JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz mRNA ifade biyolojik kapaklarini türetilmiş hücre (PDC) vitamin C (C vitamini) ve 1,25-dihidroksi vitamin D [1,25-(OH)2D3] tarafından indüklenen araştırmak için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, PDC osteocytes, kondrosit ve adiposit ayırt etmek yeteneği değerlendirmek.

Özet

Mezenkimal Kök hücre (MSCs) çeşitli dokularda ve dokusunu da dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipe ayrılır. MSCs diş kaynaklar arasında kapaklarini MSCs cambium katmanında içerecek şekilde belirlenmiştir kolayca erişilebilir bir doku olduğunu. Ancak, bu kaynak henüz yaygın olarak araştırılmamıştır.

D vitamini3 ve 1,25-(OH)2D3 MSCs vitro farklılaşma dokusunu içine uyarmak için gösterdi. Buna ek olarak, C vitamini kollajen oluşumu ve kemik hücre büyümesini kolaylaştırır. Ancak, hiçbir çalışma henüz MSCs D vitamini3 ve C vitamini etkilerini araştırmış.

Burada, insan alveoler kapaklarini MSCs izole bir yöntem mevcut ve 1,25-(OH)2D3 bu hücrelerde bir osteoindüktif etki gösterirler hipotez inceleyin. Ayrıca insan alveoler kapaklarini MSCs varlığında araştırmak ve kök hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirmek. (Kontrol) olarak C vitamini yeteneği ve 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8ve 10−7 M) anahtar mRNA biyolojik olarak değiştirmek için çeşitli konsantrasyonları değerlendirmek için alkalen fosfataz (ALP), izole MSCs mRNA ifade kemik sialoprotein (BSP), çekirdek bağlama faktör Alfa-1 (CBFA1), kollajen-1 ve osteokalsin (OCN) ölçülen gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanarak.

Giriş

Her ne kadar son yıllarda çok sayıda ilgili teknikleri geliştirilmiştir, birden fazla kısıtlamaları tarafından sınırlı ve gerekli imar ölçüde kez mümkün değildir tahmin imar kalır kemik. Sert doku büyütme olumlu bir uzun vadeli başarı oranı yanı sıra estetik ve fonksiyonel hedeflere ulaşmak için gereklidir. Tür yordamlar için yaygın olarak kullanılan yöntemleri otojen ve allojenik Kemik greftleme, ksenografi ve alloplastic Kemik greftleme içerir. Kemik grefti çeşitli türleri arasında otojen kemik grefti en etkili olarak kabul edilir. Ancak, donör sitesi morbidite, güvenliği aşılan vascularity ve sınırlı doku kullanılabilirlik1 otojen Kemik greftleme için büyük dezavantaj olmuştur. Buna ek olarak, allojenik kemik grefti ve xenografts hastalık iletim ile ilişkili bulunmuştur. Şu anda, sentetik kemik grefti yaygın olarak bu sorunları gidermek için kullanılır. Ancak, Osteojenik potansiyelini onların eksikliği ile klinik sonuçlar yaygın olarak çeşitli var. Selüloz gibi malzemeler birim dalgalanma, enfeksiyon ve gücü eksikliği ile ilişkili olan.

Doku Mühendisliği kullanarak kemik büyütme büyük ilgi üretti. Bu teknikte Mezenkimal Kök hücre (MSCs) başlangıçta osteoblast farklılaşma, tanıtmak için hangi o zaman kemik kaybı kemik onarım elde etmek için siteye nakledilen kullanılır. Bu yordamı şu anda hücre tedavisi uygulanır. Kemik rekonstrüksiyonu doku sınırlı bir miktarda çıkartarak elde diğer yöntemlere göre daha basit ve daha az invazif var.

MSCs potansiyel rolü hücre tabanlı terapiler diş yenilenme amaçlı için bir araç olarak çeşitli araştırma grupları arasında ortaya çıkan bir ilgi vardır. Çalışmalar MSCs doku aşağıdaki türlerden farklılaşmış doğruladı: kemik iliği, yağ, sinovyal membran, pericyte, Trabeküler kemik, insan göbek kordonu ve diş dokuları2,3. Kemik iliği, yağ dokusu ve diş dokuları MSCs ortak kaynakları içerir. Yağ doku ve kemik iliği elde MSCs ile karşılaştırıldığında, diş kök hücrelerin kolay erişilebilirlik ve daha az morbidite hasat sonrası avantajları. Embriyonik kök hücreleri ile karşılaştırıldığında, diş dokusundan elde edilen MSCs nonimmunogenic görünür ve karmaşık etik kaygılar3ile ilişkili değildir.

2006'da, uluslararası toplum hücresel tedavi için MSCs belirlemek için aşağıdaki standartları kullanan önerilen: ilk olarak, MSCs plastik için ekleme yeteneğine sahip olması gerekir. İkinci olarak, MSCs CD105, CD73 ve CD90 yüzey antijenleri için pozitif ve negatif işaretçileri monositler, makrofajlar ve B hücreleri hematopoetik antijenleri CD45 ve CD344yanı sıra için olması gerekir. Son bir ölçüt olarak MSCs hücreleri vitro farklılaştırma standart koşullar altında aşağıdaki üç tür içine ayırt etmek gerekir: dokusunu, adipositler ve kondrosit4. Bugüne kadar altı tür insan diş kök hücre izole karakterize ve. Birinci tip insan hamuru dokusundan izole edildi ve postnatal diş pulp kök hücre5olarak adlandırdığı. Daha sonra diş MSCs üç ek tür izole ve karakterize: kök hücrelerden pullu yaprak döken dişler6, periodontal ligament7ve apikal papilla8. Daha yakın zamanlarda, diş kökü elde edilen9, dişeti doku kaynaklı10, diş bud kök cells(DBSCs)11ve periapical kist MSCs (hPCy-MSCs)12 de tespit edilmiştir.

Friedenstein MSCs13tanımlamak için ilk oldu. Hangi onlar rejeneratif yordamlar10için ideal aday olduğunu göstermektedir MSCs yüksek proliferasyon potansiyel sergi ve nakledilen önce ayırt etmek için kullanılabilirler.

Her ne kadar çoğu çalışmalar kemik iliği kök hücre kaynağı olarak kullanmış, kapaklarini kaynaklı hücreler (PDC) de son zamanlarda14kullandık. Kapaklarini kemik iliği olduğundan daha kolay erişilebilir. Bu nedenle, Bu teknikte, biz alveoler kapaklarini ameliyat sırasında ek kesiler ihtiyacını ortadan kaldırmak için ve segmanlar morbidite hastaların azaltmak için kullanın. Kapaklarini formları uzun kemiklerin dış astar ve iki ayrı katmanlar oluşur bağ dokusu olduğunu: fibroblastlar, kollajen ve Elastik lifler15ve iç hücre zengini cambium katman doğrudan temas dış fibröz tabaka oluşur kemik yüzeyi ile. Cambium katman içeren karma hücre nüfus, öncelikle fibroblastlar16, dokusunu17, perisitlerden18ve MSCs19,20,21tanımlanan kritik bir subpopulation. Çoğu çalışmalar PDC'ler karşılaştırılabilir değilse üstün, kemik iliği elde edilen kök hücre (bMSCs) kemik iyileşmesi ve rejenerasyon22,23,24bildirdi. Kapaklarini kolayca ulaşılabilir ve mükemmel rejeneratif etkinliğini sergiler. Ancak, birkaç çalışmalar kapaklarini25,26,27tarihinde odaklanmıştır.

Kemik onarımı ile ilgili destekleyici iskele içinde güçlendirilmiş periosteal progenitör hücre nakli mevcut klinik uygulama içerir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda arızalı bölgeleri kök hücre alınıyor ve progenitör hücre doku rejenerasyonu20istihdam odaklı olması. Diş hekimleri de periodontal kemik rejenerasyon periodontal tedavi ve Diş implantları yönelik uygulama tahmin. Donör sitesi ile ilgili kapaklarini kolayca genel diş cerrahları tarafından hasat edilebilir. Kapaklarini-ebilmek var olmak giriş sırasında rutin ağız cerrahisi gibi bu olumlu iliği stromal hücreler karşı karşılaştırır. Böylece, bu çalışmanın amacı PDC'ler hasat için bir protokol oluşturmak için ve Morfoloji, ek, canlılık ve insan kapaklarini kök hücrelerin çoğalması değerlendirmek için olduğunu.

D vitamini metabolitleri vivo içinde kemik mineral Dinamik denge etkiler. Bir çalışmada 24R,25-(OH)2D3 etkin form d vitamini insan MSCs (hMSCs)28osteoblastik farklılaşması için gerekli olduğunu bildirdi. Kemik homeostazı ve onarım D vitamini3 metabolitleri, hangi 1,25-(OH)2D3 (kalsitriol) en biyolojik olarak aktif ve tür Kemik sağlığı ile ilgili olan bir şebeke tarafından düzenlenmektedir. D vitamini3 kalsifikasyon29için esastır. 2-d-yaşlı Kunming beyaz fare kullanarak bir çalışma içinde C vitamini ve D vitamini takviyeleri etkili ESC kaynaklı dokusunu30farklılaşma terfi embryoid cesetleri farelerde belirtti. Diğer biyolojik faaliyetleri arasında 1,25-(OH)2D3 hMSCs için izlenebilir alkalen fosfataz (ALP) enzim aktivitesi veya OCN gen artış temel dokusunu, vitro farklılaşma uyarır. ifade.

Kaç çalışmalar insan PDC'ler kemik doku Mühendisliği özel bir odaklanma ile2D3 C vitamini ve 1,25-(OH) ile kombine tedaviler bir doz-yanıt ilişkisi tespit etti. Bu nedenle, bu çalışmada, 1,25-(OH)2D3 tek veya kombine tedavi için en uygun konsantrasyonlarda ve C vitamini insan PDC'ler Osteojenik farklılaşma inducing için inceleyin. Bu protokol diş alveoler kapaklarini izole bir hücre nüfus hücreleri bir MSC fenotip ve olup bu hücreler kültür (vitro) genişletilmiş olabilir ve istenilen doku oluşturmak için ayrıştırılan içerip içermediğini belirlemek için hedeftir . Buna ek olarak, PDC osteocytes, kondrosit ve adiposit ayırt etmek yeteneği değerlendirmek. Çalışmanın ikinci bölümünde C vitamini ve 10−10, 10−9, 10−8ve 10−7 M 1,25-(OH)2D3 PDC'ler Osteojenik aktivite üzerine etkileri değerlendirir. Bu çalışmanın temel amacı PDC'ler osteoblastik farklılaşma ALP etkinlik ve ALP gibi pro Osteojenik genler tarafından sırasında C vitamini ve 1,25-(OH)2D3 fonksiyonları değerlendirmek etmektir kollajen-1, OCN, BSP ve CBFA1. Buna ek olarak, bu çalışmada bu bulgularına dayanarak insan PDC için en uygun osteoindüktif koşulları belirler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Çalışma Protokolü kurumsal inceleme kurulu, Chang Gung Memorial Hastanesi tarafından kabul edildi. Tüm katılımcıların yazılı Onam sağlanan.

1. doku hazırlık

  1. Hastalar periosteal dokulardan diş ameliyatı sırasında (şekil 1) hasat. Lokal anestezi altında flep yansıma sonra periosteal ayırıcı31kullanarak alveolar kemik dokusundan kapaklarini bir parça alın.
  2. Hasat sonrası, yaklaşık 5 mm × 2 mm periosteal doku dilim Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile 300 U/mL penisilin ve 300 mg/mL streptomisin saklayın. 24 saat içinde laboratuvara dokular aktarın.
  3. Alveoler periosteal doku parçaları de kıyılmış ve geçiş 0 orta (300 U/mL penisilin ve 300 mg/mL streptomisin, α-MEM ve % 5 fetal sığır serum [FBS]) oluşan bir kuluçka ile 37 ° C'de kültürlü örneklerinde korumak kadar neşter ile kıyma oksijen hava (% 5 karbon dioksit). Kuluçka makinesine nem korumak için bir su Havzası hazırlayın.
  4. Orta 3 gün sonra ve haftada iki kez bundan sonra değiştirin.
  5. Hücreleri subconfluence (% 80) ulaşıldığında, yapışık hücreleri 200 µL % 0.25 tripsin 3 min için kuluçka (37 ° C) ile serbest bırakmak ve orta 4.5 mL tepki sonlandırmak için kullanın.
  6. Taze geçiş 1 orta tekrar hücrelerde plaka (α-MEM, % 10 FBS, 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin). 5 × 103 (bir hemasitometre tarafından sayılır gibi) hücreleri plakadır.
  7. Hücrelerin % 80 izdiham31elde sonra her sonraki geçişi gerçekleştirin.
    Not: Başlangıçta, orta turuncu kırmızı olacaktır. Kabaca üç gün sonra orta renk sarımtırak bir renk doğru değiştirir. Hücrelerin katlama zaman yaklaşık 30-40 h, 7 gün 3-5 nesiller için ihtiyacı olduğunu.
  8. Kültür α-MEM izole PDC'ler % 10 ile desteklenmiş FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2).
  9. Hücre büyümesini her gün gözlemlemek ve büyüme orta haftada iki kez değiştirin. Üçüncü için beşinci kuşak hücreleri tüm diğer deneyler için kullanın.

2. Akış Sitometresi

  1. Tripsin sindirim ile hasat 1 × 106 hücreleri:
    1. 200 µL % 0.25 tripsin ekleyin. 3 dakika sonra kültür FBS içeren orta 4.5 mL tripsin tepki bitirmek ve Santrifüjü (1500 d/d, 5 dk, 22 ° C) toplamak için kullanın.
    2. Üç kez 1 x DPBS kullanarak hücre topakları yıkayın. 200 µL 1 x permeabilization arabellekhücrelerde resuspend. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
  2. PDC ile Akış Sitometresi (floresan aktif hücre sıralama)32, ifade ifade yüzey işaretleyicileri inceleyin. CD19 karşı Monoklonal antikor (MAb) kullanın (floresein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) ve HLA-DR (FITC)32.
    1. Örnekler ve kültür için 30 dk 4 ° C'de karanlıkta antikorlar ekleyin.
    2. 1 x DPBS hücrelerle üç kez yıkayın.
    3. % 2 formaldehit kullanarak hücreleri tamir ve Akış Sitometresi Analizi32ile devam edin.

3. ek ve canlılığı ile Osteojenik, Adipojenik ve Chondrogenic farklılaşma hücre

Hücrelere farklılaşma neden Osteojenik, Adipojenik ve altı-şey plakaları belirli farklılaşma medya ile tüm üç pasajlar periosteal hücrelerde kültür tarafından chondrogenic soy.

  1. Osteojenik farklılaşma için α-MEM de altı-şey kültür plakaları başına 5000 hücre yoğunluğu, hücrelerde kültür.
    1. % 80 izdiham ulaşmak, α-MEM, % 5 içeren medya hücrelerde kültür FBS, β-gliserofosfat (10 mM), 10−7 M deksametazon (0,1 mM) ve askorbik asit 5 mL (100 uM). α-MEM ve %5 oluşan medya negatif kontrol kültür FBS.
    2. Medya haftada iki kez değiştirin.
    3. 4 hafta sonra Osteojenik bir soy kireçlenmiş bir kültür33yataklarında varlığı ayıran bir von Kossa tahlil kullanarak hücreleri boyama tarafından ayırt etmek için hücreleri potansiyelini değerlendirmek.
      1. Sabitleme için % 10 formalin ekleyin. 30 dk içinde %5 gümüş nitrat ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için ultraviyole (UV) ışık altında tedavi etmek.
      2. 4 dört kez %5 Na2ekleyin, 3 dk her reaksiyon için izin. Son olarak, hücre iki kez distile su ile yıkayın.
        Not: Von Kossa boyama bir yağış nerede gümüş iyonları ve fosfat huzurunda asidik malzeme tepki tepkidir; Bu boyama tekniği için kalsiyum özgü değildir. Bu çalışmada incelenen hücreleri gümüş nitrat çözümü, kalsiyum ile tedavi edildi, — hangi güçlü UV ışığıyla azaltılmış — Metalik Gümüş görünür oldu gümüş tarafından değiştirildi.
  2. Adipojenik farklılaşma için α-MEM içeren altı-şey kültür Tabaklarda iyi başına 5000 hücre yoğunluğu, hücre kültür.
    1. % 80 izdiham ulaşmak, hücreleri içeren α-MEM, %5 FBS, 0,5 mM 3-İzobütil-1-methylxanthine (100 mg/mL), %1 penisilin, medya kültür 10−6 M deksametazon (1 mM), insülin (5 mg/mL) ve İndometazin (60 mM).
    2. α-MEM ve %5 oluşan medya negatif kontrol kültür FBS.
    3. 6 – 9 hafta sonra kullanmak hücreleri leke ve lipid düşer, böylece Adipojenik farklılaşma33varlığı belirleme vurgulamak için kırmızı O petrol:
      1. Sabitleme için % 10 formalin ekleyin. 30 dk içinde leke % 0.5 hücrelerle, oda sıcaklığında 10 dakika kırmızı O petrol ve sonra yıkayın bulunduğu hücreleri % 60 isopropanol 3 dk için üç kez her zaman; son olarak, hücre distile su ile yıkayın.
        Not: Kırmızı O nötr lipitler boyama için kullanılan bir lysochrome (yağda çözünen) için boya petrol öncelikle triacylglycerol, lipoprotein ve kolesterol esterleri. Boya lipid damlacıkları kırmızıya döndüğü lipid damlacıkları hücresinde, çözünür.
  3. Kondrosit farklılaşma için kültür hücreleri ile her şey 5000 hücreleri içeren altı-şey kültür Tabaklarda.
    1. Bir farklılaşma orta içeren α-MEM, %5 FBS, 10−7 M deksametazon (0,1 mM), sodyum pyruvate (100 µg/mL), insülin-transferrin-selenyum-A (1 × Its), dönüştürme büyüme faktörü-β (10 ng/mL) ve askorbik asit (100 µM) 5 mL ekleyin.
    2. α-MEM ve %5 oluşan medya negatif kontrol kültür FBS.
    3. 4-5 hafta sonra Alcian glikozaminoglikan veya mukopolisakkarid, kıkırdak hücrelerinin kondrosit farklılaşma33varlığını belirlemek için bazı türleri gibi asidik polisakkaritler vurgulamak için boyama mavi kullanın.
      1. Sabitleme için % 10 formalin ekleyin. 30 dk içinde %3 Asetik asit ekleyin ve reaksiyon için 2 dk. Daha sonra üç kez distile su ile yıkayın, %1 Alcian mavi 8GX için 30 dakika inkübe ekleyin ve sonra distile su ile yıkayın. Son olarak, %3 Asetik asit ekleyip 3 dk. için yıkama ve o zaman bitirmek için distile su ile yıkayın.
        Not: özellikle mavi-yeşil mavi haline bu boya leke hücre bölümlerini sonra boyama ve "alcianophilic." denir

4. Osteogenesis üzerinde 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) etkileri

  1. P3 P5 PDC için altı grupları ve kültür çeşitli kültür medya ile 6-şey Tabaklarda bölün:
  2. negatif grup (α-MEM ve %5 FBS);
  3. C vitamini grubu (α-MEM, %5 FBS, 10 mM β-gliserofosfat ve 10−7 M deksametazon + 100 şey C vitamini);
  4. ve 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grup (α-MEM, %5 FBS, 10 mM β-gliserofosfat ve 10−7 M deksametazon + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Her şey bir kuluçka (37 ° C) orta 2 mL ekleyin ve orta her hafta iki kez değiştirin.

5. ters transkripsiyon/nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu

  1. Ticari bir reaktif kullanarak buz üzerinde toplam RNA osteoblast farklılaşma 7 d sonra yalıtmak ( Tablo malzemelerigörmek):
    1. Yalıtım reaktif 1 mL her şey için ekleyin. Bromochloropropane 200 µL ekleyin ve katmanlı RNA oluşturmak 10 dakikadır bırakın ve 4 ° C'de 15 dakika 10.000 rpm'de santrifüj kapasitesi
    2. Santrifüjü sonra 2-propanol 500 µL süpernatant içeren RNA'ın 500 µL ekleyin. Buz üzerinde RNA çökelti ve reaksiyon için 15 dk bekleyin.
    3. İşlemden sonra sonra RNA tüp alt kısmında yer alır 4 ° C'de 15 dakika 12.000 rpm'de santrifüj kapasitesi. Daha sonra süpernatant yıkama için 1 mL % 75 alkol kullanarak kaldırın ve 7.500 RPM 4 ° c 8 dk santrifüj kapasitesi
    4. Süpernatant kaldırın ve RNA sıvı derinliklerinden üretmek için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Su ile yeniden elde etmek.
  2. Ters uyarlamak RNA (1 μg) kuş myeloblastosis virüs transkriptaz kullanarak. Son olarak 4 ° C'de muhafaza önce Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) 10 min 50 ° C tarafından takip için 25 ° C'de çalıştırmak için 60 dk ve 5 min için 85 ° C için ayarla
  3. İlk-strand Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentez. Kantitatif PCR (qPCR) 5 kullanarak gerçekleştirmek μL 1:10 cDNA seyreltilmiş. Kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) kuralları ALP, BSP, OCN, CBFA1 ve kollajen-1 için primerler kullanılarak.
    Not: Sinyalleri tarafından DNA kirlenmesini önlemek için her astar ileriye ve geriye doğru dizisi ayrı ekzonlar dizayn edilmiştir.
  4. QPCR ticari bir PCR Master kullanarak gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) üretici yönergelerine uygun olarak karıştırın. Termal cycler 50 ° C'de 2 dk 10 min için 95 ° C tarafından takip ve sonra 40 her 15 95 ° C'de döngüleri için ayarlama s takip 60 60 ° c s.
    Not: SYBR iletişim kuralı da 15 95 ° C'de çalıştırmak bir erime eğrisi sahne gerektirir s, 60 ° C 60 s ve 95 ° C 15 s.
  5. Döngüsü eşik değerleri normalize ALP, BSP, CBFA1, kollajen-1 ve OCN temizlik gen GAPDH olan için. 34
  6. Astar çiftleri Malzemeler tablolistelenir.

6. alkalen fosfataz aktivitesi

  1. ALP enzim aktivitesi p- nitrophenol için p- nitrophenyl fosfat dönüştürür yukarıda açıklanan tekniği35kullanarak hücre değerlendirmek; p- nitrophenyl fosfat 405 nm dalga boyu belirlenen ALP tarafından dephosphorylated zaman sarı döner bir fosfataz substrat var. Toplam normalize p- nitrophenol oluşan toplam protein üzerinde Bradford tahlil tarafından belirlenen göre.
  2. Denetim ALP faaliyetlerinin karşılaştırın (α-MEM, % 5 FBS), C vitamini (α-MEM, % 5 FBS, 10 mM β-gliserofosfat, 10−7 M deksametazon + 100 şey C vitamini), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, %5 FBS, 10 mM β-gliserofosfat ve 10−7 M deksametazon + 10−8 M 1,25-(OH)2D3) ve C vitamini + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, %5 FBS, 10 mM β-gliserofosfat, 10−7 M deksametazon + 100 şey C vitamini +1,25-(OH)2D3) gruplar kültür 1, 2, 3 ve 4 hafta sonra.
  3. Buzda bir protein çıkarma yordamı uygulayın:
    1. 6-şey plakaları hücrelerden scrape ve 50 µL lizis arabelleği ekleyin. Daha sonra hücreler hücreleri yok etmek ve protein ücretsiz 30 min için buz üzerine yerleştirin.
    2. 30 dakika sonra santrifüj kapasitesi 13000 RPM 15dk için 4 ° C'de. Santrifüjü sonra süpernatant depolama için hulâsa ve kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tüm nicel deneyleri için verileri ortalama ± standart sapma (SD) sunulmaktadır. Tüm İstatistiksel analizler öğrencinin tkullanılarak gerçekleştirilmiştir-test. Toplamda, 34 örnekleri katılımcı 48.1 yaş ortalaması ile elde edilmiştir erkek ve kadın hastaların 23 üzerinden elde edilen ± bu örneklerin 12.3 y. 11. Yirmi sekiz örnekleri molar bölgeler ve altı ön bölgelerden elde edilmiştir; 26 üst çene ve çene 8 elde. Diş prosedür ve kültürü aras?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Son zamanlarda gelişmiş bir tedavi yöntemidir, yani doku MSCs, gerektiren mühendislik sayısız avantajı vardır. MSCs, çeşitli doku tipleri içinde var olmayan, fonksiyonel Mezodermal doku hücreleri37 çeşitli içine ayırabilirsiniz multipotent hücreleri ve dokusunu gibi diğer hücreleri vardır.

Bir niş progenitör hücrelerin kapaklarini görür ve kemik için zengin damarlara kaynağı olarak38zarf. 34 incelenen örnekleri, bizim...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Çalışma Protokolü klinik araştırma, Chang Gung Memorial Hastanesi için (IRB99-1828B, 100-3019 C, 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B ve 103-4223 C) kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 ve NMRPG3C0151) tarafından desteklenmiştir. Bu el yazması Wallace akademik düzenleyerek düzenlendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium saltSigma49752
35-mm culture dishesCorning430165
3-isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
6  well plateCorning3516
Alkaline phosphataseABIHs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay KitBioVisionK412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptaseRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
Cell banker1ZEAOAQ11888
core binding factor alpha-1ABIHs00231692_m1
dexamethasoneSigmaD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD562008
indomethacinSigmaI7378
insulinsigma91077C
insulin–transferrin–selenium-ASigmaI1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)Life4346907
MicroAmp optical adhesive filmLife4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha ModificationHyCloneSH30265.02
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Permeabilization buffereBioscience00-8333-56
Sodium pyruvateGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixAppliedBiosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
transforming growth factor-βSigmaT7039 
Trizol reagent (for RNA isolation)Life15596018
β-glycerophosphateSigmaG9422
collagen-1Invitrogenforward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCNInvitrogenforward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSPInvitrogenforward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

Referanslar

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79(2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksorunu 135alveoler kapaklariniMezenkimal K k h cre125 OH 2D3D vitamini3kalsitriolkapaklarini

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır