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요약

선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 다양 한 조직에에서 존재 하 고 osteoblasts를 포함 한 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다. MSCs의 치과 소스, 가운데는 레이어의 레이어에서 MSCs를 포함 하도록 확인 되었습니다는 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 그러나,이 소스는 하지 아직 광범위 하 게 연구 되었습니다.

비타민 D3 와 1,25-(OH)2D3 생체 외에서 MSCs의 차별화를 실현 osteoblasts 자극 입증 되었습니다. 또한, 비타민 C는 콜라겐 형성과 뼈 세포의 성장을 촉진 한다. 그러나, 아무 연구는 MSCs에 비타민 D3 와 비타민 C의 효과 조사 아직 있다.

여기, 우리 인간의 치경과에서 MSCs를 분리 하는 방법을 제시 1,25-(OH)2D3 이 세포에 osteoinductive 효과 발휘 수 가설을 검사 하 고. 우리는 또한 인간의 치경과에서 MSCs의 존재를 조사 하 고 줄기 세포 접착 및 확산 평가. 평가 하기 위해 비타민 C (컨트롤)로 서의 능력 및 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M)의 다양 한 농도 변경 키에 mRNA 생체 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)의 고립 된 MSCs mRNA 표현 뼈 sialoprotein (BSP), 코어 바인딩 요소 알파-1 (CBFA1), 콜라겐-1, 및 osteocalcin (OCN) 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용 하 여 측정 됩니다.

서문

비록 최근 몇 년 동안에서 수많은 관련 기술 개발 되었습니다, 뼈 재건 남아 여러 제약 조건에 의해 제한 하 고 필요한 재구성의 정도 종종 가능한 추정. 하드 조직 확대는 유리한 장기 성공률 뿐만 아니라 심 미와 기능 목표를 달성 해야 합니다. 이러한 절차에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법에는 자생과 allogenic 뼈 접목, xenografting, 및 alloplastic 뼈 접목 포함 됩니다. 뼈 이식의 다양 한 종류 중에서 자생 뼈 이식 가장 효과적으로 간주 됩니다. 그러나, 기증자 사이트 사망률, 손상된 vascularity, 그리고 제한 된 조직 여부1 자생 뼈 접목에 대 한 주요 단점이 있다. 또한, allogenic 뼈 이식 술과 xenografts 되었습니다 관련 질병 전송 된. 현재, 합성 뼈 이식 이러한 문제를 해결 하기 위해 널리 사용 됩니다. 그러나, osteogenic 잠재력의 그들의 부족, 임상 결과 널리 다양 했습니다. 셀 룰 로스 등 재료는 볼륨 변동, 감염, 및 힘의 부족에 연관 된다.

사용 하 여 조직 공학 뼈 확대는 상당한 관심을 생성 했다. 이 기술에서는, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 처음 사용 osteoblast 분화를 촉진 하는 다음 뼈 복구를 달성 하기 위해 뼈 손실의 사이트에 이식 됩니다. 이 절차는 현재 셀에 적용 됩니다. 제한 된 양의 조직 추출 하 여 뼈 재건을 달성은 간단 하 고 덜 침략 다른 방법에 비해입니다.

세포 기반 치료 치과 재생 목적을 위한 도구로 MSCs의 잠재적인 역할은 다양 한 연구 그룹 중 신흥 관심입니다. MSCs는 다음과 같은 유형의 조직에서 분화 될 수 있다 연구 확인: 골 수, 지방, 활 액 막, pericyte, 배수 뼈, 인간의 탯 및 치과 조직2,3. MSCs의 일반적인 소스는 골 수, 지방 조직, 그리고 치과 조직을 포함합니다. 지방 조직과 골 수에서 파생 된 MSCs와 비교는 치과 줄기 세포의 장점은 쉬운 접근성 및 더 적은 사망률 수확 후입니다. 배아 줄기 세포와 비교해, MSCs 치과 조직에서 파생 된 nonimmunogenic 나타나고 복잡 한 윤리적 문제3와 연결 되지 않습니다.

2006 년에, 세포 치료에 대 한 국제 사회 MSCs를 식별 하는 다음과 같은 표준을 사용 하 여 권장: 첫째, MSCs 수 있어야 합니다 플라스틱 연결. 둘째, MSCs CD105, CD73, CD90 표면 항 원에 대 한 긍정적이 고 부정적인 monocytes, 대 식 세포, B 세포는 조 혈 항 CD45와 CD344에 대 한 표식에 대 한 있어야 합니다. 최종 조건으로 MSCs는 다음 세 가지 유형의 차별화 생체 외에서 의 표준 조건 하에서 세포로 분화 할 수 있어야 합니다: osteoblasts, adipocytes, 및 chondrocytes4. 날짜 하려면, 6 종류 인간의 치과 줄기 세포의 고립 된 고 특징 되었습니다. 첫 번째 유형은 인간의 펄프 조직 으로부터 격리 되었고 출생 후 치과 펄프의 줄기 세포5되 나. 그 후, 치과 MSCs의 3 개의 추가적인 종류 고립 되었고 특징: 피부 박피 낙 엽이6,7치 주 인 대, 그리고 꼭대기 시8에서 줄기 세포. 더 최근에, 치과 여 포에서 파생 된9, gingival 조직 파생10, 치과 봉 줄기 cells(DBSCs)11, periapical 낭종 MSCs (hPCy-MSCs)12 도 확인 되었습니다.

세계적은 MSCs13정의 하는 첫번째 이었다. MSCs는 높은 확산 잠재력을 전시 하 고 이식 되 전에 분화를 조작할 수 있습니다 재생 절차10에 대 한 이상적인 후보자 다는 것을 건의 하.

비록 대부분의 연구는 줄기 세포의 원천으로 골 수를 사용 하 고과 파생 된 세포 (PDCs)도 있다14최근에 사용한. 과 골 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서,이 기술을 사용 하 여 치경과 수술 중 추가 절 개에 대 한 필요성을 제거 하 고 환자의 postsurgical 사망률을 줄이기 위해. 과 결합 조직 하는 긴 뼈의 외부 안 대기를 형성 하 고 두 가지 계층으로 구성 됩니다: 외부 섬유 층 섬유 아 세포, 교원 질 및 탄력 있는 섬유15와 직접 접촉에서 내부 셀 풍부한 레이어의 레이어 구성 와 함께 뼈 표면. 레이어의 레이어에 포함 되어 있는 혼합된 셀 인구, 주로 섬유 아 세포16, osteoblasts17,18, pericytes 및 MSCs19,,2021로 식별 하는 중요 한 부분 모집단. 대부분의 연구는 Pdc는 비교를 하지 않을 경우 골 수 유래 줄기 세포 (bMSCs)에서 우수한 뼈 치유와 재생22,,2324을 보고 있다. 과 쉽게 접근할 수 이며 탁월한 재생 효과 전시. 그러나, 몇 가지 연구는과25,,2627에 집중 했다.

뼈 수리에 관한 현재 임상 실습 지원 건설 기계 내에서 증폭 periosteal 조상 세포의 이식 포함 됩니다. 최근 연구는 줄기 세포 결함이 지역에서 취득 하 고 조상 세포 조직 재생20채용에 집중 했다. 치과 의사는 또한 치 주 치료 및 치아에 치 주 뼈 재생의 미래 응용 프로그램을 예상합니다. 기증자 사이트에 대해서는 쉽게 일반 치과 의사에 의해 수확 될 수 있습니다. 이과 일상적인 구강 수술 하는 동안 액세스할 수 있습니다으로 골 수 기질 세포에 대 한 호의적으로 비교 합니다. 따라서,이 연구의 목적은 이다 형태학, 첨부 파일, 생존, 그리고 인간의 줄기 세포의 확산을 평가 하 고 수확 하는 Pdc에 대 한 프로토콜을 설정 하.

비타민 D 대사 산물에는 vivo에서 뼈 미네랄 동적 평형에 영향을. 한 연구 보고는 24R,25-(OH)2D3 활성 형태의 비타민 D 인간의 MSCs (hMSCs)28의 osteoblastic 감 별 법을 위해 필수적 이다. 뼈 항상성 및 수리는 1,25-(OH)의2D3 (calcitriol)은 생물학적으로 가장 적극적이 고 뼈 건강의 규칙에 관련 된 비타민 D3 대사 산물의 네트워크에 의해 규제 됩니다. 비타민 D3 석 회화29필수적 이다. 한 연구 2-d-오래 곤 흰 쥐를 사용 하 여, 쥐에서 embryoid 몸 비타민 C와 비타민 D 보충제 효과적으로 ESC 파생 osteoblasts30의 차별화 추진 표시. 다른 생물의 활동 중 1,25-(OH)2D3 osteoblasts, 모니터링할 수 있는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 효소 활동이 나 OCN 유전자에는 증가에 따라에 hMSCs의 생체 외에서 분화를 자극 식입니다.

몇 연구 뼈 조직 공학에 특정 초점 인간의 Pdc에 결합된 치료 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 복용량 응답 관계를 감지 했습니다. 따라서,이 연구에서 우리는 1,25-(OH)2D3 의 단일 또는 복합 치료에 대 한 최적의 농도 비타민 C 인간의 Pdc의 osteogenic 분화 유도 대 한 검사. 이 프로토콜의 목표는 치과 치경과에서 고립 세포 인구 세포와 MSC 표현 형이이 세포를 문화 (생체 외에서) 확장 하 고 원하는 조직을 형성 하기 위하여 분화 수 여부를 들어 있는지 확인 하는 . 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다. 연구의 두 번째 부분은 Pdc의 osteogenic 활동에 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M 1,25-(OH)2D3 의 효과 평가합니다. 이 연구의 주 목적은 ALP 활동과 ALP, 같은 프로 osteogenic 유전자에 의해 Pdc의 osteoblastic 감 별 법 동안 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 기능을 평가 하는 콜라겐 1, OCN, BSP, 및 CBFA1. 또한,이 연구는 이러한 결과에 따라 인간의 Pdc에 대 한 최적의 osteoinductive 조건을 결정 합니다.

프로토콜

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 장 궁 기념 병원에 의해 승인 되었다. 모든 참가자는 서 면된 동의 제공합니다.

1. 조직 준비

  1. 치과 수술 (그림 1) 중 환자에서 periosteal 조직 수확. 플랩 반사 로컬 마 취, 후31periosteal 구분 기호 사용 하 여 치조 뼈에서과 직물의 조각을 가져가 라.
  2. 수확 후 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 페니실린의 300 U/mL와 스의 300 mg/mL에서에서 약 5 m m × 2 mm의 periosteal 조직 조각을 저장 합니다. 24 시간 이내 실험실에 전송 조직.
  3. 잘 다진 고 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 통로 0 매체 (페니실린의 300 U/mL와 스, α-MEM, 및 5% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 300 mg/mL로 구성)에서 샘플을 유지 때까지 scalpels와 치경 periosteal 조직 파편을 말하다 습도 공기 (5% 이산화탄소)입니다. 인큐베이터에서 습도 유지 하기 위해 물통을 준비 합니다.
  4. 3 일 후에 그리고 그 후에 주 당 두번 매체를 변경 합니다.
  5. 셀 subconfluence (80%)에 도달, 3 분 인큐베이터 (37 ° C)에서 0.25 %trypsin 200 µ L 부착 셀 놓고 매체의 4.5 mL을 사용 하 여 반응을 종료.
  6. 신선한 통행 1 매체에서 다시 셀 접시 (α-MEM, 10 %FBS, 페니실린, 100 단위/mL와 스의 100 μ g/mL). 플레이트는 5 × 103 셀 (로 hemocytometer 계산)입니다.
  7. 셀 80% 합류31달성 후 각 후속 통로 수행 합니다.
    참고: 처음에, 매체는 붉은 오렌지 있을 것입니다. 약 3 일 후, 중간 색상 노란 그늘을 변경 해야 합니다. 셀의 두 배로 대략 30-40 h, 7 일 3-5 세대에 대 한 필요.
  8. 문화 α-MEM에 고립 된 Pdc 보충 10 %FBS, 페니실린, 100 U/mL 및 100 mg/mL의 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 스.
  9. 세포 성장을 매일 관찰 하 고 두 번 주당 성장 매체를 대체. 제 3-5 세대 세포를 사용 하 여 모든 추가 실험에 대 한.

2. Cytometry

  1. 트립 신 소화를 통해 수확 1 × 106 셀:
    1. 0.25 %trypsin 200 µ L를 추가 합니다. 3 분 후 FBS를 포함 하는 문화 매체의 4.5 mL 사용 하 여 트립 신의 반응을 종결 하 고 원심 분리 (1500 rpm, 5 분, 22 ° C)를 통해 수집.
    2. 3 번 1 x DPBS를 사용 하 여 셀 펠 릿을 세척. 200 µ L 1 x permeabilization 버퍼에 셀 resuspend hemocytometer 셀을 계산 합니다.
  2. 교류 cytometry (형광 활성화 된 세포 분류)32통해 Pdc의 표현 표현된 표면 마커를 검사 합니다. CD19에 대하여 단일 클론 항 체 (MAb)를 사용 하 여 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (알렉스), 및 HLA-DR (FITC)32.
    1. 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 문화와 샘플에 항 체를 추가 합니다.
    2. 1 x DPBS 셀 세 번 씻어.
    3. 2% 포름알데히드를 사용 하 여 셀을 수정 하 고 교류 cytometry 분석32진행.

3. 세포 부착 및 Osteogenic와 생존, Adipogenic, 및 Chondrogenic 차별화

로 셀에 차별화를 유도 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보 특정 차별화 미디어 6-잘 접시에 모든 3 개의 구절에서 periosteal 세포를 배양 하 여.

  1. Osteogenic 차별화 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에서 α-MEM에 셀 문화.
    1. 80%의 합류에, α-MEM, 5%를 포함 하는 미디어에 셀 문화 FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 그리고 의약품의 5 mL (100 uM). Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.
    2. 두 번 주당 미디어를 변경 합니다.
    3. 4 주 후, 문화33석 회화 예금의 존재를 구별 하는 von Kossa 분석 결과 사용 하 여 셀을 얼룩이 여 osteogenic 혈통으로 차별화 하는 세포의 잠재력을 평가 합니다.
      1. 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 5% 실버 질 산을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 자외선 (UV)에서 취급 합니다.
      2. 추가 5% 나24 4 시간, 3 분 각 반응에 대 한 허용. 마지막으로 증류수로 두 번 셀 세척.
        참고: Von Kossa 얼룩은 강 수 반응은 이온과 인산 염이; 산 성 물질의 존재에 반응 이 얼룩 기법 칼슘에 특정 하지 않습니다. 이 연구에서 때 조사 셀 실버 질산염 솔루션, 칼슘으로 치료 했다-는 강한 자외선에 의해 감소 된다-실버, 메탈 릭 실버로 표시 된에 의해 대체 되었다.
  2. Adipogenic 차별화, α-MEM을 포함 하는 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에 세포 문화.
    1. 80%의 합류에, α-MEM, 5 %FBS, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (100mg/mL), 1% 페니실린을 포함 하는 미디어에 셀 문화 10−6 M dexamethasone (1mm), 인슐린 (5 mg/mL), 및 indomethacin (60 mM).
    2. Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.
    3. 사용 6-9 주 후, 기름 빨간 O 셀 얼룩 및 지질 방울, 그로 인하여 adipogenic 차별화33의 존재 확인을 강조:
      1. 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 얼룩 0.5% 셀 오일 10 분 동안 실 온에서 붉은 O 고 다음 씻어 3 시간 3 분 동안 60% 소 프로 파 놀과 셀 때마다; 마지막으로, 증류수와 셀 세척.
        참고: 기름 빨간 O 중성 지질, 얼룩에 사용 되는 lysochrome (지 용 성) 디 아조 염료는 주로 triacylglycerol, 단백과 콜레스테롤 에스테 르. 염료도 지질 방울은 빨강 셀에 지질 작은 물방울에 녹 인 다.
  3. Chondrocyte 차별화, 각각 6-잘 문화 접시에 문화 세포 포함 5000 셀 잘.
    1. 차별화 중간 포함 α-MEM, 5 %FBS, 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 나트륨 pyruvate (100 µ g/mL), 인슐린-처리가-셀 렌-A (1 × ITS), 변형 성장 인자-β (10 ng/mL), 및 의약품 (100 µ M)의 5 mL를 추가 합니다.
    2. Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.
    3. 4-5 주 후 Alcian 블루 얼룩 있다 또는 일부 유형의 chondrocyte 차별화33의 존재를 결정 하는 세포의 연골에서 mucopolysaccharides와 같은 산 성 류를 강조 하기 위해 사용 합니다.
      1. 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 3% 아세트산을 추가 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다. 그 후, 증류수로 세 번 씻어 30 분 동안 incubated 1 %Alcian 블루 8GX를 추가 하 고 증류수로 씻어. 마지막으로, 3% 초 산 및 3 분, 세척을 추가 하 고 완료를 증류수로 씻어.
        참고: 특히 블루가이 염료에 의해 얼룩에 블루 그린 셀 부분의 후 얼룩이 지 고 "alcianophilic" 라고

4. 골에 25 Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3)의 효과

  1. 6 그룹와 다양 한 문화 미디어 6-잘 접시에 문화 P5 Pdc에 P3 분할:
  2. 음수 그룹 (α-MEM 및 5 %FBS);
  3. 비타민 C 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C);
  4. 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. 각 잘에서 인큐베이터 (37 ° C)에 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 변경 매체 매주 두 번.

5. 리버스 전사/정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응

  1. 상업적인 시 약을 사용 하 여 얼음에 총 RNA 격리 osteoblast 차별화의 7d, 후 ( 재료의 표참조):
    1. 각 잘을 절연 시 약의 1 mL를 추가 합니다. Bromochloropropane의 200 µ L을 추가 하 고 계층화 된 RNA를 생성 하기 위해 10 분 동안 떠나 다음 4 ° c.에 15 분 동안 10000 rpm에서 원심
    2. 원심, 후 표면에 뜨는 포함 RNA의 500 µ L를 2-프로 판 올의 500 µ L를 추가 합니다. 얼음에 RNA 침전 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다.
    3. 절차 후 후 RNA는 튜브의 하단에 4 ° C에서 15 분 동안 12000 rpm에서 원심. 그 후, 세척에 대 한 75% 알콜의 1 mL를 사용 하 여는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C에 8 분 7500 rpm에서 원심
    4. 상쾌한을 제거 하 고 진공 집중 장치를 사용 하 여 액체의 바닥에서 RNA를 생산. 물으로 복구.
  2. 리버스는 RNA 녹음 (1 μ g) 조류 myeloblastosis 바이러스 역전사를 사용 하 여. 마지막으로 4 ° c.에 유지 하기 전에 60 분 그리고 85 ° C 5 분, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 50 ° c 10 분 동안 25 ° C에 실행 되도록 설정
  3. 첫 번째 가닥 보완 DNA (cDNA) 음성 합성. 정량 PCR (정량) 5를 사용 하 여 수행 μ 1:10 희석 cDNA. 양적 RT-PCR (qRT-PCR) 실시 ALP, BSP, OCN, CBFA1, 및 콜라겐-1에 대 한 프라이 머를 사용 하 여.
    참고: 신호에 의해 DNA 오염을 방지 하려면 각 뇌관의 정방향 및 역방향 시퀀스 별개 exons에 설계 되었습니다.
  4. 상업적인 PCR 마스터를 사용 하 여 정량 Pcr을 수행 믹스 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라. 2 분 뒤에 10 분 동안 95 ° C 그리고 다음 40 주기 각각 15 95 ° C에서 50 ° C에서 열 cycler 설정 s 60 위한 60 ° C 이어서 s.
    참고: SYBR 프로토콜 또한 필요 15 95 ° C에 실행 되는 용융 곡선 단계, s 60 위한 60 ° C s, 그리고 95 ° C 15에 대 한 s.
  5. ALP, BSP, CBFA1, 사이클 임계값 값을 정상화 콜라겐-1, 그리고 내부 관리 유전자 GAPDH의 OCN. 34
  6. 뇌관 쌍은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동

  1. 앞에서 설명한 기법35, p-nitrophenol; p-nitrophenyl 인산 염 변환을 사용 하 여 셀의 ALP 효소 활동 평가 p-nitrophenyl 인산은 노란색으로 405 nm 파장에서 결정 된 ALP에 의해 dephosphorylated 때 인산 가수분해 효소 기질. 전체 표준화 p-nitrophenol 형성 Bradford 분석 실험에 의해 결정 되는 총 단백질에 따라.
  2. 컨트롤의 ALP 활동 비교 (α-MEM, 5 %FBS), 비타민 C (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), 그리고 비타민 C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C +1,25-(OH)2D3) 그룹의 문화 1, 2, 3, 그리고 4 주 후.
  3. 얼음에서 단백질 추출 절차를 수행:
    1. 6 잘 플레이트에서 세포를 긁어와 세포의 용 해 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 그 후, 세포를 파괴 하 고 단백질을 무료로 30 분 얼음에 셀을 놓습니다.
    2. 30 분 후 15 분 동안 4 ° C에서 13000 rpm에서 원심. 원심, 후 저장에 대 한 상쾌한 추출 하 고 사용 합니다.

결과

모든 양적 분석 실험에 대 한 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다. 모든 통계 분석은 학생의 t를 사용 하 여 수행 되었다-테스트. 총, 34 샘플 48.1의 평균 참가자 나이 가져온 ± 12.3 y. 11 이러한 샘플의 남성 환자와 여성 환자에서 23에서 입수 했다. 20-8 샘플 앞쪽 영역;에서 6 어 금 니 지역에서 가져온 26는 maxilla는 mandible에서 8에서 얻은 했다. 치과 절차와 문...

토론

최근에 개발한 치료 양식 적임, 즉 조직 MSCs, 수 반하는 공학에 수많은 장점이 있습니다. 여러 조직 종류에 있는 MSCs 기능 mesodermal 조직 세포37 의 다양 한 차별화 수 있는 multipotent 셀과 다른 셀 osteoblasts 등 있습니다.

과 조상 세포에 대 한 틈새 시장으로 하며 뼈에 대 한 풍부한 맥 관 구조 공급으로38을 포위 한다. 34 조사 샘플의 우리의 연구?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

연구 프로토콜은 임상 연구의 장 궁 기념 병원 (IRB99-1828B, 100-3019 C, 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B, 및 103-4223 C)에 대 한 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구는 장 궁 기념 병원 (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, 및 NMRPG3C0151)에 의해 지원 되었다. 이 원고는 월 러 스 학술 편집 편집 했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium saltSigma49752
35-mm culture dishesCorning430165
3-isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
6  well plateCorning3516
Alkaline phosphataseABIHs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay KitBioVisionK412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptaseRoche10109118001
CD146BD561013
CD19BD560994
CD34BD560942
CD44BD561858
CD45BD561088
CD73BD561014
CD90BD561974
Cell banker1ZEAOAQ11888
core binding factor alpha-1ABIHs00231692_m1
dexamethasoneSigmaD4902
DPBSGibco14190250
FBSGibco26140-079
GAPDHABIHs99999905_m1
HLA-DRBD562008
indomethacinSigmaI7378
insulinsigma91077C
insulin–transferrin–selenium-ASigmaI1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)Life4346907
MicroAmp optical adhesive filmLife4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha ModificationHyCloneSH30265.02
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Permeabilization buffereBioscience00-8333-56
Sodium pyruvateGibco11360070
STRO-1BioLegend340103
SYBER Green PCR Master MixAppliedBiosystems4309155
TaqMan Master MixLife4304437
transforming growth factor-βSigmaT7039 
Trizol reagent (for RNA isolation)Life15596018
β-glycerophosphateSigmaG9422
collagen-1Invitrogenforward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
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Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

참고문헌

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R., Franklyn, J. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. 16, 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F., Hall, B. K. . The Periosteum and Bone Growth. , (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J., Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. , 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor?. J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

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