Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um die mRNA Ausdruck Biomarker der Knochenhaut-abgeleitete Zellen (PDCs) durch Vitamin C (Vitamin C) und 1,25-Dihydroxy Vitamin D [1,25-(OH)₂D₃] induzierte untersuchen. Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren.

Zusammenfassung

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind in einer Vielzahl von Geweben und in zahlreichen Zelltypen, einschließlich Osteoblasten differenzieren. Unter den dental Quellen von MSCs ist der Knochenhaut eine leicht zugängliche Gewebe, die MSCs im Kambium Layer enthalten identifiziert wurde. Allerdings hat diese Quelle noch nicht umfassend untersucht.

Vitamin D₃ und 1,25-(OH)₂D₃ wurden nachgewiesen in Vitro Differenzierung von MSCs in Osteoblasten stimulieren. Darüber hinaus fördert Vitamin C Kollagen-Bildung und Knochen Zellwachstum. Jedoch ist keine Studie die Wirkung von Vitamin D₃ und Vitamin C auf MSCs noch untersucht.

Hier präsentieren wir eine Methode der MSCs aus menschlichen alveoläre Periost zu isolieren und untersuchen die Hypothese, dass 1,25-(OH)₂D₃ Osteoinduktiv Auswirkungen auf diese Zellen ausüben kann. Wir untersuchen das Vorhandensein von MSCs in der menschlichen alveoläre Knochenhaut und Stammzell-Adhäsion und Verbreitung zu bewerten. Zu beurteilen, die Fähigkeit von Vitamin C (als Kontrolle) und verschiedenen Konzentrationen von 1,25-(OH)₂D₃ (10⁻¹⁰, 10⁻⁹10⁻⁸und 10⁻⁷ M), wichtige mRNA Biomarker in zu ändern isolierte MSCs mRNA Expression der alkalischen Phosphatase (ALP), bone Sialoprotein (BSP), Kern-bindende Faktor Alpha-1 (CBFA1), Kollagen-1 und Osteocalcin (OCN) sind mit Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen.

Einleitung

Obwohl zahlreiche relevante Techniken in den letzten Jahren entwickelt wurden, Knochen Sie Wiederaufbau bleibt durch mehrere Einschränkungen begrenzt, und schätzen, dass das Ausmaß des notwendigen Wiederaufbaus oft unmöglich ist. Hartgewebe Augmentation ist erforderlich, um ästhetische und funktionelle Ziele zusätzlich eine günstige langfristige Erfolgsquote zu erreichen. Üblichen Methoden für solche Verfahren gehören autologen und allogenen Knochentransplantation, Xenografting und alloplastischer Knochentransplantation. Unter den verschiedenen Arten von Knochentransplantat gelten autogene Knochentransplantate am effektivsten. Jedoch wurden Spender Website Morbidität, kompromittierte Vaskularität und begrenzte Gewebe Verfügbarkeit¹ wesentliche Nachteile für autogene Knochentransplantation. Darüber hinaus wurden allogene Knochentransplantate und Xenotransplantate mit Übertragung von Krankheiten in Verbindung gebracht. Derzeit sind synthetische Knochentransplantate verbreitet, diese Probleme zu lösen. Jedoch mit ihrer mangelnden osteogene Potenzial, haben klinische Ergebnisse unterschiedlich. Materialien wie Zellulose sind verbunden mit Volumen Fluktuation, Infektion und ein Mangel an Stärke.

Knochenaugmentation mit Gewebetechnik hat großes Interesse hervorgerufen. In dieser Technik werden mesenchymaler Stammzellen (MSCs) zunächst zur Osteoblasten Differenzierung fördern die sind dann auf der Website der Verlust von Knochen zu Knochen Reparatur verpflanzt. Dieses Verfahren ist derzeit in der Zelltherapie. Knochenaufbau zu erreichen, indem Sie eine begrenzte Menge an Gewebe zu extrahieren ist einfacher und weniger invasiv im Vergleich mit anderen Methoden.

Die potenzielle Rolle von MSCs als Werkzeug für zellbasierte Therapien, die darauf abzielen, dental Regeneration ist das aufkommende Interesse unter verschiedenen Forschungsgruppen. Studien haben bestätigt, dass MSCs aus den folgenden Arten von Gewebe unterschieden werden können: Knochenmark, adipös, synovial Membrane, Pericyte, trabekulären Knochen, menschlichen Nabelschnur und zahngewebe^2,3. Häufige Quellen von MSCs sind Knochenmark und Fettgewebe zahngewebe. Verglichen mit MSCs aus Fettgewebe und Knochenmark abgeleitet, sind die Vorteile von zahnärztlichen Stammzellen leichte Erreichbarkeit und weniger Morbidität nach der Ernte. Im Vergleich zu embryonalen Stammzellen, MSCs aus zahngewebe abgeleitet erscheinen nonimmunogenic und komplexe ethische Bedenken³zugeordnet sind.

Im Jahr 2006, der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie empfohlen mit folgenden Normen zu MSCs identifizieren: Erstens MSCs muß Befestigung an Kunststoff. Zweitens müssen MSCs für den Oberflächenantigenen CD105, CD73 und CD90 positiv und negativ für die Marker für Monozyten, Makrophagen und B-Zellen neben der hämatopoetischen Antigene CD45 und CD34⁴sein. Als letzte Kriterium, MSCs muss in der Lage, sich in die folgenden drei Arten von Zellen unter normalen Bedingungen in Vitro Differenzierung differenzieren: Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten⁴. Bisher haben sechs Typen von humanen zahnmedizinische Stammzellen isoliert und charakterisiert. Die erste Art wurde isoliert aus menschlichen Pulpagewebe und postnatale Zahnpulpa Stammzellen⁵bezeichnet. Anschließend drei weitere Arten von dental MSCs wurden isoliert und charakterisiert: Stammzellen aus abgestoßene Milchzähne⁶, die Wurzelhaut⁷und der apikalen Papille⁸. Vor kurzem wurden auch zahnmedizinische Follikel abgeleitet⁹, gingival Gewebe abgeleitet¹⁰, dental Knospe Stamm cells(DBSCs)¹¹und periapikalen Zyste MSCs (hPCy-MSCs)¹² festgestellt.

Friedenstein war der erste, MSCs¹³zu definieren. MSCs weisen eine hohe Verbreitung potenzieller und manipuliert werden, um vor verpflanzt wird, zu unterscheiden was darauf hindeutet, dass sie ideale Kandidaten für regenerative Verfahren¹⁰sind.

Obwohl die meisten Studien als eine Quelle von Stammzellen des Knochenmarks verwendet, Periost-abgeleitete Zellen (PDCs) wurden ebenfalls vor kurzem¹⁴verwendet. Das Periost ist leichter zugänglich als Knochenmark ist. Deshalb verwenden wir bei dieser Technik, alveoläre Periost, weitere Einschnitte bei der Operation überflüssig und postoperativen Morbidität bei Patienten zu reduzieren. Das Periost ist das Bindegewebe, das bildet die äußeren Auskleidung der langen Knochen und besteht aus zwei unterschiedlichen Schichten: die äußere Faserschicht bestehend aus Fibroblasten, Kollagen und elastischen Fasern¹⁵, und die innere Zelle-reiche Kambium Schicht in direktem Kontakt mit der Knochenoberfläche. Die Kambium Schicht enthält eine gemischten Zellpopulation in erster Linie Fibroblasten¹⁶, Osteoblasten¹⁷, perizyten¹⁸und einer kritischen Subpopulation identifiziert als MSCs^19,20,21. Die meisten Studien haben berichtet, dass PDCs sind vergleichbar, wenn nicht überlegen, Knochenmark-Stammzellen (bMSCs) im Knochen Heilung und Regeneration^22,23,24. Das Periost ist leicht zugänglich und zeigt hervorragende regenerative Wirkung. Jedoch haben einige Studien auf die Knochenhaut^25,26,27konzentriert.

Über Knochen-Reparatur beinhaltet die aktuelle klinische Praxis die Transplantation von periostalen Vorläuferzellen in unterstützende Gerüste verstärkt. Neuere Studien konzentrierten sich auf Erwerb von Stammzellen in defekten Regionen und Vorläuferzellen für Tissue Regeneration²⁰beschäftigt. Zahnärzte rechnen auch zukünftige Anwendung der parodontalen Knochenregeneration in parodontale Behandlungen und Zahnimplantate. Bezüglich der Entnahmestelle der Knochenhaut leicht durch allgemeine Zahnärzte geerntet werden kann. Günstig im Vergleich gegen Stromazellen Knochenmarkzellen, wie das Periost während routinemäßiger Oralchirurgie zugegriffen werden kann. Somit ist das Ziel dieser Studie, ein Protokoll für die Ernte PDCs zu etablieren und zur Beurteilung der Morphologie, Anlage, Rentabilität und Proliferation von Stammzellen menschlichen Periost.

Vitamin D-Metaboliten der in Vivo Knochen-Mineral dynamischen Gleichgewicht beeinträchtigen. Eine Studie berichtete, dass die 24R,25-(OH)₂D₃ aktive Form von Vitamin D für die osteoblastischen Differenzierung der menschlichen MSCs (hMSCs)²⁸unerlässlich. Knochen-Homöostase und Reparatur sind durch ein Netz von Vitamin D₃ Metaboliten geregelt welche, die 1,25-(Oh)₂D₃ (Calcitriol) das biologisch aktive und relevant bei der Regulierung der Knochengesundheit ist. Vitamin D₃ ist essentiell für Verkalkung²⁹. In einer Studie mit 2-d-alte Kunming weiße Mäuse Embryoid Körper in den Mäusen gezeigt, dass Vitamin C und Vitamin D-Präparate wirksam die Differenzierung der Osteoblasten ESC abgeleitet³⁰gefördert. Unter seinen anderen biologischen Aktivitäten stimuliert 1,25-(OH)₂D₃ die in Vitro Differenzierung von hMSCs zu Osteoblasten, die überwacht werden können, basierend auf dem Vormarsch in Enzym-Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) oder OCN gen Ausdruck.

Einige Studien haben eine Dosis-Wirkungs-Beziehung von kombinierten Behandlungen mit Vitamin C und 1,25-(OH)₂D₃ im menschlichen PDCs mit besonderem Schwerpunkt auf Knochen Gewebe-Engineering entdeckt. In dieser Studie untersuchen wir daher die optimalen Konzentrationen für die einzelnen oder kombinierten Behandlung von 1,25-(OH)₂D₃ und Vitamin C zur Induktion osteogene Differenzierung der menschlichen PDCs. Das Ziel dieses Protokolls ist es, festzustellen, ob eine Zellpopulation, die isoliert von der zahnärztlichen alveoläre Knochenhaut Zellen mit einer MSC-Phänotyp und ob diese Zellen in Kultur (in Vitro) erweitert und differenziert enthält, um das gewünschte Gewebe bilden . Darüber hinaus bewerten wir die Fähigkeit des PDCs, in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren. Der zweite Teil der Studie bewertet die Auswirkungen von Vitamin C und 10⁻¹⁰, 10⁻⁹, 10⁻⁸und 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ auf die knochenbildenden Aktivität des PDCs. Das primäre Ziel dieser Studie ist es, die Funktionen von Vitamin C und 1,25-(OH)₂D₃ zu bewerten, während die osteoblastischen Differenzierung des PDCs nach ALP Aktivität und Pro-osteogene Gene, wie ALP, Kollagen-1, OCN, BSP und CBFA1. Darüber hinaus bestimmt dieser Studie die optimale Osteoinduktiv Bedingungen für menschliche PDCs aufbauend auf diesen Erkenntnissen.

Protokoll

Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Review Board der Chang Gung Memorial Hospital genehmigt. Allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung.

(1) Gewebe-Vorbereitung

1. Ernten Sie die periostalen Gewebe von Patienten während der zahnärztlichen Chirurgie (Abbildung 1). Nehmen Sie nach der Klappe Reflexion unter örtlicher Betäubung ein Stück Knochenhaut Gewebe aus der Alveolarknochen mit einer periostalen Separator-³¹.
2. Nach der Ernte Lagern der periostalen Gewebe Scheiben von ca. 5 mm × 2 mm in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 300 U/mL Penicillin und 300 mg/mL Streptomycin. Übertragen Sie das Gewebe im Labor innerhalb von 24 h.
3. Die alveoläre periostalen gewebefragmente mit Skalpellen bis gut gehackt und die Beispiele in Abschnitt 0 Medium pflegen (bestehend aus 300 U/mL Penicillin und 300 mg/mL Streptomycin, α-MEM und 5 % fötalen Rinderserum [FBS]) kultiviert in einem Inkubator bei 37 ° C mit Hackfleisch befeuchtete Luft (5 % Kohlendioxid). Bereiten Sie im Inkubator ein Wasserbecken, Luftfeuchtigkeit beizubehalten.
4. Ändern Sie das Medium, nach 3 Tagen und zweimal die Woche danach.
5. Wenn die Zellen Subconfluence (80 %) erreicht haben, lassen Sie die adhärenten Zellen mit 200 µL 0.25 % Trypsin im Inkubator (37 ° C) für 3 min und dann verwenden Sie 4,5 mL Medium, um die Reaktion zu beenden.
6. Die Zellen wieder in frischen Durchgang 1 mittlere Platte (α-MEM, 10 % FBS, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin). Platte ist 5 × 10³ Zellen (wie von einem Hemocytometer gezählt).
7. Durchführen Sie jeder nachfolgende Passage nach der Zellen 80 % Zusammenfluss^{31 erreichen}.
   Hinweis: Am Anfang wird das Medium Orange-rot sein. Nach etwa drei Tagen sollte die mittlere Farbe zu einem gelblichen Farbton ändern. Die Verdopplungszeit der Zellen ist ungefähr 30 – 40 h, 7 Tage für 3 – 5 Generationen benötigen.
8. Kultur der isolierten PDCs in α-MEM ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL von Streptomycin in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂).
9. Zellwachstum täglich beobachten und das Wachstumsmedium zweimal pro Woche zu ersetzen. Verwenden Sie dritten bis fünften Generation Zellen für alle weiteren Experimente.

2. die Durchflusszytometrie

1. Ernte 1 × 10⁶ Zellen durch Trypsin-Verdauung:
   1. Fügen Sie 200 µL 0.25 % Trypsin. Verwenden Sie nach 3 min 4,5 mL Kulturmedium mit FBS kündigen die Reaktion von Trypsin und sammeln durch Zentrifugation (1500 u/min, 5 min, 22 ° C).
   2. Waschen Sie die Zelle Pellets dreimal mit 1 X DPBS. Die Zellen in 200 µL 1 X Permeabilisierung Pufferaufzuwirbeln. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
2. Untersuchen Sie die ausdrückliche oberflächenmarker ausgedrückt des PDCs durch Flow Cytometry (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung)³². Verwenden Sie monoklonaler Antikörper (MAb) gegen CD19 (Fluorescein erfolgt (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (Allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) und HLA-DR (FITC)³².
   1. Fügen Sie die Antikörper zu den Proben und Kultur im Dunkeln bei 4 ° C für 30 Minuten.
   2. Waschen Sie die Zellen mit 1 X DPBS dreimal.
   3. Die Zellen unter Verwendung von 2 % Formaldehyd zu beheben und mit Flow Cytometry Analyse³²fortfahren.

3. Handy-Anlage und Rentabilität mit knochenbildenden, Adipogenen und Chondrogenic Differenzierung

Differenzierung in den Zellen zu induzieren osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien durch Kultivierung der periostalen Zellen in allen drei Durchgängen auf sechs-Well-Platten mit spezifischen Differenzierung Medien.

1. Osteogene Differenzierung Kulturzellen Sie der in α-MEM bei einer Dichte von 5000 Zellen pro Bohrloch auf sechs Brunnen Kultur Platten.
   1. Am Zusammenfluss von 80 % zu erreichen, die Kulturzellen in Medien mit α-MEM, 5 % FBS, β-glycerophosphat (10 mM), 10⁻⁷ M Dexamethason (0,1 mM) und 5 mL Ascorbinsäure (100 Umm). Kultur die negative Kontrolle in Medien, bestehend aus α-MEM und 5 % FBS.
   2. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
   3. Bewerten Sie nach 4 Wochen das Potential der Zellen zu differenzieren in eine osteogene Abstammung durch Färbung der Zellen mittels einen von Kossa-Assay, der das Vorhandensein von verkalkten Ablagerungen in einer Kultur³³auszeichnet.
      1. Fügen Sie 10 % Formalin zur Befestigung. Innerhalb von 30 Minuten fügen Sie 5 % Silbernitrat und behandeln unter ultraviolettem (UV) Licht für 1 h bei Raumtemperatur.
      2. Fügen Sie 5 % Na₂SO₄ vier Zeiten, so dass 3 min für jede Reaktion. Schließlich waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser.
         Hinweis: Von Kossa Färbung ist ein Niederschlag Reaktion wo Silberionen und Phosphat reagieren in Gegenwart von sauren Material; Diese Färbung Technik ist nicht spezifisch für Kalzium. In dieser Studie, wenn die untersuchten Zellen mit Silbernitratlösung, Kalzium behandelt wurden – die sinkt bei starkem UV-Licht – wurde ersetzt durch Silber, die als metallisches Silber sichtbar wurde.
2. Zur adipogenen Differenzierung Kultur der Zellen bei einer Dichte von 5000 Zellen pro Bohrloch auf sechs Brunnen Kultur Platten mit α-MEM.
   1. Am Zusammenfluss von 80 % zu erreichen, die Kulturzellen in Medien mit α-MEM, 5 % FBS, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (100 mg/mL), 1 % Penicillin, 10⁻⁶ M Dexamethason (1 mM), Insulin (5 mg/mL) und Indometacin (60 mM).
   2. Kultur die negative Kontrolle in Medien, bestehend aus α-MEM und 5 % FBS.
   3. Nach 6 – 9 Wochen verwenden Öl Rot O zu beflecken Zellen und Lipid-Tropfen, wodurch die Bestimmung der Anwesenheit von adipogenen Differenzierung³³markieren:
      1. Fügen Sie 10 % Formalin zur Befestigung. Innerhalb von 30 min, färben die Zellen mit 0,5 % Öl Rot O bei Raumtemperatur für 10 min und dann waschen die Zellen dreimal mit 60 % Isopropanol für 3 min jedes Mal; Schließlich waschen Sie die Zellen mit destilliertem Wasser.
         Hinweis: Öl Rot O ein Lysochrome (fettlöslichen) diazo Farbstoff verwendet ist für die Färbung von neutralen Lipiden, in erster Linie Triacylglycerol und Lipoprotein-Cholesterin Ester. Der Farbstoff löst sich in den Lipid-Tröpfchen in der Zelle, die Lipid-Tropfen rot zu drehen.
3. Für eine Knorpelzelltransplantation Differenzierung, Zellkulturen auf sechs Brunnen Kultur Platten mit jeweils gut 5000 Zellen.
   1. Fügen Sie eine Differenzierung mittlere enthaltende α-MEM, 5 % FBS 10⁻⁷ M Dexamethason (0,1 mM), Natrium Pyruvat (100 µg/mL), Insulin-Transferrin-Selen-A (1 × ITS), transformierende Wachstumsfaktor-β (10 ng/mL) und 5 mL Ascorbinsäure (100 µM).
   2. Kultur die negative Kontrolle in Medien, bestehend aus α-MEM und 5 % FBS.
   3. Verwenden Sie nach 4 – 5 Wochen Alcian Blau Färbung um den sauren Polysacchariden wie Glykosaminoglykane oder bestimmte Arten von mucopolysacchariden im Knorpel der Zellen, um das Vorhandensein von Knorpelzelltransplantation Differenzierung³³bestimmen zu markieren.
      1. Fügen Sie 10 % Formalin zur Befestigung. Innerhalb von 30 min 3 % Essigsäure und 2 min für die Reaktion. Anschließend mit destilliertem Wasser waschen Sie dreimal, fügen Sie 1 % Alcian blau 8GX für 30 min inkubiert und dann mit destilliertem Wasser waschen. Zu guter Letzt fügen Sie 3 % Essigsäure und Wäsche für 3 min, und waschen Sie anschließend mit destilliertem Wasser zu beenden.
         Hinweis: Die Teile der Zelle, die speziell durch diese Farbe blau zu blau-grünen Fleck, nach Färbung und nennt man "Alcianophilic."

4. Auswirkungen von 25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃) auf Osteogenesis

1. P3, P5 PDCs in sechs Gruppen und Kultur auf 6-Well-Platten mit verschiedenen Nährmedien aufgeteilt:
2. negative Gruppe (α-MEM und 5 % FBS);
3. Vitamin C-Gruppe (α-MEM, 5 % FBS 10 mM β-glycerophosphat und 10⁻⁷ M Dexamethason + 100 Umm Vitamin C);
4. und 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ Gruppe (α-MEM, 5 % FBS, 10 mM β-glycerophosphat und 10⁻⁷ M Dexamethason + 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃).
5. Inkubator (37 ° C) in jede Vertiefung 2 mL des Mediums hinzu, und ändern Sie das Medium zweimal wöchentlich.

(5) reverse Transkription/Quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion

1. Nach 7 d der Osteoblasten Differenzierung, Isolieren der gesamte-RNS auf Eis mit einem kommerziellen Reagens (siehe Tabelle der Materialien):
   1. Fügen Sie 1 mL Reagenz isoliert, in jede Vertiefung. Fügen Sie 200 µL des Bromochloropropane und lassen Sie für 10 min, geschichtete RNA zu generieren und anschließend Zentrifugieren bei 10.000 u/min für 15 min bei 4 ° c
   2. Fügen Sie nach Zentrifugation 500 µL 2-Propanol 500 µL überstand enthaltende RNA hinzu. Überstürzen Sie sich die RNA auf dem Eis und ermöglichen Sie 15 min für die Reaktion zu.
   3. Zentrifugieren Sie nach dem Eingriff bei 12.000 u/min für 15 min bei 4 ° C, nach denen die RNA am unteren Ende der Röhre befindet. Anschließend entfernen Sie überstand mit 1 mL 75 % Alkohol zum Waschen und Zentrifugieren bei 7.500 u/min für 8 min bei 4 ° C.
   4. Nehmen Sie den überstand und einen Vakuum Konzentrator RNA von der Unterseite der Flüssigkeit produzieren. Erholen Sie sich mit Wasser.
2. Reverse Transkription die RNA (1 μg) mit avian Myeloblastosis Virus Reverse Transkriptase. Vorgesetzt der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) laufen bei 25 ° C für 10 min, gefolgt von 50 ° C für 60 min und dann 85 ° C für 5 min, Aufrechterhaltung schließlich bei 4 ° c
3. Erste-Strang komplementären DNA (cDNA) zu synthetisieren. Führen Sie quantitative PCR (qPCR) mit 5 μL von 01:10 verdünnt cDNA. Durchführung von quantitativen RT-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung der Zündkapseln für ALP, BSP, OCN, CBFA1 und Kollagen-1.
   Hinweis: Um DNA-Kontaminationen von Signalen zu vermeiden, wurden die vorwärts- und Sequenzen jede Grundierung auf verschiedenen Exons entwickelt.
4. Mit einem kommerziellen PCR-Meister ausführen qPCR mischen (siehe Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie die Thermocycler bei 50 ° C für 2 min von 95 ° C für 10 min gefolgt und dann 40 jeweils bei 95 ° C für 15 Zyklen s gefolgt von 60 ° C für 60 s.
   Hinweis: Das SYBR-Protokoll erfordert auch eine Schmelze Kurve Bühne, verlaufenden bei 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 60 s, und dann 95 ° C für 15 s.
5. Normalisieren die Zyklus-Schwellenwerte für ALP, BSP, CBFA1, Kollagen-1 und OCN, dass das Zimmermädchen gen GAPDH. ³⁴
6. Primer-Paare sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

(6) alkalische Phosphatase-Aktivität

1. Die ALP-Enzym-Aktivität der Zellen mit den zuvor beschriebenen Technik³⁵, die p- Nitrophenyl Phosphat in p- Nitrophenol konvertiert zu beurteilen; p- Nitrophenyl Phosphat ist ein Phosphatase-Substrat, das gelb, wenn von ALP, rezeptorsignals, wie bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt wird. Normalisieren die Summe p- Nitrophenol gebildet basierend auf die Gesamt-Protein, wie von der Bradford-Test bestimmt.
2. Vergleichen Sie die ALP-Aktivitäten des Steuerelements (α-MEM, 5 % FBS), Vitamin C (α-MEM, 5 % FBS, 10 mM β-glycerophosphat, 10⁻⁷ M Dexamethason + 100 Umm Vitamin C), 1,25-(OH)₂D₃ (α-MEM, 5 % FBS 10 mM β-glycerophosphat und 10⁻⁷ M Dexamethason + 10⁻⁸ M 1,25-(OH)₂D₃), und Vitamin C + 1,25-(OH)₂D₃ (α-MEM, 5 % FBS, 10 mM β-glycerophosphat, 10⁻⁷ M Dexamethason + 100 Umm Vitamin C +1,25-(OH)₂D₃) Gruppen nach 1, 2, 3 und 4 Woche der Kultur.
3. Führen Sie ein Protein Extraktionsverfahren auf Eis:
   1. Schaben Sie die Zellen von den 6-Well-Platten und 50 µL Lyse Puffer. Anschließend legen Sie die Zellen auf dem Eis für 30 min zu zerstören die Zellen und das Protein frei.
   2. Zentrifugieren Sie nach 30 min bei 13000 u/min bei 4 ° C für 15 Minuten. Nach Zentrifugation den überstand für die Lagerung zu extrahieren und zu verwenden.

Ergebnisse

Für alle quantitativen Assays werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Alle statistischen Analysen wurden durchgeführt mit der Student t-test. Insgesamt 34 Proben stammen, wobei das Durchschnittsalter der Teilnehmer von 48,1 ± 12,3 y. elf dieser Proben wurden von männlichen Patienten und 23 von weiblichen Patienten erhalten. Achtundzwanzig Proben stammen aus den Molaren Regionen und sechs aus den vorderen Regionen; 26 wurden von den Oberkiefer u...

Diskussion

Eine neu entwickelte therapeutische Modalität, nämlich Gewebetechnik mit MSCs, hat zahlreiche Vorteile. MSCs, die in verschiedenen Gewebetypen vorhanden sind, sind multipotente Zellen, die in einer Vielzahl von Funktionsgewebe mesodermalen Zellen³⁷ differenzieren können und andere Zellen wie Osteoblasten.

Das Periost dient als eine Nische für Vorläuferzellen und als reiche Gefäßsystem Lieferung für die Knochen umhüllt es³⁸. In unserer St...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt	Sigma	49752
35-mm culture dishes	Corning	430165
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
6  well plate	Corning	3516
Alkaline phosphatase	ABI	Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit	BioVision	K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase	Roche	10109118001
CD146	BD	561013
CD19	BD	560994
CD34	BD	560942
CD44	BD	561858
CD45	BD	561088
CD73	BD	561014
CD90	BD	561974
Cell banker1	ZEAOAQ	11888
core binding factor alpha-1	ABI	Hs00231692_m1
dexamethasone	Sigma	D4902
DPBS	Gibco	14190250
FBS	Gibco	26140-079
GAPDH	ABI	Hs99999905_m1
HLA-DR	BD	562008
indomethacin	Sigma	I7378
insulin	sigma	91077C
insulin–transferrin–selenium-A	Sigma	I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)	Life	4346907
MicroAmp optical adhesive film	Life	4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification	HyClone	SH30265.02
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Permeabilization buffer	eBioscience	00-8333-56
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
STRO-1	BioLegend	340103
SYBER Green PCR Master Mix	AppliedBiosystems	4309155
TaqMan Master Mix	Life	4304437
transforming growth factor-β	Sigma	T7039
Trizol reagent (for RNA isolation)	Life	15596018
β-glycerophosphate	Sigma	G9422
collagen-1	Invitrogen	forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
		reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN	Invitrogen	forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
		reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP	Invitrogen	forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
		reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers