Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Resumo

Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)₂D₃]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Resumo

Células-tronco mesenquimais (MSCs) estão presentes em uma variedade de tecidos e pode ser diferenciadas em vários tipos de células, incluindo os osteoblastos. Entre as fontes dentais de MSCs, o periósteo é um tecido facilmente acessível, que foi identificado para conter MSCs na camada do cambium. No entanto, esta fonte ainda não foi amplamente estudada.

Vitamina D₃ e 1,25-(OH)₂D₃ foram demonstradas para estimular a diferenciação em vitro de MSCs em osteoblastos. Além disso, vitamina C facilita o crescimento de células de formação e osso de colágeno. No entanto, nenhum estudo ainda investigou os efeitos da vitamina D₃ e vitamina C no MSCs.

Aqui, apresentamos um método de isolar o MSCs do periósteo alveolar humano e examinar a hipótese de que 1,25-(OH)₂D₃ podem exercer um efeito osteoindutivo nessas células. Podemos também investigar a presença de MSCs no periósteo alveolar humano e avaliar a proliferação e a adesão de células-tronco. Para avaliar a capacidade da vitamina C (como um controle) e as diferentes concentrações de 1,25-(OH)₂D₃ (10⁻¹⁰, 10⁻⁹, 10⁻⁸e 10⁻⁷ M) para alterar a chave biomarcadores de mRNA em expressão de RNAm de MSCs isoladas de fosfatase alcalina (FAL ou ALP), osso sialoprotein (BSP), ligação núcleo fator alfa-1 (CBFA1), 1-colágeno e osteocalcina (OCN) são medidos usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR).

Introdução

Apesar de inúmeras técnicas relevantes têm sido desenvolvidas nos últimos anos, osso restos de reconstrução limitado por várias restrições e estimar que a extensão da reconstrução necessária muitas vezes é impossível. Aumento do tecido duro é necessário para alcançar objetivos estéticos e funcionais, além de uma taxa de sucesso a longo prazo favoráveis. Métodos comumente utilizados para tais procedimentos incluem enxerto ósseo autólogo e alogênico, Xeno e aloplásticos transplante de osso. Entre os vários tipos de enxerto ósseo, enxertos ósseos autógenos são considerados os mais eficazes. Entretanto, a morbidez do local doador, vascularização comprometida e tecido limitada disponibilidade¹ foram grandes inconvenientes para enxerto ósseo autógeno. Além disso, enxertos ósseos alogênico e xenografts têm sido associados com a transmissão da doença. Atualmente, enxertos sintéticos são amplamente utilizados para resolver estes problemas. No entanto, com sua falta de potencial osteogênico, desfechos clínicos têm variado amplamente. Materiais, tais como celulose estão associados com a flutuação do volume, infecção e falta de força.

Aumento do osso, usando a engenharia de tecidos tem gerado um interesse considerável. Nesta técnica, as células-tronco mesenquimais (MSCs) inicialmente são utilizadas para promover a diferenciação de osteoblastos, que em seguida são transplantadas para o local da perda óssea para alcançar a reparação óssea. Este procedimento é aplicado atualmente em terapia celular. Alcançar a reconstrução óssea extraindo uma quantidade limitada de tecido é mais simples e menos invasivo em comparação com outros métodos.

O papel potencial do MSCs como uma ferramenta para terapias baseadas em células destinadas a regeneração dentária é um interesse emergente entre vários grupos de investigação. Estudos têm confirmado que MSCs podem ser diferenciados entre os seguintes tipos de tecido: medula óssea, membrana sinovial, tecido adiposa, Pericito, osso trabecular, humano de cordão umbilical e tecidos dentais^2,3. Fontes comuns de MSCs incluem a medula óssea, tecido adiposo e tecidos dentais. Comparado com MSCs derivadas de tecido adiposo e da medula óssea, as vantagens das células-tronco dentárias são de fácil acessibilidade e menor morbidade após a colheita. Em comparação com células-tronco embrionárias, MSCs derivados de tecidos dentários aparecem nonimmunogenic e não estão associados com preocupações éticas complexas³.

Em 2006, a sociedade internacional de terapia celular recomendado usando as seguintes normas para identificar MSCs: primeiro, MSCs devem ser capazes de anexar ao plástico. Em segundo lugar, MSCs devem ser positivo para os antígenos de superfície CD105, CD73 e CD90 e negativo para os marcadores de monócitos, macrófagos e células B, além dos antígenos hematopoiéticos CD45 e CD34⁴. Como um critério final, MSCs devem ser capazes de se diferenciar em três tipos de células sob condições padrão de diferenciação em vitro : osteoblastos, condrócitos e adipócitos⁴. Até à data, seis tipos de células-tronco dentais humanas foram isolados e caracterizados. O primeiro tipo foi isolado do tecido pulpar humano e denominadas de células-tronco de polpa dentária pós-natal⁵. Posteriormente, três tipos adicionais do MSCs dentais foram isolados e caracterizados: células-tronco de dentes decíduos esfoliada⁶, o ligamento periodontal⁷e a papila apical⁸. Mais recentemente, derivado de folículo dental⁹, derivado de tecido gengival¹⁰, broto dental haste cells(DBSCs)¹¹e cisto periapical MSCs (hPCy-MSCs)¹² também foram identificados.

Friedenstein foi o primeiro a definir MSCs¹³. MSCs apresentam uma elevado potencial de proliferação e podem ser manipulados para diferenciar-se antes de ser transplantado, o que sugere que eles são candidatos ideais para procedimentos regenerativos¹⁰.

Embora a maioria dos estudos usou como fonte de células-tronco da medula óssea, células derivadas de periósteo (PDCs) também têm sido usados recentemente¹⁴. O periósteo é mais facilmente acessível, que é a medula óssea. Portanto, nesta técnica, vamos usar o periósteo alveolar para eliminar a necessidade de incisões adicionais durante a cirurgia e reduzir a morbidade pós-cirúrgicas em pacientes. O periósteo é o tecido conjuntivo que forma o revestimento exterior de ossos longos e é composto por duas camadas distintas: a camada exterior fibrosa é composto por fibroblastos, colágeno e fibras elásticas¹⁵e a camada interna do cambium célula rica em contato direto com a superfície óssea. A camada do cambium contém uma população de mistura de células, principalmente fibroblastos¹⁶, osteoblastos¹⁷, pericitos¹⁸e uma subpopulação crítica identificado como MSCs^19,20,21. A maioria dos estudos têm relatado que PDCs são comparáveis, se não superior, a medula óssea-derivado células-tronco (bMSCs) em osso cura e regeneração^22,23,24. O periósteo é facilmente acessível e apresenta excelente eficácia regenerativa. No entanto, poucos estudos têm incidido sobre o periósteo^25,26,27.

Em matéria de reparação óssea, a prática clínica atual envolve o transplante de células progenitoras periosteal amplificado dentro apoio andaimes. Estudos recentes têm-se centrado na aquisição de células-tronco em regiões com defeito e empregando células progenitoras para regeneração de tecido²⁰. Dentistas também antecipam a aplicação futura de regeneração óssea periodontal em implantes dentários e tratamentos periodontais. Sobre o site do doador, o periósteo pode ser facilmente colhido por cirurgiões-dentistas gerais. Isto compara-se favoravelmente contra células do estroma da medula, como o periósteo pode ser acessado durante cirurgia oral de rotina. Assim, o objetivo deste estudo é estabelecer um protocolo para a colheita PDCs e para avaliar a morfologia, apego, viabilidade e proliferação de células-tronco humanas periósteo.

Metabólitos de vitamina D afetam na vivo mineral óssea equilíbrio dinâmico. Um estudo relatou que o 24R,25-(OH) o₂D₃ a forma ativa da vitamina D é essencial para a diferenciação osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)²⁸. Homeostase óssea e reparação são regulados por uma rede de vitamina D₃ metabólitos, dos quais 1,25-(OH)₂D₃ (calcitriol) é o mais biologicamente ativo e relevante na regulação da saúde óssea. Vitamina D₃ é essencial para a calcificação²⁹. Em um estudo utilizando ratos de Kunming branco 2-d-old, os corpos do embryoid nos ratos indicaram que suplementos de vitamina C e vitamina D efetivamente promovido a diferenciação de osteoblastos ESC-derivado de³⁰. Entre suas outras atividades biológicas, 1,25-(OH)₂, D₃ estimula a diferenciação em vitro de hMSCs de osteoblastos, que podem ser monitorados com base no aumento na atividade da enzima fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ou gene OCN expressão.

Alguns estudos detectaram uma relação dose-resposta de tratamentos combinados com vitamina C e 1,25-(OH)₂D₃ em PDCs humanos com um foco particular na engenharia de tecido ósseo. Portanto, neste estudo, examinamos as concentrações ideais para tratamento simples ou combinado de 1,25-(OH)₂D₃ e vitamina C para induzir a diferenciação osteogênica de PDCs humanas. O objetivo do presente protocolo é determinar se uma população de células isolada do periósteo alveolar dental contém células com um fenótipo MSC e se essas células podem ser expandidas em cultura (em vitro) e diferenciadas para formar o tecido desejado . Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. A segunda parte do estudo avalia os efeitos da vitamina C e 10⁻¹⁰, 10⁻⁹, 10⁻⁸e 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ sobre a atividade osteogênica do PDC. O principal objetivo deste estudo é avaliar as funções da vitamina C e 1,25-(OH)₂D₃ durante a diferenciação osteoblástica de PDCs por atividade ALP e genes pro-osteogênica, tais como ALP, CBFA1, OCN, BSP e colágeno-1. Além disso, este estudo determina as condições de osteoindutora ideal para PDCs humanas com base nesses resultados.

Protocolo

O protocolo de estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital. Todos os participantes fornecido o consentimento informado por escrito.

1. tecido preparação

1. Colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dental (Figura 1). Após reflexão flap sob anestesia local, pegue um pedaço de tecido do periósteo do osso alveolar usando um separador periosteal³¹.
2. Após a colheita, armazene as fatias periosteal tecidos de aproximadamente 5 × 2 mm na salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) com 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de estreptomicina. Transferi os tecidos para o laboratório no prazo de 24 h.
3. Picar os fragmentos de tecido periosteal alveolar com bisturis até bem picada e manter as amostras em meio de passagem 0 (composto de 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de estreptomicina, α-MEM e 5% de soro fetal bovino [FBS]) cultivadas em uma incubadora a 37 ° C, com ar umidificado (5% de dióxido de carbono). Na incubadora, prepare uma bacia de água para manter a umidade.
4. Mude o meio, depois de 3 dias e duas vezes por semana depois disso.
5. Quando as células têm alcançado subconfluence (80%), liberar as células aderentes com 200 µ l de tripsina 0,25% na incubadora (37 ° C) por 3 min e então use 4,5 mL de meio para encerrar a reação.
6. As células novamente no meio de passagem fresco 1 da placa (α-MEM, 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Placa é 5 × 10³ células (como contados por um hemocytometer).
7. Execute cada passagem subsequente após as células alcançar 80% de confluência³¹.
   Nota: No início, o meio será vermelho alaranjado. Após cerca de três dias, a cor média deve mudar para um tom amarelado. O tempo de duplicação das células é aproximadamente 30 – 40 h, precisando de 7 dias para 3 – 5 gerações.
8. Cultura os PDCs isolados em α-MEM suplementado com 10% FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina em uma incubadora (37 ° C, 5% CO₂).
9. Observar o crescimento celular diariamente e substituir o meio de crescimento duas vezes por semana. Use células de terceiro a quinto-geração para tudo mais experiências.

2. fluxo Cytometry

1. Colheita de 1 × 10⁶ células através da digestão do trypsin:
   1. Adicione 200 µ l de tripsina 0,25%. Depois de 3 min, use 4,5 mL de meio de cultura contendo FBS para finalizar a reação de tripsina e recolher através de centrifugação (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
   2. Lave as pelotas de célula três vezes usando 1 x DPBS. Ressuspender as células em 200 µ l 1 x buffer de permeabilização. Conte as células com um hemocytometer.
2. Examine os marcadores de superfície expressados expressados dos PDCs através de fluxo cytometry (classificação de fluorescência-ativado da pilha)³². Uso de anticorpos monoclonais (MAb) contra CD19 (isotiocianato de fluoresceína (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) e HLA-DR (FITC)³².
   1. Adicione os anticorpos para as amostras e a cultura no escuro a 4 ° C por 30 min.
   2. Lave as células com 1 x DPBS três vezes.
   3. Consertar as células usando 2% de formaldeído e proceder com fluxo cytometry análise³².

3. penhora e viabilidade com osteogênica, Adipogenic e Chondrogenic de diferenciação de células

Induzir a diferenciação nas células em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic pelo cultivo as células do periósteo em todas as três passagens em seis poços placas com meios de diferenciação específica.

1. Para diferenciação osteogênica, cultura de células em α-MEM em uma densidade de 5000 células por poço em placas de cultura de seis poços.
   1. Em alcançar 80% de confluência, cultura de células em meios contendo α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10⁻⁷ M. dexametasona (0,1 mM) e 5 mL de ácido ascórbico (100...). Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.
   2. Mude a mídia duas vezes por semana.
   3. Após 4 semanas, avalie o potencial das células de se diferenciar em uma linhagem osteogênica manchando as células usando um ensaio de von Kossa, que distingue a presença de depósitos calcificados em uma cultura de³³.
      1. Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, adicionar 5% de nitrato de prata e tratar sob raios ultravioleta (UV) por 1h à temperatura ambiente.
      2. Adicionar 5% Na₂₄ quatro vezes, permitindo que 3 min para cada reação. Finalmente, lave as células duas vezes com água destilada.
         Nota: Von Kossa coloração é uma reação de precipitação onde os íons de prata e fosfato reagem na presença de materiais ácidos; Esta técnica de coloração não é específica para o cálcio. Neste estudo, quando as células investigadas foram tratadas com solução de nitrato de prata, cálcio — que é reduzido pela forte luz UV — foi substituído por prata, que se tornou visível como prata metálica.
2. Para diferenciação de adipogenic, cultura de células em uma densidade de 5000 células por poço em placas de cultura de seis poços contendo α-MEM.
   1. Em alcançar 80% de confluência, cultura das células em meios contendo α-MEM 5% FBS, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicilina, 10^{− 6} M dexametasona (1 mM), insulina (5 mg/mL) e indometacina (60 mM).
   2. Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.
   3. Depois de 6 a 9 semanas, use O vermelho para manchar as células e destacar gotas de lipídios, determinando, assim, a presença de adipogenic diferenciação³³de óleo:
      1. Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, a manchar as células com 0,5% óleo vermelho O em temperatura ambiente por 10 min e depois lavar as células três vezes com isopropanol 60% por 3 min cada tempo; Finalmente, lave as células com água destilada.
         Nota: Óleo vermelho oé um lisocromo (lipossolúvel) corante usado para a coloração de lipídios neutros, principalmente Ésteres de colesterol, lipoproteína e triacilglicerol. O corante se dissolve nas gotículas lipídicas na célula, transformando as gotículas lipídicas vermelho.
3. Para diferenciação de condrócitos, células de cultura em placas de cultura de seis-bem com cada um contendo bem 5000 células.
   1. Adicione uma diferenciação médio contendo α-MEM, 5% FBS, 10⁻⁷ M. dexametasona (0,1 mM), piruvato de sódio (100 µ g/mL), insulin-transferrina-selênio-A (1 × ITS), fator de crescimento transformador-β (10 ng/mL) e 5 mL de ácido ascórbico (100 µM).
   2. Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.
   3. Depois de 4-5 semanas, use Alcian azul de coloração para realçar os polissacarídeos ácidos, tais como glicosaminoglicanos ou alguns tipos de mucopolissacarídeos, na cartilagem das células para determinar a presença de condrócitos diferenciação³³.
      1. Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, adicione ácido acético a 3% e permitir que 2 min para a reação. Posteriormente, lave com água destilada três vezes, adicionar 1% azul de Alcian 8GX incubado por 30 min e depois lave com água destilada. Finalmente, adicione ácido acético a 3% e lavar por 3 min e em seguida lavar com água destilada para terminar.
         Nota: As partes da célula que mancham especificamente por este corante tornar-se azul a azul esverdeado após coloração e são chamadas de "alcianophilic".

4. efeitos da 25-dihidroxivitamina D₃ (1,25-(OH),₂D₃) na osteogênese

1. Dividi o P3 para P5 PDCs em seis grupos e cultura em placas de 6-poços com vários meios de cultura:
2. grupo negativo (α-MEM e 5% FBS);
3. Grupo de vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e dexametasona 10⁻⁷ M + 100 hum vitamina C);
4. e 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ grupo (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e 10⁻⁷ M dexametasona + 10⁻⁷ 1,25-(OH) M₂D₃).
5. Adicione 2 mL do meio de uma incubadora (37 ° C) em cada poço e mudar o médio duas vezes por semana.

5. inverter a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa/transcrição

1. Depois d 7 da diferenciação osteoblástica, isolar o RNA total no gelo usando um reagente comercial (ver Tabela de materiais):
   1. Adicione 1 mL do reagente de isolamento para cada poço. Adicionar 200 µ l de bromochloropropane e deixar por 10 min gerar RNA em camadas e em seguida centrifugar a 10.000 rpm por 15 min a 4 ° C.
   2. Após a centrifugação, adicione 500 µ l de 2-propanol a 500 µ l do sobrenadante contendo RNA. Precipitar o RNA no gelo e deixe 15 min para a reação.
   3. Após o procedimento, centrifugar a 12.000 rpm por 15 min a 4 ° C, após o qual o RNA está localizado na parte inferior do tubo. Posteriormente, remover o sobrenadante usando 1 mL de álcool de 75% para lavar e centrifugar a 7.500 rpm por 8 min em 4 ° C.
   4. Remover o sobrenadante e usar um concentrador a vácuo para produzir RNA do fundo do líquido. Recupere-se com água.
2. Reverso transcrever o RNA (1 μg) usando o transcriptase reverso vírus myeloblastosis aviária. Definir a reação em cadeia do polymerase (PCR) para executar a 25 ° C por 10 min, seguido de 50 ° C por 60 min e, em seguida, 85 ° C por 5 min, antes de finalmente manter a 4 ° C.
3. Sintetiza primeiro-strand DNA complementar (cDNA). Realizar o PCR quantitativo (qPCR) usando 5 μL de 01:10 diluído do cDNA. Conduta de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) utilizando primers para ALP, BSP, OCN, CBFA1 e colágeno-1.
   Nota: Para evitar a contaminação de DNA pelos sinais, as sequências de frente e verso de cada primer foram projetadas em distintas exões.
4. Executar qPCR usando um comercial do PCR Master Mix (ver Tabela de materiais), em conformidade com as instruções do fabricante. Definir o termociclador a 50 ° C por 2 min, seguido de 95 ° C por 10 minutos e então 40 ciclos cada um a 95 ° C por 15 s seguido de 60 ° C por 60 s.
   Nota: O protocolo SYBR também requer uma fase de curva de derreter, que é executada a 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 60 s e em seguida a 95 ° C por 15 s.
5. Normalizar os valores de limiar de ciclo para ALP, BSP, CBFA1, colágeno-1 e OCN do gene das tarefas domésticas GAPDH. ³⁴
6. Pares da primeira demão são listados na Tabela de materiais.

6. alcalina fosfatase atividade

1. Avaliar a atividade de enzima ALP das células usando a técnica descrita anteriormente,³⁵, que converte p- nitrofenil fosfato de p- nitrofenol; p- nitrofenil fosfato é um substrato de fosfatase que fica amarelo quando dephosphorylated por ALP, conforme determinado no comprimento de onda de 405 nm. Normalizar o total de p- nitrofenol formado com base na proteína total conforme determinado pelo ensaio de Bradford.
2. Comparar as atividades ALP do controle (α-MEM, 5% FBS), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM, 10⁻⁷ M dexametasona + 100 hum vitamina C), 1,25-(OH)₂D₃ (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e 10⁻⁷ M dexametasona + 10⁸ M 1,25-(OH)₂D₃) e vitamina C + 1,25-(OH)₂D₃ (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM, 10⁻⁷ M dexametasona + 100 hum +1,25-(OH) de vitamina C₂D₃) grupos após 1, 2, 3 e 4 semana de cultura.
3. Execute um procedimento de extração de proteínas no gelo:
   1. Raspar as células das placas 6-poços e adicionar 50 µ l de tampão de Lise. Posteriormente, coloque as pilhas no gelo por 30 min destruir as células e liberar a proteína.
   2. Depois de 30 min, centrifugar a 13000 rpm a 4 ° C por 15 min. Após a centrifugação, extrair o sobrenadante para armazenamento e uso.

Resultados

Para todos os ensaios quantitativos, os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o Student t-teste. No total, 34 amostras foram obtidas com uma idade média de participantes de 48,1 ± 12,3 y. onze destas amostras foram obtidas de pacientes do sexo masculino e 23 do sexo feminino. Vinte e oito amostras foram obtidas a partir das regiões molares e seis das regiões anteriores; 26 foram obtidos de maxila e...

Discussão

Uma modalidade terapêutica recentemente desenvolvida, ou seja tecido de engenharia que impliquem MSCs, tem inúmeras vantagens. MSCs, que estão presentes em diversos tipos de tecido, são células multipotentes que podem se diferenciar em uma variedade de células de tecidos mesodérmicos funcional³⁷ e outras células, como os osteoblastos.

O periósteo serve como um nicho de células progenitoras, e como uma fonte de rica vascularização para o osso envolve-

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt	Sigma	49752
35-mm culture dishes	Corning	430165
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
6  well plate	Corning	3516
Alkaline phosphatase	ABI	Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit	BioVision	K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase	Roche	10109118001
CD146	BD	561013
CD19	BD	560994
CD34	BD	560942
CD44	BD	561858
CD45	BD	561088
CD73	BD	561014
CD90	BD	561974
Cell banker1	ZEAOAQ	11888
core binding factor alpha-1	ABI	Hs00231692_m1
dexamethasone	Sigma	D4902
DPBS	Gibco	14190250
FBS	Gibco	26140-079
GAPDH	ABI	Hs99999905_m1
HLA-DR	BD	562008
indomethacin	Sigma	I7378
insulin	sigma	91077C
insulin–transferrin–selenium-A	Sigma	I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)	Life	4346907
MicroAmp optical adhesive film	Life	4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification	HyClone	SH30265.02
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Permeabilization buffer	eBioscience	00-8333-56
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
STRO-1	BioLegend	340103
SYBER Green PCR Master Mix	AppliedBiosystems	4309155
TaqMan Master Mix	Life	4304437
transforming growth factor-β	Sigma	T7039
Trizol reagent (for RNA isolation)	Life	15596018
β-glycerophosphate	Sigma	G9422
collagen-1	Invitrogen	forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
		reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN	Invitrogen	forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
		reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP	Invitrogen	forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
		reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers