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要約

ビタミン C (ビタミン C)、1, 25-ジヒドロキシ ビタミン D [1,25-(OH)2D3] による骨膜由来細胞 (Pdc) の mRNA 発現バイオ マーカーを調査するためのプロトコルを提案します。また、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化する Pdc の能力を評価します。

要約

間葉系幹細胞 (MSCs) は、さまざまな組織に存在しており、骨芽細胞を含む、多くの種類の細胞に分化することができます。MSCs の歯ソース、骨膜は簡単にアクセスできる組織、形成層に MSCs を識別されています。ただし、このソースないまだ広く研究されています。

ビタミン D3と 1,25-(OH)2D3 の in vitro分化 MSCs の骨芽細胞を刺激するために実証されています。さらに、ビタミン C は、コラーゲン形成、骨細胞の成長を促進します。ただし、研究はまだ MSCs に及ぼすビタミン D3とビタミン C を検討しています。

ここで、ひと歯槽骨膜から MSCs を分離する方法を提案する 1,25-(OH)2D3可能性がありますこれらの細胞の骨効果を発揮するという仮説を調べると。また人間の歯槽骨膜で MSCs の有無を調査し、幹細胞の接着・増殖を評価します。評価するためにビタミン C (コントロール) としての能力と 1,25-(OH)2D3 (10−10、10−910−8、10−7 M) の濃度を変更するキーの mRNA のバイオ マーカーアルカリホスファターゼ (ALP) の分離の MSCs mRNA 発現骨シアロタンパク質 (BSP)、コア結合因子 α-1 (CBFA1) コラーゲン-1、オステオカルシン (OCN) は、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) を使用して測定されます。

概要

多数の関連する技術は、近年開発されている、骨の再建のまま複数の制約によって制限され、必要な再構築の範囲はしばしば不可能を推定します。硬組織増強が有利な長期的な成功率に加えて機能と審美性の目標を達成するために必要です。自家および同種骨移植術、xenografting、および alloplastic 骨移植、そのようなプロシージャのために一般的に使用されるメソッドが含まれます。各種骨移植の中では、自家骨移植が最も効果的なと見なされます。しかし、ドナー サイト罹患率、危険にさらされた血管と組織の限られた可用性1自家骨移植のための主要な欠点をされています。さらに、同種骨移植、異種移植片は病気の感染に関連付けられています。現在、人工骨移植、広くこれらの問題を解決する使用されます。ただし、骨の可能性の欠如と臨床転帰は広く変わることが。セルロースなどの材料、量の変動、感染症、強度の不足と関連付けられます。

組織工学による骨増生は、かなりの関心を生成しています。この手法は、間葉系幹細胞 (MSCs) 最初される骨芽細胞分化を促進するために、骨修復を達成するために骨の損失のサイトに移植します。この手順は、細胞療法に現在適用されます。組織の限られた量を抽出することにより, 顎骨の再建を達成して簡単です低侵襲他の方法と比較しています。

MSCs の歯科再生を目指した細胞ベースの治療のためのツールとしての潜在的な役割は、様々 な研究グループの新たな関心です。MSCs が組織の次の種類から区別することができる研究を確認した: 骨髄、脂肪、滑膜、周皮細胞、骨、ひと臍帯、歯の組織2,3。MSCs の一般的な原因は、歯の組織、脂肪組織、骨髄に含まれます。歯科幹細胞の利点が収穫後に簡単なアクセシビリティと少ない罹患率を脂肪組織、骨髄由来 MSCs と比べると。胚性幹細胞と比べると、歯の組織に由来する MSCs は nonimmunogenic 表示され、複雑な倫理的な問題3に関連付けられていません。

2006 年、細胞療法の国際社会を MSCs を識別するために次の基準を使用してお勧めします: 最初に、MSCs はプラスチックにアタッチできる必要があります。第二に、MSCs は CD105、CD73、CD90 の表面抗原に陽性で造血抗原 CD45 と CD344に加えて B 細胞、マクロファージ、単球のマーカーに否定的な必要があります。最終的な基準として MSCs は細胞の in vitro分化の標準的な条件下での次の 3 種類に区別することがある必要があります: 骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞の4。日には、6 種類歯科幹細胞の分離され特徴します。最初のタイプは、ひと歯髄組織から分離され、生後歯髄幹細胞5と呼ばれます。その後、歯科の MSCs の新たに 3 種類が分離され特徴: 剥離乳歯6、7歯根や頂乳頭8から幹細胞。最近では、根尖嚢胞 MSCs (hPCy-MSCs)12歯科芽茎 cells(DBSCs)11歯肉組織由来10歯科卵胞由来9も同定されています。

エアフルトは、MSCs13を定義する第 1 だった。MSCs は潜在的な高い増殖を展示し、移植前に区別するために操作することができます再生手順10に適していることを示唆しています。

また骨膜由来細胞 (Pdc)、されているほとんどの研究は、幹細胞の供給源として骨髄を使用して、最近14を使用します。骨膜、骨髄よりもより簡単にアクセスできます。したがって、この手法では、私たちは手術中に追加切開の必要性を除去するために、患者の術後合併症を減らすために歯槽骨膜を使用します。長骨の外のライニングを形成し、2 つの異なるレイヤーで構成されて結合組織である骨膜: 線維芽細胞、コラーゲンや弾性線維の15と直接接触して内部の細胞豊富な形成層から成る外層の線維性骨の表面。形成層を含む混合セル人口16主に線維芽細胞、骨芽細胞17、ペリサイト18、および MSCs19,20,21として識別される重要な個体。における骨髄由来幹細胞 (bMSCs) に優れた骨治癒と再生の22,23,24なかったら Pdc が匹敵する、ほとんどの研究を報告しています。骨膜は簡単にアクセスできる、優れた再生効果を展示します。ただし、いくつかの研究は骨膜25,26,27に焦点を当てています。

骨修復に関する現在の臨床実習には支援足場内増幅骨膜前駆細胞の移植が含まれます。最近の研究は、欠陥のある領域における幹細胞の獲得と組織再生20の前駆細胞を用いた焦点を当てています。歯科医は、歯周治療、歯科インプラント歯周骨再生の将来のアプリケーションも予測します。ドナー サイトに関する骨膜が一般的な歯科医によって簡単に収穫できます。骨膜は、ルーチンの口腔外科手術中にアクセスできるように、これは骨髄間質細胞に対して遜色します。したがって、本研究の目的は、Pdc を収穫するためのプロトコルを確立し、評価形態、添付ファイル、実行可能性、および人間の骨膜幹細胞の増殖です。

ビタミン D 代謝物生体内で骨塩量動的平衡に影響を与えます。1 つの研究は、24R,25-(OH)2D3活性型ビタミン D は人間の MSCs (hMSCs)28の骨芽細胞の分化に不可欠な報告。骨ホメオスタシスと修理は、どの 1,25-(OH) の2D3 (カルシトリ オール) は最も生物学的活性と骨の健康の制御に関連する、ビタミン D3代謝のネットワークによって規制されています。ビタミン D3石灰化29に不可欠です。2 d 旧昆明白いマウスを使用して 1 つの研究では、マウスの胚様体は、ビタミン C とビタミン D のサプリメントが効果的に30ESC 由来の骨芽細胞の分化を促進示されます。その他の生物学的活動の中で 1,25-(OH)2D3は hMSCs アルカリ性ホスファターゼ (ALP) 活性または OCN 遺伝子の増加に基づいて監視できる芽を生体外で分化を刺激します。式です。

ほとんどの研究は、骨ティッシュ エンジニア リングの特定焦点との人間の Pdc でビタミン C と 1,25-(OH) の2D3との組み合わせ治療の用量-反応関係が します。したがって、本研究で我々 は 1,25-(OH)2D3の単一または複合治療の至適濃度と人間の Pdc の骨分化誘導のためのビタミン C を調べます。このプロトコルの目的は歯科歯槽骨膜由来細胞集団に MSC の表現型とこれらの細胞の (体外) 文化の展開し、目的の組織を形成する区別されるかどうかのセルが含まれているかどうかを決定する、します。.また、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化する Pdc の能力を評価します。研究の 2 番目の部分は、Pdc の骨の活性に及ぼすビタミン C と 10−10、10−9、10−8、10−7 M 1,25-(OH)2D3を評価します。本研究の主な目的は ALP 活性と、アルプなど、プロによる骨の遺伝子によって Pdc の骨芽細胞の分化にビタミン C と 1,25-(OH)2D3の機能を評価するために、コラーゲン 1、OCN、BSP、および CBFA1。さらに、本研究は、これらの調査結果に基づいて人間の Pdc の最適な骨の条件を決定します。

プロトコル

研究プロトコルは、制度検討委員会の長庚記念病院が承認されました。すべての参加者には、書面によるインフォームド コンセントが用意されています。

1. ティッシュの準備

  1. 歯科手術 (図 1) 中に患者から骨膜の組織を収穫します。局所麻酔下フラップ反射後、歯槽骨骨膜区切り31を使用してから骨膜組織の部分を取る。
  2. 収穫後ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 300 U/mL のペニシリンとストレプトマイシンの 300 mg/mL に約 5 mm × 2 mm の骨膜の組織スライスを格納します。24 時間以内に検査室に組織を転送します。
  3. メスもみじん切りし、通過 0 の培地 (ペニシリンの 300 U/mL と 300 mg/mL ストレプトマイシン、α-MEM、5% ウシ胎児血清 [FB] で構成) で、37 ° C でインキュベーターで培養でサンプルを維持と歯槽骨膜組織片をみじん切り加湿空気 (5% 二酸化炭素)。、インキュベーターの湿度を維持するために水鉢を準備します。
  4. 3 日後、週に 2 回は、媒体を変更します。
  5. セル subconfluence (80%) に達している、3 min のためのインキュベーター (37 ° C) で 0.25% トリプシン 200 μ L で付着性のセルを解放し、反応を終了する媒体の 4.5 mL を使用してください。
  6. 再び新鮮な通路 1 培地で細胞をプレート (α-MEM、10 %fbs、100 単位/mL、ペニシリンとストレプトマイシンの 100 μ g/mL)。プレートは 5 × 103細胞 (診断によって数えられる) ようです。
  7. セル達成 80% 合流31後、各後続の通路を実行します。
    注: 初めに、媒体になりますオレンジ、赤。約 3 日間後中の色が黄色がかった色合いに変わります。細胞の倍加時間は約 30-40 h、3-5 世代のための 7 日間を必要とするであります。
  8. 文化 α MEM で分離された Pdc は、FBS、ペニシリン、100 U/mL と 100 mg/mL (37 ° C、5% CO2) インキュベーターのストレプトマイシンの 10% を補充しました。
  9. 細胞の成長を毎日観察し、週 2 回成長培地を置き換えます。第 3-第五世代細胞を使用して、すべてのそれ以上の実験のため。

2. フローサイトメトリー

  1. トリプシンの消化力によって収穫 1 × 106セル:
    1. 0.25% トリプシン 200 μ L を追加します。3 分後に、トリプシンの反応を終了し、遠心分離 (1500 rpm、5 分、22 ° C) を通じて収集 FBS を含む培養液 4.5 mL を使用します。
    2. 3 回使用して 1 x DPBS 細胞ペレットを洗浄します。200 μ L 1 x透過バッファーに細胞を再懸濁します。診断とセルをカウントします。
  2. 流れ cytometry (蛍光活性化細胞ソーティング)32を介して Pdc の表現表現の表面マーカーを調べます。CD19 に対するモノクローナル抗体 (MAb) を使用 (かに (FITC))、CD34 (FITC)、CD44 (フィコエ リスリン [PE])、CD45 (FITC)、CD73 (PE)、CD90 (アロフィコシアニン [APC])、CD146 (PE)、STRO-1 (アレックス)、および HLA-DR (FITC)32。
    1. サンプルと文化 4 ° C、30 分で暗闇の中に抗体を追加します。
    2. 3 回 1 x DPBS で血球を洗浄します。
    3. 2% のホルムアルデヒドを使用してセルを修正、流れフローサイトメトリー分析32に進みます。

3. 添付ファイルと生存率と骨、脂肪細胞、軟骨細胞分化を細胞します。

細胞の分化を誘導する骨、脂肪細胞と分化メディアで 6 ウェル プレートにすべて 3 通路で骨膜細胞を培養による軟骨細胞系列。

  1. Osteogenic 微分のため α-MEM 6 ウェル培養皿の上でよくあたり 5000 セルの密度での細胞を培養します。
    1. 80% の合流点を達成すること、5% α-MEM 培地で細胞の培養 FBS、β-グリセロリン酸 (10 mM)、10−7 M デキサメタゾン (0.1 mM)、アスコルビン酸 5 ml (100 uM)。Α MEM と 5% で構成されるメディアのネガティブ コントロールを文化政府短期証券。
    2. 週 2 回メディアを変更します。
    3. 4 週間後文化33石灰質堆積物の存在を区別するコッサ アッセイを用いた細胞によって骨系統に分化する細胞の潜在性を評価します。
      1. 10% ホルマリン固定を追加します。30 分以内 5% 硝酸銀を追加し、室温で 1 時間の紫外線 (UV) 光の下で治療します。
      2. 4 4 回 5% ナ2を追加、各反作用のための 3 分を許可します。最後に、蒸留水で 2 回細胞を洗浄します。
        注: コッサ染色は、銀イオンとリン酸が酸性物質の存在下で反応する沈殿物の反作用この染色法はカルシウムに固有ではありません。今回、調査の細胞はカルシウム硝酸銀溶液で扱われたとき-強い紫外線を低減-取替えられた銀は、金属銀として見えるようになった。
  2. 脂肪細胞分化の α MEM を含む 6 ウェル培養皿の上でよくあたり 5000 セルの密度での細胞を培養します。
    1. 80% の合流点を達成すること、α MEM, 5 %fbs、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (100 mg/mL), 1% ペニシリンを含んでいる媒体で細胞の培養 10− 6 M デキサメタゾン (1 mM)、インスリン (5 mg/mL)、インドメタシン (60 mM)。
    2. Α MEM と 5% で構成されるメディアのネガティブ コントロールを文化政府短期証券。
    3. 6-9 週間後使用オイル赤 O の細胞を染色し、脂質低下、脂肪細胞分化33の存在を決定します。
      1. 10% ホルマリン固定を追加します。30 分以内で染色 0.5% セル オイル赤 O の 10 分間室温で、毎回 3 回 3 分間 60% イソプロパノールとセルを洗い流し最後に、蒸留水と細胞を洗浄します。
        注: オイル赤い O 中性脂質の染色に使用する lysochrome (脂溶性) ジアゾ染料主にトリアシルグリセ ロール、リポ蛋白質とコレステロールのエステル。染料は、脂肪滴を赤く、細胞における脂質に溶解します。
  3. 軟骨細胞分化、それぞれ 6 ウェル培養皿で培養細胞も 5000 を含んでいるセルです。
    1. 分化中含まれている α-MEM、5 %fbs、10−7 M デキサメタゾン (0.1 mM)、ピルビン酸ナトリウム (100 μ g/mL)、インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレン-A (1 × ITS)、変形成長因子 β (10 ng/mL) とアスコルビン酸 (100 μ M) の 5 mL 追加します。
    2. Α MEM と 5% で構成されるメディアのネガティブ コントロールを文化政府短期証券。
    3. 4-5 週間後アルシアン ブルー染色グリコサミノグリカンなど軟骨細胞分化33の存在を決定する細胞の軟骨のムコ多糖の種類によって、酸性多糖類を強調するを使用します。
      1. 10% ホルマリン固定を追加します。30 分以内 3% 酢酸を追加し、反応を 2 分します。その後、蒸留水で 3 回洗浄 30 分インキュベート 1% アルシアン ブルー 8GX を追加し、その後、蒸留水で洗います。最後に、3% 酢酸と 3 分間洗浄を追加し、その後、仕上げに精製水で洗ってください。
        注: 具体的に青緑の青くなるこの色素によって染色するセルの部分染色後、"alcianophilic"と呼ばれる

4. 25-ジヒドロキシ D3 (1,25-(OH)2D3) の骨形成に及ぼす影響

  1. P5 Pdc に P3 を分割、六つのグループと様々 な文化のメディアと 6 ウェル プレートの文化。
  2. 負の群 (α MEM と 5 %fbs);
  3. ビタミン C 群 (α MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸、および 10−7 M デキサメタゾン + 100 uM ビタミン C);
  4. 10−7 M 1,25-(OH)2D の3グループ (α MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸と 10−7 M デキサメタゾン + 10−7 M 1,25-(OH)2D3)。
  5. 培地 2 mL を各ウェルにインキュベーター (37 ° C) に追加し、変更の媒体毎週二回。

5. 転写/量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応の逆します。

  1. 骨芽細胞分化の 7 d の後商業試薬を使用して、氷の上の総 RNA を分離 (材料の表を参照してください)。
    1. 各ウェルに分離試薬 1 mL を追加します。Bromochloropropane の 200 μ L を追加し、層状 RNA を生成する 10 分間のままに、4 ° C で 15 分間 10,000 rpm で遠心分離
    2. 遠心分離の後上澄み含む RNA の 500 μ L に 2-プロパノールを 500 μ l 添加を追加します。氷の上の RNA を沈殿させ、反応のための 15 分ができます。
    3. 手順の後、RNA が管の下部に位置して、4 ° C で 15 分間 12,000 rpm で遠心分離機します。その後、洗浄のための 75% のアルコール 1 mL を使用して上澄みを除去し、4 ° C で 8 分 7,500 rpm で遠心
    4. 上澄みを除去し、液体の底から RNA を生成する真空濃縮を使用します。水で回復します。
  2. 逆転写 RNA (1 μ g) 鳥 myeloblastosis ウイルス逆転写酵素を使用しています。最後に 4 ° C で維持する前に、60 分とし、5 分間 85 ° C、ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 次に 50 ° C 10 分の 25 ° c を実行するに設定します。
  3. 最初繊維の相補的 DNA (cDNA) を合成します。5 を使用して量的な PCR (qPCR) を実行 1:10 の μ L 希釈 cDNA。定量的 RT-PCR (qRT PCR) を行う ALP、BSP や OCN、CBFA1、コラーゲン 1 のプライマーを使用して。
    注: 信号によって DNA の汚染を防止するため各プライマーの前方および逆シーケンス異なるエクソンに設計されていた。
  4. 商業 PCR マスターを使用して、qPCR を実行 (材料の表を参照) をミックス メーカーの指示に従い。2 分後 10 分 95 ° C として 40 サイクル各 15 95 ° C で 50 ° C で熱 cycler 設定 s に続いて 60 ° C、60 s。
    注: SYBR プロトコルも必要があります 15 95 ° C で実行され溶解曲線ステージ s、60 ° C、60 s、し、95 ° C、15 s。
  5. アルプ、BSP、CBFA1、サイクルのしきい値値を正規化し、コラーゲン 1 およびハウスキーピング遺伝子 GAPDH の OCN。34
  6. プライマーの材料表のとおりです。

6. アルカリホスファターゼ活性

  1. P- ニトロフェノール; p- ニトロフェニル リン酸に変換します以前記載した技術35を使用して細胞の ALP 酵素活性を評価します。p- ニトロフェニル リン酸は、405 nm 波長に決定、alp 企業様が脱燐酸化と黄色に変わり、アルカリホスファターゼ基質です。合計を正規化p- ニトロフェノール形成総蛋白に基づいてブラッドフォードの試金によって決定されます。
  2. コントロールの ALP 活性の比較 (α-MEM、5 %fbs)、ビタミン C (α-MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸、10−7 M デキサメタゾン + 100 uM ビタミン C)、1,25-(OH)2D3 (α MEM, 5 %fbs, 10 mM の β-グリセロリン酸と 10−7 Mデキサメタゾン + 10− 8 M 1,25-(OH)2D3) とビタミン C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸、10−7 M デキサメタゾン + 100 uM ビタミン C +1,25-(OH)2D3)文化の 1、2、3、および 4 週間後グループ。
  3. 氷の上のタンパク質抽出プロシージャを実行します。
    1. 6 ウェルから細胞をこすり、換散バッファーの 50 μ L を追加します。その後、細胞を破壊し、蛋白質を無料で 30 分間氷の上のセルを配置します。
    2. 30 分後、4 ° C 15 分で 13000 rpm で遠心分離機します。遠心分離の後ストレージの上澄みを抽出し、使用します。

結果

すべての定量的アッセイ用データは、平均 ± 標準偏差 (SD) として掲載されています。すべての統計解析を行いスチューデントのt-テストします。合計で 34 採取参加者平均年齢 48.1 ± 12.3 y イレブンのこれらのサンプルは男性患者と女性患者から 23 から得られました。臼歯部領域と前方の領域から 6 から 20-8 採取26 は、上顎骨や下顎骨から 8 から得られました。?...

ディスカッション

最近開発された治療法、すなわち組織の必然的には、工学的には、多数の利点があります。組織のいくつかの種類に含まれる MSCs は、さまざまな機能の中胚葉性組織細胞37に区別することができる多能性細胞、骨芽細胞など他のセルです。

前駆細胞のためのニッチとして骨膜と骨の豊富な血管の供給としてそれは38を包み込みます。34 ?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

研究プロトコルは、臨床研究の長庚記念病院 (IRB99 1828B、100 3019 C、99 3814B、102-1619 C、101-4728B、および 103-4223 C) の制度上の審査委員会によって承認されました。本研究は、長庚記念病院 (CMRPG392071、CMRPG3A1141、CMRPG3A1142、および NMRPG3C0151) によって支えられました。この原稿は、ウォレス学術編集することによって編集されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium saltSigma49752
35-mm culture dishesCorning430165
3-isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
6  well plateCorning3516
Alkaline phosphataseABIHs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay KitBioVisionK412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptaseRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
Cell banker1ZEAOAQ11888
core binding factor alpha-1ABIHs00231692_m1
dexamethasoneSigmaD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD562008
indomethacinSigmaI7378
insulinsigma91077C
insulin–transferrin–selenium-ASigmaI1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)Life4346907
MicroAmp optical adhesive filmLife4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha ModificationHyCloneSH30265.02
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Permeabilization buffereBioscience00-8333-56
Sodium pyruvateGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixAppliedBiosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
transforming growth factor-βSigmaT7039 
Trizol reagent (for RNA isolation)Life15596018
β-glycerophosphateSigmaG9422
collagen-1Invitrogenforward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCNInvitrogenforward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSPInvitrogenforward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

参考文献

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