Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Resumen

Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D₂₃]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSCs) están presentes en una variedad de tejidos y puede diferenciarse en numerosos tipos celulares, incluyendo osteoblastos. Entre las fuentes dentales de MSCs, el periostio es un tejido fácilmente accesible, que se ha identificado a contener MSCs en la capa de cambium. Sin embargo, esta fuente no todavía sido ampliamente estudiada.

Vitamina D₃ y 1,25-(OH)₂D₃ se han demostrado para estimular en vitro la diferenciación de MSCs en osteoblastos. Además, la vitamina C facilita crecimiento de colágeno formación y hueso celular. Sin embargo, ningún estudio ha investigado aún los efectos de la vitamina D₃ y la vitamina C en MSCs.

Aquí, presentamos un método de aislamiento MSCs de periostio alveolar humano y examinar la hipótesis de que 1,25-(OH)₂D₃ puede ejercer un efecto Osteoinductor en estas células. También investigar la presencia de MSCs en el periostio alveolar humano y evaluar proliferación y adhesión de la célula de vástago. Para evaluar la capacidad de la vitamina C (como control) y diferentes concentraciones de 1,25-(OH)₂D₃ (10⁻¹⁰10⁻⁹, 10⁻⁸y 10⁻⁷ M) a alterar clave biomarcadores de mRNA en la expresión del mRNA de MSCs aislada de la fosfatasa alcalina (ALP), ósea sialoprotein (BSP), atascamiento de la base del factor alfa-1 (CBFA1), colágeno-1 y osteocalcina (OCN) se calculan utilizando la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR).

Introducción

Aunque se han desarrollado numerosas técnicas relevantes en los últimos años, los huesos restos de reconstrucción limitada por restricciones múltiples y estimar que el grado de reconstrucción necesaria es a menudo imposible. Aumento de tejido duro es necesaria para alcanzar objetivos estéticos y funcionales además de una tasa de éxito a largo plazo favorable. Métodos comúnmente utilizados para estos procedimientos incluyen injerto óseo autógeno y alógeno, xenografting y el injerto de hueso de alloplastic. Entre los distintos tipos de injerto óseo, injertos de hueso autógeno se consideran los más efectivos. Sin embargo, morbosidad del sitio donante, vascularización comprometida y de la disponibilidad limitada de tejido¹ han sido grandes inconvenientes para el injerto de hueso autógeno. Además, injertos óseos alógenos y xenoinjertos se han asociado con la transmisión de la enfermedad. En la actualidad, injertos óseos sintéticos son ampliamente utilizados para resolver estos problemas. Sin embargo, con su falta de potencial osteogénico, los resultados clínicos han variado ampliamente. Materiales como la celulosa están asociados con fluctuaciones de volumen, infección y la falta de fuerza.

Aumento óseo mediante ingeniería de tejidos ha generado considerable interés. En esta técnica, las células madre mesenquimales (MSCs) se utilizan inicialmente para promover la diferenciación de osteoblastos, que luego se trasplantan al sitio de la pérdida ósea para lograr la reparación del hueso. Este procedimiento se aplica actualmente en terapia celular. Lograr la reconstrucción del hueso mediante la extracción de una cantidad limitada de tejido es más simple y menos invasivo en comparación con otros métodos.

El papel potencial de MSCs como una herramienta para las terapias basadas en células para regeneración dental es un emergente interés entre varios grupos de investigación. Estudios han confirmado que MSCs pueden ser distinguidos de los siguientes tipos de tejidos: médula ósea, membrana sinovial adiposa, pericyte, hueso trabecular, cordón umbilical humano y tejidos dentales^2,3. Fuentes comunes de MSCs incluyen médula ósea, tejido adiposo y los tejidos dentarios. En comparación con MSCs derivadas de tejido adiposo y la médula ósea, las ventajas de células madre dentales son de fácil accesibilidad y menor morbilidad después de la cosecha. En comparación con las células madre embrionarias, MSCs derivados de tejido dental aparecen nonimmunogenic y no se asocian a problemas éticos complejos³.

En 2006, la sociedad internacional de terapia celular recomendado utilizando los siguientes estándares para identificar MSCs: en primer lugar, MSCs deben ser capaces de unir al plástico. En segundo lugar, MSCs deben ser positivas para los antígenos de superficie de CD105 y CD73, CD90 y negativa para los marcadores de monocitos, macrófagos y células B además de las hematopoyéticos antígenos CD45 y CD34⁴. Como criterio final, MSCs deben ser capaces de distinguir en los siguientes tres tipos de células en condiciones normales de diferenciación en vitro : osteoblastos, adipocitos y condrocitos⁴. Hasta la fecha, seis tipos de células madre dentales humanas han sido aislados y caracterizados. El primer tipo fue aislado de tejido pulpar humano y había denominado células madre de pulpa dental postnatal⁵. Posteriormente, se han aislado y caracterizado tres tipos adicionales de MSCs dentales: células madre de dientes de hojas caducas exfoliada⁶, el ligamento periodontal⁷y la papila apical⁸. Más recientemente, deriva del folículo dental⁹, derivados del tejido gingival¹⁰, brote dental madre cells(DBSCs)¹¹y quiste periapical MSCs (hPCy-MSCs)¹² se también han identificado.

Friedenstein fue el primero en definir MSCs¹³. MSCs presentan una alto potencial de proliferación y pueden manipularse para diferenciar antes de ser trasplantado, lo cual sugiere que son candidatos ideales para procedimientos regenerativos¹⁰.

Aunque la mayoría de los estudios ha utilizado la médula ósea como fuente de células madre, células derivadas del periostio (PDC) también han sido utilizados recientemente¹⁴. El periostio es más fácilmente accesible que es la médula ósea. Por lo tanto, en esta técnica, utilizamos periostio alveolar para eliminar la necesidad de incisiones adicionales durante la cirugía y para reducir la morbilidad postquirúrgica en los pacientes. El periostio es el tejido conectivo que forma el revestimiento exterior de los huesos largos y se compone de dos capas distintas: la capa fibrosa externa compuesta de fibroblastos, colágeno y fibras elásticas¹⁵y la capa interior de t-célula-rico de cambium en contacto directo con la superficie del hueso. La capa de cámbium contiene una población de células mixta, principalmente fibroblastos¹⁶, osteoblastos¹⁷, del pericitos¹⁸y una subpoblación crítico identificado como MSCs^19,20,21. Mayoría de los estudios ha reportado que PDC es comparable, si no superior, a células madre procedentes de médula ósea (bMSCs) en hueso curativo y regeneración^22,23,24. El periostio es fácilmente accesible y exhibe excelente eficacia regenerativa. Sin embargo, pocos estudios se han centrado en el periostio^25,26,27.

Con respecto a la reparación del hueso, la práctica clínica actual consiste en el trasplante de células progenitoras perióstica amplificado en andamios de apoyo. Estudios recientes se han centrado en la adquisición de células madre en regiones defectuosas y empleando células progenitoras para regeneración de tejido²⁰. Los dentistas también anticipan futuro aplicación de regeneración periodontal del hueso en tratamientos periodontales e implantes dentales. Con respecto al sitio donador, el periostio puede ser cosechado fácilmente por odontólogos generales. Esto se compara favorablemente contra células estromales de la médula ósea, como el periostio puede accederse durante cirugía bucal rutinaria. Así, el objetivo de este estudio es establecer un protocolo para la recolección de PDC y evaluar la morfología, accesorio, viabilidad y proliferación de las células madre humanas de periostio.

Metabolitos de vitamina D afectan en vivo mineral óseo equilibrio dinámico. Un estudio informó que la 24R,25-(OH)_{3 2}D forma activa de vitamina D es esencial para la diferenciación osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)²⁸. Homeostasis del hueso y la reparación son reguladas por una red de metabolitos de vitamina D₃ , de que 1,25-(OH)₂D₃ (calcitriol) es biológicamente más activo y relevante en la regulación de la salud de los huesos. Vitamina D₃ es esencial para la calcificación²⁹. En un estudio utilizando ratones de Kunming blanco de 2-d de edad, los cuerpos de embryoid en los ratones indican que suplementos de vitamina C y vitamina D promovieron eficazmente la diferenciación de osteoblastos derivados de ESC³⁰. Entre sus otras actividades biológicas, 1,25-(OH)₂D₃ estimula la diferenciación en vitro de hMSCs a osteoblastos, que pueden ser monitoreados basados en el incremento en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (ALP) o gen de la OCN expresión.

Algunos estudios han detectado una relación dosis-respuesta de los tratamientos combinados con vitamina C y 1,25-(OH)₂D₃ en PDC humana con un enfoque particular en la ingeniería de tejido óseo. Por lo tanto, en este estudio, examinamos la concentración óptima para el tratamiento único o combinado de 1,25-(OH)₂D₃ y la vitamina C para inducir la diferenciación osteogénica de PDC humana. El objetivo de este protocolo es determinar si una población de células aislada del periostio alveolar dental contiene células con un fenotipo MSC y si estas células pueden ser ampliadas en la cultura (en vitro) y distinguidas para formar el tejido deseado . Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos. La segunda parte del estudio evalúa los efectos de la vitamina C y 10⁻¹⁰10⁻⁹, 10⁻⁸y 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ en la actividad osteogénica del PDC. El objetivo principal de este estudio es evaluar las funciones de la vitamina C y 1,25-(OH)₂D₃ durante la diferenciación osteoblástica de PDC por actividad de la ALP y genes pro-osteogénicos, como ALP, colágeno 1, OCN, BSP y CBFA1. Además, este estudio determina las condiciones de óptimo osteoinductores para humano PDC basado en estos resultados.

Protocolo

El protocolo de estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito.

1. preparación de tejido

1. Cosechan los tejidos periósticos de pacientes durante una cirugía dental (figura 1). Después de la reflexión de la aleta bajo anestesia local, tome un pedazo de tejido del periostio del hueso alveolar utilizando un separador perióstico de³¹.
2. Después de la cosecha, almacenar las rebanadas de tejido perióstico de aproximadamente 5 mm × 2 mm en de Dulbecco tampón fosfato salino (DPBS) con 300 U/mL de penicilina y 300 mg/mL de estreptomicina. Transferencia de los tejidos al laboratorio dentro de 24 h.
3. Pique los fragmentos de tejido perióstico alveolar con bisturí hasta bien picada y mantener las muestras en medio paso 0 (compuesto de 300 U/mL de penicilina y 300 mg/mL de estreptomicina, α-MEM y 5% de suero bovino fetal [SBF]) cultivadas en una incubadora a 37 ° C con aire humidificado (5% dióxido de carbono). En la incubadora, preparar un estanque para mantener la humedad.
4. Cambiar el medio después de 3 días y dos veces por semana después de eso.
5. Cuando las células han alcanzado subconfluence (80%), suelte las células adherentes con 200 μL de tripsina 0,25% en la incubadora (37 ° C) durante 3 minutos y luego usar 4,5 mL de medio para terminar la reacción.
6. Placa las células otra vez en medio fresco paso 1 (α-MEM, 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). La placa es 5 x 10³ células (como contada por un hemocitómetro).
7. Cabo cada paso subsecuente después de que las células alcanzar 80% confluencia³¹.
   Nota: Al principio, el medio será rojo anaranjado. Después de aproximadamente tres días, el color medio debe cambiar a un tono amarillento. El tiempo de duplicación de las células es de aproximadamente 30-40 h, que necesitan 7 días para 3 a 5 generaciones.
8. Cultura el PDC aislado en α-MEM había suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina en una incubadora (37 ° C, 5% CO₂).
9. Observar el crecimiento de las células diariamente y reemplace el medio de crecimiento dos veces por semana. Utilizan células de tercera a quinta generación para todos los otros experimentos.

2. citometría de flujo

1. Cosecha 1 × 10⁶ células a través de la digestión de la tripsina:
   1. Añadir 200 μL de tripsina 0.25%. Después de 3 min, usar 4,5 mL del medio de cultivo que contiene FBS para terminar la reacción de la tripsina y recopilar a través de centrifugación (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
   2. Lavar los gránulos de células tres veces utilizando 1 x DPBS. Resuspender las células en 200 μL de 1 x de buffer de permeabilización. Contar las células con un hemocitómetro.
2. Examinar los marcadores superficiales expresados expresados de lo PDC por flujo citometría (clasificación celular activado por fluorescencia)³². Uso de anticuerpos monoclonales (MAb) contra CD19 (isotiocianato de fluoresceína (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), (PE) CD73, CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) y HLA-DR (FITC)³².
   1. Añadir los anticuerpos a las muestras y la cultura en la oscuridad a 4 ° C por 30 minutos.
   2. Lavar las células con 1 x DPBS tres veces.
   3. Fijar las células con formaldehído al 2% y continuar con flujo cytometry análisis³².

3. apego y viabilidad con osteogénico, Adipogenic y diferenciación condrogénica de células

Inducir la diferenciación de las células en osteogénico, adipogenic y condrogénica por cultivo de las células periósticas en todos los tres pasajes en pozo de seis placas con medios de diferenciación específica.

1. Para la diferenciación osteogénica, la cultura las células α-MEM con una densidad de 5000 células por pocillo en pozo de seis placas.
   1. Las células en medios que contienen α-MEM, 5% de la cultura en el logro de 80% de confluencia, FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10⁻⁷ M dexametasona (0,1 mM) y 5 mL de ácido ascórbico (100 uM). Cultura del control negativo en los medios de comunicación que consiste en α-MEM y el 5% FBS.
   2. Cambiar los medios de comunicación dos veces por semana.
   3. Después de 4 semanas, evaluar el potencial de las células a diferenciarse en un linaje osteogénico mediante tinción de las células utilizando un ensayo de von Kossa, que distingue la presencia de depósitos calcificados en la cultura³³.
      1. Añadir el formol al 10% para fijación. Dentro de 30 min., añadir nitrato de plata 5% y tratar bajo luz ultravioleta (UV) por 1 h a temperatura ambiente.
      2. Añadir 5% Na₂₄ cuatro veces, lo que permite 3 minutos para cada reacción. Por último, se lavan las células dos veces con agua destilada.
         Nota: La coloración de Von Kossa es una reacción de precipitación donde los iones de plata y fosfato reaccionan en presencia de materiales ácidos; Esta técnica de tinción no es específica para calcio. En este estudio, cuando el investigado las células fueron tratadas con solución de nitrato de plata, calcio, que es reducida por la luz UV fuerte — fue sustituido por plata, que llegó a ser visible como plata metálica.
2. Para la diferenciación de adipogenic, cultura las células a una densidad de 5000 células por pocillo en pozo de seis placas que contienen α-MEM.
   1. En el logro de 80% de confluencia, las células en medios que contienen α-MEM 5% FBS, 0.5m m 3-isobutil-1-metilxantina (100 mg/mL), 1% de penicilina, de la cultura 10⁻⁶ M dexametasona (1 mM), insulina (5 mg/mL) e indometacina (60 mM).
   2. Cultura del control negativo en los medios de comunicación que consiste en α-MEM y el 5% FBS.
   3. Después de semanas de 6 – 9, utilizar aceite O rojo para teñir las células y para destacar gotas de lípidos, determinando la presencia de adipogenic diferenciación³³:
      1. Añadir el formol al 10% para fijación. Dentro de 30 minutos, mancha las células con 0,5% aceite rojo O a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego lavar las células 3 veces con isopropanol al 60% durante 3 minutos cada vez; por último, lavar las células con agua destilada.
         Nota: Aceite rojo O es un lysochrome (soluble en la grasa) tinte diazo utilizado para tinción de lípidos neutros, principalmente ésteres del triacilglicerol, lipoproteínas y colesterol. El colorante se disuelve en las gotitas de lípidos en la célula, rojo que da vuelta las gotitas de lípidos.
3. Para la diferenciación de condrocitos, células en cultivo en pozo de seis placas con cada bien que contenga 5000 células.
   1. Añadir una diferenciación medio α que contiene-MEM 5% FBS, 10⁻⁷ M dexametasona (0,1 mM), piruvato de sodio (100 μg/mL), insulina-transferrina-selenio-A (1 × ITS), factor de crecimiento transformante-β (10 ng/mL) y 5 mL de ácido ascórbico (100 μm).
   2. Cultura del control negativo en los medios de comunicación que consiste en α-MEM y el 5% FBS.
   3. Después de 4 – 5 semanas, usar tinción para destacar los polisacáridos ácidos, tales como los glicosaminoglicanos o algunos tipos de mucopolisacáridos en el cartílago de las células para determinar la presencia de la diferenciación de condrocitos³³Azul alcián.
      1. Añadir el formol al 10% para fijación. Dentro de 30 min, Añadir ácido acético al 3% y dejar 2 minutos para la reacción. Posteriormente, lavar con agua destilada tres veces, agregue 1% azul de Alcian 8GX incubados por 30 min y luego lavar con agua destilada. Finalmente, Añadir ácido acético al 3% y lavado por 3 min y luego lavar con agua destilada hasta el final.
         Nota: Las partes de la célula que tiñe específicamente por este colorante se convierten en azul a verde después de tinción y se llaman "alcianófilas."

4. efectos de la 25-dihidroxivitamina D₃ (1,25-(OH)₂D₃) sobre osteogénesis

1. Divide el P3 a P5 PDC en seis grupos y la cultura en placas de 6 pocillos con diferentes medios de cultivo:
2. Grupo negativo (α-MEM y el 5% FBS);
3. Grupo de la vitamina C (α-MEM 5% FBS, glicerofosfato-β de 10 mM y 10⁻⁷ M dexametasona + 100 uM vitamina C);
4. y 10⁻⁷ M 1,25-(OH) D₂grupo₃ (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM y 10⁻⁷ M dexametasona + 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃).
5. Añadir 2 mL del medio a una incubadora (37 ° C) en cada pocillo y cambiar el medio dos veces cada semana.

5. Invierta la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real transcripción y cuantitativos

1. Después de 7 d de la diferenciación de osteoblastos, aislar el ARN total de hielo usando un reactivo comercial (véase Tabla de materiales):
   1. Añadir 1 mL de reactivo de aislamiento a cada pocillo. Añadir 200 μL de bromochloropropane y dejar durante 10 minutos generar RNA capas y luego centrifugar a 10,000 rpm durante 15 min a 4 ° C.
   2. Después de la centrifugación, Añadir 500 μl de 2-propanol a 500 μl del sobrenadante que contiene ARN. Precipitar el ARN en el hielo y dejar 15 minutos para la reacción.
   3. Después del procedimiento, centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C, después de que el ARN se encuentra en la parte inferior del tubo. Posteriormente, retirar el sobrenadante utilizando 1 mL de alcohol del 75% para el lavado y centrifugar a 7.500 rpm durante 8 min a 4 ° C.
   4. Quite el sobrenadante y utilizar un concentrador de vacío para producir arn de la parte inferior del líquido. Recuperar con agua.
2. Reversa transcribe el RNA (1 μg) utilizando aviar myeloblastosis virus de la transcriptasa reversa. Establecer la reacción en cadena de polimerasa (PCR) a 25 ° C para 10 min seguido de 50 ° C por 60 min y luego 85 ° C por 5 min, antes de finalmente mantener a 4 ° C.
3. Sintetizar la primera hebra ADN complementario (cDNA). Realizar PCR cuantitativa (qPCR) con 5 μL de 1:10 diluido cDNA. Realizar RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) usando las cartillas para ALP, BSP, OCN, CBFA1 y colágeno-1.
   Nota: Para evitar la contaminación de ADN por las señales, las secuencias de avance y retroceso de cada cartilla fueron diseñadas en diferentes exones.
4. Realizar qPCR utilizando comercial PCR Master Mix (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante. Establecer el termociclador a 50 ° C por 2 min seguido de 95 ° C por 10 min y luego 40 ciclos cada uno a 95 ° C por 15 s seguido de 60 ° C durante 60 s.
   Nota: El protocolo SYBR también requiere una etapa de curva de fusión, que corre a 95 ° C por 15 s, 60 ° C durante 60 s y luego a 95 ° C por 15 s.
5. Normalizar los valores de umbral de ciclo para el ALP, BSP, CBFA1, colágeno-1 y OCN a la limpieza gene de la GAPDH. ³⁴
6. Pares de cartilla se enumeran en la Tabla de materiales.

6. actividad fosfatasa alcalina

1. Evaluar la actividad de la enzima fosfatasa alcalina de las células mediante la técnica anteriormente descrita³⁵, que se convierte p- nitrofenil fosfato de p- nitrofenol; p- nitrofenil fosfato es un sustrato de la fosfatasa que se vuelve amarillo cuando defosforilaciones por ALP, determinado en una longitud de onda de 405 nm. Normalizar el total de p- nitrofenol formado en base a la proteína total según lo determinado por el ensayo de Bradford.
2. Comparar las actividades de la fosfatasa alcalina del control (α-MEM, 5% SBF), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, glicerofosfato-β de 10 mM, 10⁻⁷ M dexametasona + 100 uM vitamina C), 1,25-(OH)₂D₃ (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM y 10⁻⁷ M dexametasona + 10⁻⁸ M 1,25-(OH)₂D₃) y vitamina C + 1,25-(OH)₂D₃ (α-MEM, 5% FBS, glicerofosfato-β de 10 mM, 10⁻⁷ M dexametasona + 100 uM +1,25-(OH) de vitamina C₂D₃) grupos después de 1, 2, 3 y 4 semana de la cultura.
3. Realizar un procedimiento de extracción de la proteína en el hielo:
   1. Raspar las células de las placas de 6 pozos y añadir 50 μl de tampón de lisis. Posteriormente, coloque las células en el hielo durante 30 minutos destruir las células y liberar la proteína.
   2. Después de 30 min, centrifugar a 13000 rpm a 4 ° C durante 15 minutos. Después de la centrifugación, extraer el sobrenadante para el almacenamiento y uso.

Resultados

Para los ensayos cuantitativos, los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante de Student t-test. En total, se obtuvieron 34 muestras con una edad media de participantes de 48,1 ± 12,3 y once de estas muestras se obtuvieron de pacientes masculinos y 23 pacientes femeninos. Se obtuvieron muestras de veinte y ocho de las regiones molares y de seis de las regiones anteriores; 26 se obtuvieron de la maxila y ...

Discusión

Una modalidad terapéutica desarrollada recientemente, es decir, recreando el tejido del que implique MSCs, tiene numerosas ventajas. MSCs, que están presentes en varios tipos de tejidos, son células pluripotentes que pueden diferenciarse en una variedad de células de tejidos mesodérmicos funcionales³⁷ y otras células como los osteoblastos.

El periostio sirve como un nicho para las células del progenitor y como una fuente de rica vasculatura para el hueso envuelve...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt	Sigma	49752
35-mm culture dishes	Corning	430165
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
6  well plate	Corning	3516
Alkaline phosphatase	ABI	Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit	BioVision	K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase	Roche	10109118001
CD146	BD	561013
CD19	BD	560994
CD34	BD	560942
CD44	BD	561858
CD45	BD	561088
CD73	BD	561014
CD90	BD	561974
Cell banker1	ZEAOAQ	11888
core binding factor alpha-1	ABI	Hs00231692_m1
dexamethasone	Sigma	D4902
DPBS	Gibco	14190250
FBS	Gibco	26140-079
GAPDH	ABI	Hs99999905_m1
HLA-DR	BD	562008
indomethacin	Sigma	I7378
insulin	sigma	91077C
insulin–transferrin–selenium-A	Sigma	I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)	Life	4346907
MicroAmp optical adhesive film	Life	4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification	HyClone	SH30265.02
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Permeabilization buffer	eBioscience	00-8333-56
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
STRO-1	BioLegend	340103
SYBER Green PCR Master Mix	AppliedBiosystems	4309155
TaqMan Master Mix	Life	4304437
transforming growth factor-β	Sigma	T7039
Trizol reagent (for RNA isolation)	Life	15596018
β-glycerophosphate	Sigma	G9422
collagen-1	Invitrogen	forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
		reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN	Invitrogen	forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
		reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP	Invitrogen	forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
		reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers