JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол расследовать биомаркеров выражение mRNA надкостницы, полученных клеток (PDC) под воздействием витамина С (витамин C) и 1,25-дигидрокси витамин D [1,25-(OH)2D3]. Кроме того мы оценить способность PDC дифференцироваться в остеоциты, хондроцитов и адипоцитов.

Аннотация

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) присутствуют в различных тканях и может быть дифференцирована в многочисленные типы клеток, в том числе остеобластов. Среди Стоматологическая источники MSCs надкостницы является легко доступной ткани, которая была обнаружена содержать MSCs в слой камбия. Однако этот источник имеет еще не изучены широко.

Было продемонстрировано, что витамин D3 и 1,25-(OH)2D3 стимулировать в vitro дифференцировки МСК в остеобластов. Кроме того витамин С способствует рост клеток формирования и костного коллагена. Однако ни в одном исследовании еще изучается воздействие витамина D3 и витамина С на MSCs.

Здесь мы представляем метод изоляции MSCs от человека надкостницей альвеолярного и проверить гипотезу о том, что 1,25-(OH)2D3 может оказывать osteoinductive влияние на эти клетки. Мы также расследовать присутствие MSCs в человека надкостницей альвеолярного и оценить клеточной адгезии и распространения. Оценить способность витамина С (как элемент управления) и различных концентраций 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8и 10−7 М) для изменения ключа мРНК биомаркеров в изолированные выражение MSCs mRNA щелочной фосфатазы (ALP), кости sialoprotein (BSP), ядро привязки фактор альфа-1 (CBFA1), коллаген-1, и остеокальцин (OCN) измеряются с помощью реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Введение

Хотя в последние годы были разработаны многочисленные соответствующие методы, кости реконструкции по-прежнему ограничивается несколько ограничений и оценки степени необходимой реконструкции часто невозможно. Для эстетических и функциональных целей в дополнение к благоприятным долгосрочного успеха требуется увеличение жестких тканей. Методы, обычно используемые для таких процедур включают автогенной и аллогенных костной пластики, xenografting и Аллопластические костной пластикой. Среди различных видов костного трансплантата аутогенная костных имплантатов, считаются наиболее эффективным. Однако доноров сайт заболеваемости, нарушенной кровоснабжения и ограниченные ткани доступности1 были основные недостатки для автогенной костной пластикой. Кроме того аллогенной костных имплантатов и ксенотрасплантатов были связаны с передачи болезни. В настоящее время синтетические костных имплантатов широко используются для решения этих проблем. Однако с их отсутствием Остеогенные потенциал, клинические исходы различались. Материалы, такие как целлюлоза, связанные с колебаниями объема, инфекции и отсутствие силы.

Костной аугментации с помощью тканевой инженерии вызвала значительный интерес. В этой технике мезенхимальных стволовых клеток (МСК) первоначально используются для поощрения остеобластов дифференциация, которая затем пересадили на сайт потери костной массы для достижения кости ремонт. В настоящее время эта процедура применяется в клеточной терапии. Достижения реконструкции кости путем извлечения ограниченное количество ткани проще и менее инвазивные по сравнению с другими методами.

Потенциальная роль MSCs как инструмента на основе ячеек терапии, направленной на стоматологические регенерации является формирующейся интерес среди различных исследовательских групп. Исследования подтвердили, что MSCs может быть продифференцированным от следующих типов тканей: костного мозга, жировой, синовиальной мембраны, перицит, Трабекулярная кость, человека пуповины и тканей зуба в2,3. Общие источники MSCs костного мозга и жировой тканей зуба. По сравнению с MSCs, полученные из жировой ткани и костного мозга, преимущества Стоматологическая стволовых клеток являются доступность и менее заболеваемости после сбора урожая. По сравнению с эмбриональных стволовых клеток, MSCs, производный от зубной ткани появляются nonimmunogenic и не связаны с3сложные этические проблемы.

В 2006 году Международного общества клеточной терапии рекомендуется использование следующих стандартов для определения MSCs: во-первых, должна быть способна крепления пластика MSCs. Во-вторых служба MSCs должна иметь для поверхностных антигенов CD105, CD73 и CD90 положительными и отрицательными для маркеров для моноциты, макрофаги и клетки B помимо гемопоэтических антигены CD45 и CD344. Как последний критерий, MSCs должны быть способны дифференцироваться в следующих трех типов клеток при стандартных условиях в vitro дифференциации:4остеобластов, адипоциты и хондроцитов. На сегодняшний день, были изолированы и характеризуется шесть видов Стоматологическая стволовых клеток человека. Первый тип был изолирован от ткани человека целлюлозы и называется послеродовой пульпы зуба стволовых клеток5. Впоследствии, были изолированы и охарактеризовал три дополнительные виды стоматологических MSCs: стволовые клетки из вспученного молочных зубов6, периодонтальной связки7и апикального сосочка8. Совсем недавно также были определены Стоматологическая фолликула, полученных9, десневой ткани производные10, стоматологическая бутон стволовых cells(DBSCs)11и периапикальных кисты MSCs (hPCy-MSCs)12 .

Фриденштайн был первым, чтобы определить MSCs13. MSCs экспонат высокий потенциал распространения и можно манипулировать, чтобы дифференцировать до трансплантации, который свидетельствует о том, что они являются идеальными кандидатами для регенеративной процедуры10.

Хотя большинство исследований использовали как источник стволовых клеток костного мозга, клетки надкостницы производные (PDC) также были использованы недавно14. Надкостницы является более доступным, чем в костном мозге. Таким образом в этой технике, мы используем надкостницей альвеолярного устранить потребность в дополнительных надрезов во время операции и уменьшить послеоперационный заболеваемости пациентов. Надкостницы является соединительной ткани, который формирует наружной облицовки длинных костей и состоит из двух отдельных слоев: волокнистый слой состоит из15фибробластов, коллагеновые и эластичные волокна и внутренние ячейки богатых камбия слоя в прямой контакт с поверхностью кости. Слой камбия содержит смешанные клетки населения, главным образом фибробластов16, остеобласты17, pericytes18и критических субпопуляция, определены как MSCs19,,2021. Большинство исследований сообщили, что PDC сопоставимых, если не превосходит, костного мозга, полученных стволовых клеток (bMSCs) в кость заживление и регенерацию22,23,24. Надкостницы легко доступен и демонстрирует отличную эффективность регенерации. Однако несколько исследований были сосредоточены на надкостницы25,,2627.

Относительно кости ремонт текущий клинической практике предполагает трансплантации периостальная прогениторных клеток усиливается в рамках поддержки подмостей. Недавние исследования были сосредоточены на приобретении стволовых клеток в дефектных регионах и используя клетки-предшественники для регенерации ткани20. Стоматологи также предвидеть будущее применение пародонтальных костной регенерации в лечение пародонта и зубных имплантатов. Относительно донора сайта надкостницы могут быть легко собраны общие зубной хирургов. Это выгодно против стромальных клеток костного мозга, как надкостнице могут быть доступны во время рутинной челюстно-лицевой хирургии. Таким образом цель данного исследования – создать протокол для уборки PDC и для оценки морфологии, привязанности, жизнеспособность и распространения стволовых клеток человека надкостницы.

Метаболиты витамина D влияет на динамического равновесия в vivo кости минеральные. Одно исследование сообщало, что 24R,25-(OH)2D3 активная форма витамина D имеет важное значение для osteoblastic дифференциация человека MSCs (использования)28. Кость гомеостаза и ремонт регулируются сети3 метаболитов витамина D, из которых 1,25-(OH)2D3 (кальцитриола) является наиболее биологически активных и соответствующие в регулировании здоровья костей. Витамин D3 имеет важное значение для кальцификации29. В одном исследовании с использованием 2-d старый Куньмин белых мышей embryoid органов в мышей указал, что витамин С и витамин D добавки эффективно способствует дифференциации ESC-производные остеобластов30. Среди его биологической деятельности 1,25-(OH)2D3 стимулирует дифференциация в vitro использования остеобластов, которые могут контролироваться исходя из увеличения активность фермента щелочной фосфатазы (ALP) или OCN гена выражение.

Несколько исследований обнаружили доза-ответная реакция комбинированного лечения с витамином С и 1,25-(OH)2D3 человека PDC с особым упором на кости тканевой инженерии. Таким образом в этом исследовании, мы изучить оптимальные концентрации для одного или комбинированного лечения 1,25-(OH)2D3 и витамина С для стимулирования Остеогенные дифференциация человека PDC. Целью настоящего Протокола является определить, содержит ли популяции клеток, изолированных от стоматологических альвеолярного надкостницы ячейки с MSC фенотипа и ли эти клетки могут быть расширены в культуре (в пробирке) и дифференцированной сформировать желаемый ткани . Кроме того мы оценить способность PDC дифференцироваться в остеоциты, хондроцитов и адипоцитов. Вторая часть исследования оценивает эффекты витамина C и 10−10, 10−9, 10−8и 10−7 1,25-(OH) М2D3 на Остеогенные активность PDC. Основная цель этого исследования заключается в оценке функции витамина С и 1,25-(OH)2D3 во время osteoblastic дифференциация PDC ALP активности, и про Остеогенные генов, например, ALP, коллаген-1, OCN, BSP и CBFA1. Кроме того это исследование определяет условия оптимального osteoinductive для человека PDC, основываясь на этих выводах.

протокол

Протокол исследования был одобрен институционального обзора Совет из Чанг Gung Мемориальный госпиталь. Все участники представили письменного информированного согласия.

1. Подготовка тканей

  1. Урожай периостальная тканей от пациентов во время стоматологической хирургии (рис. 1). После отражения лоскут под местной анестезией Возьмите кусок ткани надкостницы от альвеолярной кости с помощью периостальная сепаратор31.
  2. После сбора урожая, хранения периостальная тканей ломтиками примерно 5 мм × 2 мм в Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) с 300 ед/мл пенициллина и 300 мг/мл стрептомицина. Передача тканей в лабораторию в течение 24 ч.
  3. Фарш фрагментов альвеолярного периостальная ткани с скальпелей до тех пор, пока хорошо фарша и сохранить образцы в Средний проход 0 (состоящий из 300 ед/мл пенициллина и 300 мг/мл стрептомицина, α-MEM и 5% плода бычьим сывороточным [FBS]) культивировали в инкубаторе при 37 ° C с увлажненный воздух (5% двуокиси углерода). В инкубаторе готовят водный бассейн для поддержания влажности.
  4. После 3 дней и два раза в неделю после этого измените средство.
  5. Когда клетки достигли subconfluence (80%), отпустите адэрентных клеток с 200 мкл трипсин 0.25% в инкубатор (37 ° C) 3 мин, а затем использовать 4.5 мл среды прекратить реакции.
  6. Пластина клетки снова в свежих проход 1 среднего (α-MEM, 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл). Плита – 5 × 103 клеток (считается Горяева).
  7. Выполнение каждого последующего прохода после того, как клетки достичь 80% слияния31.
    Примечание: В начале, носитель будет оранжевый красный. После примерно трех дней средний цвет следует изменить на желтоватый оттенок. Время удвоения клеток составляет примерно 30-40 ч, нуждающихся 7 дней за 3-5 поколений.
  8. Культуры изолированных PDC в α-MEM дополнена 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина в инкубатор (37 ° C, 5% CO2).
  9. Наблюдать рост клеток ежедневно и заменить средство роста два раза в неделю. Использование третьего пятого поколения клетки для всех дальнейших экспериментов.

2. проточной цитометрии

  1. Урожай 1 × 106 клеток через пищеварение трипсина:
    1. 200 мкл трипсин 0.25%. После 3 минут используйте 4,5 мл питательной среды, содержащие FBS прекратить реакцию трипсина и собирать путем центрифугирования (1500 об/мин, 5 мин, 22 ° C).
    2. Вымойте клетки окатышей, три раза с использованием 1 x DPBS. Ресуспензируйте клеток в 1 x 200 мкл буфера permeabilization. Подсчет количества ячеек с Горяева.
  2. Изучите выраженных поверхностных маркеров, выразил от PDC через поток цитометрии (сортировки активирован флуоресценции клеток)32. Использование моноклональных антител (МАБ) против CD19 (флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (фикоэритрин [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (аллофикоцианин [APC]), CD146 (PE), си-1 (Алекс) и HLA-DR (FITC)32.
    1. Добавьте антитела к образцы и культуре в темноте при температуре 4 ° C за 30 мин.
    2. Вымойте клетки с 1 x DPBS три раза.
    3. Исправить ячейки, используя 2% формальдегида и продолжите потока cytometry анализ32.

3. сотовый привязанности и жизнеспособности с остеогенные, адипогенном и дифференциации хондрогенном

Побудить дифференциации в клетках в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий, культивирование периостальная клетки всех трех проходов на шесть ну пластины с конкретными дифференциация СМИ.

  1. Остеогенные дифференциации культура клетки в α-MEM на плотности 5000 клеток на колодец на шесть ну культуры пластин.
    1. По достижении 80% слияния, культура клетки в средствах массовой информации, содержащие α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат (10 мм), 10−7 М дексаметазон (0,1 мм) и 5 мл аскорбиновой кислоты (100 мкм). Культура отрицательного контроля в средствах массовой информации, состоящей из α-MEM и 5% FBS.
    2. Измените СМИ дважды в неделю.
    3. После 4 недель оценить потенциал клетки дифференцироваться в остеогенном линии путем окрашивания клеток, используя assay фон Kossa, который отличает наличие Кальцифицированный месторождений в культуре33.
      1. Добавьте 10% формалина для фиксации. В течение 30 мин добавить 5% нитрата серебра и лечить под ультрафиолетового (УФ) света за 1 ч при комнатной температуре.
      2. Добавить 5% Na24 четыре раза, что позволило 3 мин для каждой реакции. Наконец Вымойте клетки дважды с дистиллированной водой.
        Примечание: Фон Kossa окрашивание является реакция осадков где ионы серебра и фосфат реагируют в присутствии кислых материалов; Эта техника окрашивания не является специфичным для кальция. В этом исследовании, когда исследуемых клеток лечили раствор нитрата серебра, кальций — который уменьшается на сильного ультрафиолетового света — был заменен на серебро, которое стало видно, как серебристый металлик.
  2. Для дифференциации адипогенном культура клетки на плотность 5000 клеток в колодец на шесть ну культуры пластин, содержащие α-MEM.
    1. По достижении 80% слияния, культура клетки в средствах массовой информации содержащей α-MEM, 5% FBS, 0.5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (100 мг/мл), 1% пенициллин, 10−6 М дексаметазона (1 мм), инсулин (5 мг/мл) и индометацин (60 мм).
    2. Культура отрицательного контроля в средствах массовой информации, состоящей из α-MEM и 5% FBS.
    3. После 6-9 недель, используйте масло красный O запятнать клетки и выделить липидного капель, таким образом определяя наличие адипогенном дифференциация33:
      1. Добавьте 10% формалина для фиксации. В течение 30 мин, запятнать клетки с 0,5% масло красный O при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем вымыть клетки три раза с 60% изопропиловый спирт на 3 мин каждый раз; Наконец Вымойте клетки с дистиллированной водой.
        Примечание: Масло красный, O является lysochrome (fat-soluble) диазо-краситель, используемый для окрашивания нейтральные липиды, главным образом триацилглицеринов, липопротеидов и холестерин эфиры. Краска растворяется в липидного капель в ячейке, поворачивая красный капелек липидов.
  3. Для дифференциацию хондроцитов, культуры клеток на шесть ну культуры пластины с каждым хорошо содержащих 5000 клетки.
    1. Добавление дифференциации среднего содержащие α-MEM, 5% FBS, 10−7 М дексаметазона (0,1 мм), пируват натрия (100 мкг/мл), инсулин трансферрина Селена A (1 × ее), преобразование фактор роста β (10 нг/мл) и 5 мл аскорбиновой кислоты (100 мкм).
    2. Культура отрицательного контроля в средствах массовой информации, состоящей из α-MEM и 5% FBS.
    3. После 4-5 недель используйте Альциановый синий пятнать выделить кислотные полисахариды, например гликозаминогликанов или некоторые виды мукополисахаридов, в хрящевых клеток для определения присутствия дифференциацию хондроцитов33.
      1. Добавьте 10% формалина для фиксации. В течение 30 мин добавить 3% уксусной кислоты и позволяют 2 мин для реакции. Впоследствии промыть дистиллированной воды три раза, добавить 1% Альциановый синий 8GX инкубировали в течение 30 минут и затем вымыть с дистиллированной водой. Наконец добавить 3% уксусной кислоты и мыть за 3 мин, а затем вымыть с дистиллированной водой до конца.
        Примечание: Части ячейки, которые специально пятно этот краситель, становятся голубыми до сине зелёного после окрашивания и называют «alcianophilic.»

4. эффекты 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) на Остеогенез

  1. P3 для P5 PDC разделены на шесть групп и культуры на 6-ну пластины с различными СМИ культуры:
  2. отрицательный группы (α-MEM и 5% FBS);
  3. Витамин C группа (α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат 10 мм и 10−7 M дексаметазон + 100 мкм витамина C);
  4. и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы (α-MEM, 5% FBS, 10 мм β-метронидазол и 10−7 M дексаметазон + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Добавьте 2 мл среды в инкубатор (37 ° C) в каждой скважине и измените среды дважды каждую неделю.

5. Обратная транскрипция/количественные реального времени полимеразная цепная реакция

  1. После 7 d остеобластов дифференциации, изолировать всего РНК на льду с использованием коммерческих реагента (см. Таблицу материалы):
    1. Добавьте 1 mL реагента изоляции для каждой скважины. 200 мкл bromochloropropane и оставить на 10 мин для создания многоуровневой РНК и затем центрифуги на 10000 об/мин, 15 мин при 4 ° C.
    2. После центрифугирования добавьте 500 мкл 2-пропанол 500 мкл супернатанта содержащие РНК. Осадок РНК на льду и позволит 15 мин для реакции.
    3. После процедуры центрифуги на 12000 об/мин, 15 мин при температуре 4 ° C, после чего РНК расположен в нижней части трубки. Впоследствии удалить супернатант с помощью 1 мл 75% спирта для мытья и центрифуги при 7500 об/мин за 8 минут в 4 ° C.
    4. Удалить супернатант и использовать вакуумные концентраторы для производства РНК из нижней части жидкости. Восстановите с водой.
  2. Реверс транскрибировать РНК (1 мкг) с помощью птичьего myeloblastosis вирус обратной транскриптазы. Установите полимеразной цепной реакции (ПЦР) для запуска при 25 ° C в течение 10 мин, после чего 50 ° C 60 мин и затем 85 ° C за 5 мин, прежде чем наконец поддержание при 4 ° C.
  3. Синтезировать перв стренги комплементарной ДНК — (cDNA кДНК). Выполнять количественного PCR (ПЦР) с помощью 5 мкл 1:10 разбавленный cDNA. Проведение количественного RT-PCR (qRT ПЦР) с праймерами для ALP, BSP, OCN, CBFA1 и коллаген-1.
    Примечание: Чтобы избежать загрязнения ДНК по сигналам, прямой и обратной последовательности каждого праймера были разработаны на собственный экзонов.
  4. Выполнять ПЦР с использованием коммерческих ПЦР Master Mix (см. Таблицу материалы) в соответствии с инструкциями производителя. Установите тепловая велосипедист при 50 ° C за 2 мин, после чего 95 ° C в течение 10 мин и затем 40 циклов, каждый на 95 ° C 15 s следуют 60 ° C для 60 s.
    Примечание: SYBR протокол также требует этап кривой расплава, который запускается при 95 ° C в течение 15 сек, 60 ° C 60 s, а затем 95 ° C 15 s.
  5. Нормализации цикла пороговые значения для ALP, BSP, CBFA1, коллаген-1 и OCN, уборки гена GAPDH. 34
  6. Грунтовка пар, перечислены в Таблице материалов.

6. щелочной фосфатазы

  1. Оценить ALP ферментативной активности клеток, используя ранее описанные техника35, который преобразует фосфат - нитрофенил p p- нитрофенола; p- нитрофенил фосфатов является фосфатазы субстрат, который желтеет, когда dephosphorylated, ALP, как определено на длине волны 405 нм. Нормализации общей p- нитрофенола формируется на основе общего белка определяется assay Брадфорд.
  2. Сравните ALP деятельности управления (α-MEM, 5% FBS), витамин С (α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат 10 мм, 10−7 M дексаметазон + 100 мкм витамин С), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS 10 мм β-метронидазол и 10−7 М Дексаметазон + 10−8 М 1,25-(OH)2D3) и витамин С + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат 10 мм, 10−7 M дексаметазон + 100 мкм витамин C +1,25-(OH)2D3) группы после 1, 2, 3 и 4 недели культуры.
  3. Выполните процедуру извлечения белков на льду:
    1. Скрип клетки от 6-ну пластин и добавьте 50 мкл буфера lysis. Впоследствии место клетки на льду для 30 минут, чтобы разрушать клетки и свободного белка.
    2. После 30 мин центрифуги на 13000 об/мин при 4 ° C на 15 мин. После центрифугирования экстракт супернатант для хранения и использования.

Результаты

Для всех количественных анализов данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Все статистические анализы были проведены с использованием студента t-теста. В общей сложности 34 образцы были получены с средний возраст участников 48,1 ± 12.3 ю. Одиннадца?...

Обсуждение

Недавно разработанные терапевтические модальности, а именно ткани инженерных, влекущее за собой MSCs, имеет многочисленные преимущества. MSCs, которые присутствуют в нескольких типов тканей, являются Multipotent с клетки, которые могут дифференцироваться в различных функциональных mesodermal ткан?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Протокол исследования был одобрен Советом по рассмотрению институциональных для клинических исследований из Чжан Гун Мемориальный госпиталь (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, C 102-1619, 101-4728B и 103-4223C). Это исследование было поддержано Чжан Гун Мемориальный госпиталь (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 и NMRPG3C0151). Этот манускрипт был отредактирован Уоллес академических редактирования.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium saltSigma49752
35-mm culture dishesCorning430165
3-isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
6  well plateCorning3516
Alkaline phosphataseABIHs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay KitBioVisionK412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptaseRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
Cell banker1ZEAOAQ11888
core binding factor alpha-1ABIHs00231692_m1
dexamethasoneSigmaD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD562008
indomethacinSigmaI7378
insulinsigma91077C
insulin–transferrin–selenium-ASigmaI1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)Life4346907
MicroAmp optical adhesive filmLife4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha ModificationHyCloneSH30265.02
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Permeabilization buffereBioscience00-8333-56
Sodium pyruvateGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixAppliedBiosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
transforming growth factor-βSigmaT7039 
Trizol reagent (for RNA isolation)Life15596018
β-glycerophosphateSigmaG9422
collagen-1Invitrogenforward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCNInvitrogenforward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSPInvitrogenforward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

Ссылки

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R., Franklyn, J. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. 16, 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F., Hall, B. K. . The Periosteum and Bone Growth. , (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J., Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. , 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor?. J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135125 OH 2D3D3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены