ يذوب في قطرات الدهون في الخلية، تحول قطرات الدهن الأحمر.
  3. تشوندروسيتي التفريق، خلايا الثقافة على ألواح الثقافة ستة-جيدا مع بعضها التي تحتوي على الخلايا 5000.
    1. إضافة تمايز متوسطة المحتوية على α-MEM 5% FBS، 10−7 م الديكساميتازون (0.1 مم)، بيروفات صوديوم (100 ميكروغرام/مل)، الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم-أ (1 × لها)، وتحويل عامل النمو-بيتا (10 نانوغرام/مل) و 5 مل من حمض الأسكوربيك (100 ميكرومتر).
    2. الثقافة مراقبة سلبية في وسائل الإعلام التي تتألف من α-MEM و 5% FBS.
    3. بعد 4 – 5 أسابيع، استخدم السيان الأزرق تلطيخ لتسليط الضوء على السكريات الحمضية، مثل الجليكوزامينوجليكان أو بعض أنواع mucopolysaccharides في غضروف الخلايا لتحديد وجود التمايز تشوندروسيتي33.
      1. إضافة الفورمالين 10% لتحديد. خلال 30 دقيقة، إضافة 3% حمض الخليك وتسمح 2 دقيقة لرد الفعل. وفي وقت لاحق، تغسل بالماء المقطر ثلاث مرات وإضافة 1% السيان الأزرق 8GX المحتضنة لمدة 30 دقيقة وثم يغسل بالماء المقطر. أخيرا، إضافة حمض الخليك 3% والمياه والصرف الصحي لمدة 3 دقائق ومن ثم يغسل بالماء المقطر لإنهاء.
        ملاحظة: بعد تلطيخ أجزاء الخلية التي وصمة عار على وجه التحديد بهذه الصبغة يصبح الأزرق إلى الأخضر والأزرق وتسمى "السيانوفيليك".

4-آثار 25-ديهيدروكسيفيتامين د3 (1,25-(OH)2د3) في تكون العظم

  1. تقسيم P3 إلى P5 PDCs إلى ست مجموعات والثقافة على ألواح 6-جيدا مع وسائل الإعلام المختلفة في الثقافة:
  2. مجموعة السلبية (α-MEM و 5% FBS)؛
  3. مجموعة فيتامين C (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، ودكساميثازون 10−7 م + 100 أم فيتامين (ج))؛
  4. و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 المجموعة (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، والديكساميتازون م−7 10 + 10−7 1,25-(OH) م2د3).
  5. إضافة 2 مل الوسط إلى حاضنة (37 درجة مئوية) في كل بئر وتغيير في المتوسط مرتين كل أسبوع.

5-عكس النسخ/الكمية في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل

  1. بعد 7 د التمايز osteoblast، عزل الجيش الملكي النيبالي إجمالي على الجليد باستخدام كاشف تجاري (انظر الجدول للمواد):
    1. أضف 1 مل كاشف العزل لكل بئر. إضافة 200 ميليلتر من بروموتشلوروبروباني وتترك لمدة 10 دقيقة لتوليد الطبقات الجيش الملكي النيبالي، وثم الطرد المركزي في 10000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    2. بعد الطرد المركزي، إضافة 500 ميليلتر من 2-بروبانول إلى 500 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الذي يتضمن طافية. يعجل بالجيش الملكي النيبالي على الجليد، والسماح لمدة 15 دقيقة لرد الفعل.
    3. بعد الإجراء الطرد المركزي 12,000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على 4 درجة مئوية، وبعدها الجيش الملكي النيبالي يقع في الجزء السفلي من الأنبوب. وفي وقت لاحق، إزالة المادة طافية باستخدام 1 مل كحول 75% للغسيل والطرد المركزي 7,500 لفة في الدقيقة لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة المادة طافية واستخدام مركز فراغ لإنتاج الحمض النووي الريبي من الجزء السفلي من السائل. استرداد مع الماء.
  2. عكس نقل الجيش الملكي النيبالي (1 ميكروغرام) استخدام المنتسخة العكسية فيروس إنفلونزا الطيور ميلوبلاستوسيس. تعيين البلمرة المتسلسل (PCR) لتشغيل عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 50 درجة مئوية عن 60 دقيقة ومن ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، قبل أخيرا الحفاظ على 4 درجة مئوية.
  3. توليف الحمض النووي التكميلية الأولى-ستراند (كدنا). إجراء PCR الكمي (قبكر) باستخدام 5 ميكروليتر من 01:10 إضعاف كدنا. إجراء كمي RT-PCR (قرة-PCR) باستخدام كبسولة تفجير لحزب العمال الأسترالي، باهوجان ساماج، OCN، CBFA1، والكولاجين-1.
    ملاحظة: لتجنب تلويث الحمض النووي بالإشارات، صممت تسلسل إلى الأمام وعكس كل التمهيدي على exons متميزة.
  4. أداء قبكر باستخدام سيد بكر تجارية مزيج (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعيين cycler الحرارية عند 50 درجة مئوية 2 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم 40 دورات كل منها عند 95 درجة مئوية لمدة 15 s يليه 60 درجة مئوية ل 60 ثانية.
    ملاحظة: يتطلب البروتوكول سيبر أيضا مرحلة منحنى تذوب، الذي يتم تشغيله عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية مقابل 60 s، ومن ثم 95 درجة مئوية لمدة 15 ق.
  5. تطبيع قيم العتبة دورة لحزب العمال الأسترالي، باهوجان ساماج، CBFA1، الكولاجين-1، و OCN لأن الجينات التدبير المنزلي جابده. 34
  6. وترد في الجدول للموادأزواج التمهيدي.

6. النشاط الفوسفاتيز القلوية

  1. تقييم نشاط إنزيم الب الخلايا باستخدام الأسلوب هو موضح سابقا35، الذي يحول الفوسفات-نيتروفينيل ف لف-نيتروفينول؛ فنيتروفينيل الفوسفات هو ركيزة الفوسفاتيز الذي يتحول إلى اللون الأصفر عند ديفوسفوريلاتيد من حزب العمال الأسترالي، كما هو محدد في طول موجي 405 نانومتر. تطبيع المجموع فنيتروفينول شكلت استناداً إلى مجموع البروتين يحددها المقايسة برادفورد.
  2. مقارنة أنشطة حزب العمال الأسترالي لعنصر التحكم (α-الفنزويلية، 5% FBS)، فيتامين ج (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، الديكساميتازون 10−7 م + 100 أم فيتامين ج)، 1,25-(OH)2د3 (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10−7 م الديكساميتازون + 10−8 م 1,25-(OH)2د3)، وفيتامين ج + 1,25-(OH)2د3 (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، الديكساميتازون 10−7 م + 100 أم فيتامين ج +1,25-(OH)2د3) المجموعات بعد أسبوع 1، 2، 3، و 4 من الثقافة.
  3. تنفيذ إجراء استخراج بروتين على الجليد:
    1. تتخلص الخلايا من لوحات 6-جيدا وإضافة 50 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. وفي وقت لاحق، مكان الخلايا على الجليد مدة 30 دقيقة لتدمير الخلايا وخالية من البروتين.
    2. وبعد 30 دقيقة، الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، واستخراج المادة طافية لتخزين واستخدام.

النتائج

ترد البيانات لجميع الاختبارات الكمية، كما يعني ± الانحراف المعياري (SD). أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام الطالب t-اختبار. وفي المجموع، تم الحصول على العينات 34 مع متوسط عمر المشاركين من 48.1 ± 12.3 يوسف أحد عشر من هذه العينات التي تم الحصول عليها من المرضى الذكور و 2...

Discussion

طريقة علاجية المتقدمة مؤخرا، إلا وهي الأنسجة الهندسة التي تستتبع MSCs، له فوائد عديدة. MSCs، التي موجودة في العديد من أنواع الأنسجة، هي multipotent الخلايا التي يمكن أن تفرق في مجموعة متنوعة من خلايا الأنسجة ميسوديرمال الوظيفية37 وغيرها من الخلايا مثل خلايا الاوستيوبلاستس.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأقر "مجلس المراجعة المؤسسية" "البحوث من تشانغ الأمنيون التذكارية المستشفى اﻻكلينيكي" (IRB99-1828B و C 100-3019، 99-3814B، ج 102-1619، 101-4728B وج 103-4223) بروتوكول الدراسة. وأيد هذه الدراسة تشانغ الأمنيون التذكاري مستشفى (CMRPG392071، CMRPG3A1141، CMRPG3A1142، و NMRPG3C0151). تم تحرير هذه المخطوطة عن طريق "تحرير والاس الأكاديمية".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium saltSigma49752
35-mm culture dishesCorning430165
3-isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
6  well plateCorning3516
Alkaline phosphataseABIHs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay KitBioVisionK412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptaseRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
Cell banker1ZEAOAQ11888
core binding factor alpha-1ABIHs00231692_m1
dexamethasoneSigmaD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD562008
indomethacinSigmaI7378
insulinsigma91077C
insulin–transferrin–selenium-ASigmaI1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)Life4346907
MicroAmp optical adhesive filmLife4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha ModificationHyCloneSH30265.02
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Permeabilization buffereBioscience00-8333-56
Sodium pyruvateGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixAppliedBiosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
transforming growth factor-βSigmaT7039 
Trizol reagent (for RNA isolation)Life15596018
β-glycerophosphateSigmaG9422
collagen-1Invitrogenforward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCNInvitrogenforward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSPInvitrogenforward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R., Franklyn, J. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. 16, 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F., Hall, B. K. . The Periosteum and Bone Growth. , (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J., Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. , 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor?. J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 125 OH 2 3 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved