تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري

Summary

يصف لنا التثبيت وتضمين البارافين وتقنيات تقطيع رقيقة للأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. في إعداد العينات، يمكن تصور أنماط التعبير محيطة ومراسل بيوفيلم بالفحص المجهري.

Abstract

تقطيع عن طريق تضمين البارافين أسلوب المنشأة على نطاق واسع في نظم حقيقية النواة. هنا نقدم طريقة لتثبيت البرنامج، التضمين، وتمزيقها للأغشية الحيوية سليمة مستعمرة الميكروبية باستخدام شمع البارافين perfused. للتكيف مع هذا الأسلوب للاستخدام في مستعمرة الأغشية الحيوية، تطوير تقنيات للحفاظ على كل عينة على الركيزة النمو وتغليف شفاف فإنه مع أوفيرلايير أجار، وإضافة يسين للحل مثبت. هذه التحسينات تحسين الاحتفاظ بعينه والحفاظ على ميزات ميكرومورفولوجيكال. نماذج إعداد بهذه الطريقة قابلة رقيقة تمزيقها والتصوير بالمجهر الإلكتروني الضوء، والأسفار، وانتقال العدوى. نحن طبقت هذه التقنية على مستعمرة الأغشية الحيوية الزائفة الزّنجاريّةPseudomonas سينكسانثا ونجحت عصية، و الكوليرا. ارتفاع مستوى التفاصيل التي تظهر في العينات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع مراسل سلالة الهندسة أو استخدام الأصباغ محددة، يمكن أن توفر أفكاراً مثيرة في علم وظائف الأعضاء وتنمية المجتمعات الميكروبية.

Introduction

معظم الميكروبات لها القدرة على شكل الأغشية الحيوية، الذي عقد مجتمعات خلايا معا بالذات المنتجة المصفوفات. الأغشية الحيوية يمكن زراعتها في أنواع عديدة من الأجهزة المادية، مع مختلف النظم لتوفير المواد الغذائية والركيزة. فحوصات محددة لتشكيل بيوفيلم تميل إلى أن تسفر عن هياكل متعددة الخلايا استنساخه، وملاحظة أبنية مشتركة بالنسبة للأنواع المتنوعة فيلوجينيتيكالي على المجتمع أو على مستوى العيانية. عندما تزرع الميكروبات كمستعمرات في المتوسطة الصلبة تحت جو، ينقل المعلومات حول القدرة على إنتاج مصفوفة مورفولوجيا العيانية وكثيراً ما يرتبط مع سائر الصفات ^1،2،3. البنية الداخلية للمستعمرات الميكروبية يمكن أيضا أن توفر أدلة بخصوص بيوفيلم-خاصة بالكيمياء وعلم وظائف الأعضاء، ولكن كان من الصعب تميز. تمكين التطبيقات الحديثة لتقنيات كريومبيدينج وكريوسيكتيونينج للمستعمرات البكتيرية التصوير والتصور من السمات المحددة في قرار لم يسبق له مثيل ^4،،من⁵⁶. ومع ذلك، أظهرت الدراسات مع الأنسجة الحيوانية أن التضمين البارافين يوفر الحفاظ على تفوق مورفولوجيا بالمقارنة مع كريومبيدينج ⁷ ، وقد استخدمت لتصور البكتيريا في أنسجة ^8،9. ولذلك قمنا بتطوير بروتوكول للتثبيت، وتضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. وهنا، نحن سوف تصف إعداد الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 بيوفيلم مستعمرة مقاطع رقيقة ^10،11، ولكن نحن أيضا بنجاح تطبيق هذا الأسلوب للأغشية الحيوية التي شكلتها البكتيريا سينكسانثا pseudomonas، ونجحت عصية، و الكوليرا¹².

تتبع عملية التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة الأغشية الحيوية منطق بسيط. أولاً، يتم المغطى الأغشية الحيوية في طبقة من أجار للحفاظ على مورفولوجيا أثناء المعالجة. ثانيا، المغطى-الأغشية الحيوية مغمورة في مثبت للجزيئات التشعب والحفاظ على ميكرومورفولوجي. هذه هي المجففة ثم مع الكحول، وتطهيرها بالمذيبات غير قطبية أكثر، وثم تسللت مع شمع البارافين السائل. مجرد تسلل، يتم تضمين العينات إلى كتل الشمع لتمزيقها. قطع المقاطع، شنت على الشرائح، وثم امهاء بغية إعادتها إلى دولة أصلية أكثر. من هذه النقطة، يمكن الملون أو المشمولة في وسط تصاعد للتحليل المجهري.

وينتج هذا البروتوكول مقاطع رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مناسبة للتحليل النسيجي. مستعمرة بيوفيلم هياكل فرعية مرئية عندما يتم تصويرها رقيقة أقسام المعدة باستخدام هذا الأسلوب بالفحص المجهري الخفيفة. الأغشية الحيوية يمكن أيضا نمت على البقع الفلورسنت التي تحتوي على وسائط محددة للسمات الفردية أو الملون في خطوة الإماهة، مباشرة قبل تصاعد (خطوات 9.5-9.6). وأخيراً، يمكن إجراء هندسة عكسية الميكروبات لإنتاج البروتينات الفلورية بطريقة التأسيسي أو التنظيم مما يسمح في الموقع إبلاغ الخلية التعبير التوزيع أو الجينات داخل هذه المجتمعات. وقد استخدمنا هذه الأساليب لتحديد عمق بيوفيلم مستعمرة وتوزيع الخلايا وتوزيع مصفوفة، وأنماط النمو والتعبير الجيني الزمانية المكانية.

Protocol

1-نمو الزائفة الزّنجاريّة "مستعمرة الأغشية الحيوية"

1. إعداد لوحات متوسطة-بلير
   1. إعداد تريبتوني 10 غرام/لتر، 10 غرام/لتر أجار الحل (انظر الجدول للمواد) في المياه.
   2. اﻷوتوكﻻف ل 20 دقيقة كول إلى 50-60 درجة مئوية في حمام مائي.
   3. صب 45 مل الحل تريبتوني أجار في صحن مربع 100 ملم × 100 ملم (انظر الجدول للمواد) باستخدام أنبوب مخروطي 50 مل. تسمح أجار ترسيخ (~ 20-30 دقيقة). صب طبقة الثانية، 15 مل فوق الطبقة الأولى. إزالة التكثيف من أغطية اسمحوا يصلب بين عشية وضحاها، إذا لزم الأمر بالمسح مع أنسجة خالية من الوبر.
2. اكتشاف مستعمرة الأغشية الحيوية
   1. متتالية سلالات الفائدة من الأرصدة المجمد إلى رطل أجار لوحات¹³ واحتضانها في الظلام ح 12-16 في 37 درجة مئوية و 80-100% من الرطوبة النسبية.
   2. لكل سلالة أو تكرار، استخدم مستعمرة واحدة لتطعيم 2 مل رطل واحتضان في الظلام ح 12-16 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
   3. الثقافة الفرعية بتمييع 1: 100 رطل الطازجة وتفرخ في الظلام ح 2.5-3 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
   4. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي وضبط مع رطل العقيمة لتحقيق تعليق خلية مع التطوير التنظيمي_{500 نانومتر} ~ 0.5.
   5. اعتماداً على هذه المستعمرة المنشودة الحجم، بيبيت 2.5-10 ميليلتر من تعليق خلية على صفيحة متوسطة-بلير (تم إعداده في الخطوة 1، 1) والسماح على الفور لتجف ليمكن تيسير ~ 20 دقيقة ترك غطاء بيتري أجار القرب من لهب المكشوف تجفيف.
   6. احتضان المستعمرات بقعة في 25 درجة مئوية و 80-100% من الرطوبة النسبية، في الظلام لمدة تصل إلى 4 أيام.

2-إعداد الحل مثبت

1. إعداد الحل مثبت في يوم الحصاد عينة. تمييع 37% فورمالدهيد (اتحاد كرة القدم) في برنامج تلفزيوني 1 x إلى تركيز نهائي من 4% اتحاد كرة القدم.
   تنبيه: اتحاد كرة القدم متقلبة والسامة. ارتداء معدات الوقاية ويعملون في غطاء دخان جيد التهوية.
2. فورا قبل الاستخدام، حل هيدروكلوريد L-يسين في 4% فا (إعدادها في الخطوة 2، 1) في درجة حرارة الغرفة إلى تركيز نهائي من 50 مم L-يسين HCl.

3-توجيه تطبيق مثبت على بيوفيلم مستعمرة [اختياري]

ملاحظة: لقد وجدنا أن مورفولوجيا بيوفيلم هو الحفاظ على أفضل عندما تتم إضافة تراكب أجار قبل التثبيت. بيد أن هذه الخطوة تشكل أيضا تغييرا في الظروف البيئية التي يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني. أنماط التعبير مراسل الفلورسنت ينبغي بالتالي التحقق منها باستخدام بروتوكول منفصل الذي ينفذ خطوة التثبيت قبل إضافة تراكب أجار، كما هو موضح هنا.

1. في اليوم من التثبيت، والعامل في غطاء دخان جيد التهوية، "الماصة؛" مثبت إعدادها في الخطوة 2 مباشرة إلى السطح أجار حول حافة المستعمرة، يسمح لها بالوصول إلى محيط المستعمرة دون غمر أنه. تنطبق فقط بكثير مثبت كما هو مطلوب بالكامل تحيط المستعمرة، حوالي 500 ميليلتر. تسمح مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها.
2. وبمجرد مثبت قد تم استيعابها تماما في مستعمرة والمحيطة بها وسائل الإعلام، حوالي 20-30 دقيقة، واتحاد كرة القدم المتبقية لم تعد مرئية في اللوحة، كرر الخطوة 3.1. يسمح هذا مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها.
3. وبمجرد مثبت قد تم استيعابها تماما في المستعمرة ووسائل الإعلام المحيطة كرر الخطوة 3.1، هذه المرة تطبيق مثبت على سطح المستعمرة مباشرة. يسمح هذا مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها، والشروع في الخطوة 4 فقط بعد كل شيء مثبت وقد تم استيعابها ولم تعد مرئية في اللوحة.

4-تتراكب المستعمرات مع أجار

1. في يوم التثبيت، إعداد 10 غرام/لتر أجار الحل في المياه والاوتوكلاف لمدة 10-20 دقيقة لحل. بارد في حمام مائي ل 50 ˚C.
2. بلطف من أجل 15 مل الحل أجار فوق المتوسطة النمو ومستعمرة. تسمح أجار تشكل جل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (الشكل 1B).
3. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع تشاك مربعة، 3-طبقة مع مستعمرة مغلفة بين طبقتين أعلى. إذا كان إعداد عينات متعددة، تأكد من أن كل تشاك هو قطع بحجم مماثل.
4. إزالة بلطف أجار الزائدة من تشاك المحتوية على مستعمرة.
5. رفع الطبقات العليا اثنين من أجار (تحتوي على المستعمرة) بعيداً عن الطبقة السفلي من تشاك (الشكل 1)، ويت رئيس مسطح ملعقة في 1 x برنامج تلفزيوني أو المياه وإدراج بلطف بين الطبقات العليا والسفلي. وينبغي فصل مستعمرة مغلفة من الطبقة السفلي. احرص على عدم تشويه أو ثني مستعمرة مغلفة عند رفعه من قاعدته.

5-التثبيت

1. العامل في غطاء دخان جيد التهوية، نقل على الفور مستعمرة مغلفة (أي تشاك 2-طبقة) في كاسيت تضمين (انظر الجدول للمواد)، المسمى بقلم تمييز مقاومة للمواد كيميائية. ضع الكاسيت التضمين في الإرسال شرائح زجاجية (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على مثبت أعد الخطوات 2.1-2.2. تأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء محاصرين داخل الكاسيت التضمين.
2. احتضان العينة في مثبت بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

6-نموذج المعالجة: المخزن المؤقت يغسل الجفاف، والمقاصة، وتسلل

1. بعد التثبيت بين عشية وضحاها، تغسل العينة مرتين في برنامج تلفزيوني 1 x لكل 1 ح. للحصول على أفضل النتائج، أتمتة كاشف التجانس وتدور باستخدام دالة معالج الأنسجة التلقائي (انظر الجدول للمواد) تعيين إلى إعداد منخفض. إذا كان المعالج لا متوفراً، يمكن تشغيل المعالجة يدوياً.
2. اتبع الغسيل المخزن المؤقت بالجفاف من خلال سلسلة متدرجة من تخفيف الإيثانول (EtOH) في برنامج تلفزيوني 1 x (25%، 50%، 70%، 95%) 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. يذوي في يغسل ثلاث من 100% EtOH عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. مسح العينة المجففة في يغسل ثلاث من عامل البرتقالي المقاصة القائم على النفط 100% (انظر الجدول للمواد) على 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. ساخنة ارتشاح العينة تم مسحها مرتين مع البرافين المنصهر الشمع (انظر الجدول للمواد)، إلى 55˚C، لكل 2 ح.

7-عينة التضمين

1. ملء قالب شمع شمع البارافين المنصهر يسخن إلى 55 ˚C. استخدام ملعقة ساخنة، شقة بسرعة نقل تشاك تسلل من الكاسيت التضمين في القالب الشمع، ضمان أن تشاك تقع موازية لقاعدة للعفن. تجنب الضغط المفرط على تشاك. قوالب الشمع قد يكون ثلاثي الأبعاد مخصص المطبوعة، أو هي متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
2. السماح بالشمع على ترسيخ بين عشية وضحاها في 4 ˚C. قد يتم تخزين العينات مصبوب في الشمع الصلبة إلى أجل غير مسمى في 4 ˚C.
3. مرة واحدة وقد وطدت الشمع، المكوس العينة من العفن وتقليم الشمع الزائد من حول العينة مع شفرة حلاقة. اترك الشمع الزائد تمتد من نهاية واحد من العينة، موازية للطائرة من تمزيقها، التي يمكن استخدامها المشبك إلى مبضع (انظر الجدول للمواد). كما ترك غمد سميكة الشمع، 1 ملم تقريبا، حول العينة وأوجهه على نحو سلس.

8-تقطيع

1. الحرارة حمام مائي ل 42 ˚C. المشبك العينة إلى مبضع مع سطح المستعمرة الموجهة عمودياً إلى حافة النصل (انظر الجدول للمواد).
2. تقليم العينة في فترات 50 ميكرون حتى تم التوصل إلى الطائرة المطلوب للمستعمرة، التي سيتم تجميع المقاطع.
3. قص شريط للعدد المطلوب من 10 ميكرون سميكة الأقسام باستخدام مبضع تعيين سرعة تقطيع 75-80 لفة في الدقيقة وزاوية التخليص من 6-10˚. استخدام الرسام غرامة يميل إلى فصل الشريط من الشفرة.
4. برفق باستخدام قطره من الماء على طرف ماصة باستور (يفضل) أو الملقط، نقل الشريط إلى حمام الماء. كن حذراً لتجنب فقاعات الهواء الملائمة تحت القسم.
5. فورا إدراج شريحة في حوض ماء ووضعه أسفل الشريط بزاوية 45˚.
6. اللمس على حافة ضيقة على الشريط إلى الشريحة، أسفل التسمية متجمد. ينبغي أن يتقيد الشريط.
7. اسحب الشريحة خارج حوض ماء، ضبط الزاوية ليصبح عمودياً على سطح الماء، والسماح للشريط إلى وضع مسطح ضد الشريحة على طوله. تجنب محاصرة المياه الزائدة أسفل الشريط.
8. بلطف تقف الشريحة على أنسجة خالية من الوبر ماصة، فتل المياه الزائدة من القسم.
9. تخطيط الشريحة على منشفة ورقية، والسماح لها جاف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في الظلام. ويمكن تخزين الشرائح إلى أجل غير مسمى في ˚C 4 في الظلام.

9--تحديد حرارة الإماهة وتصاعد

1. الحرارة صفيحة الساخنة تعادل 45 ˚C. الحرارة الشريحة لمدة 30-60 دقيقة. سوف تصبح شبه المنصهر الشمع وتتسطح ضد الشريحة.
2. رفع الشريحة من صفيحة برفق ووضع شقة على سطح ناعمة، تعادل، في درجة حرارة الغرفة، باستخدام الرعاية لضمان أن لا سحب الشمع المنصهر على جانبي الشريحة، حتى يتصلب الشمع (~ 1 دقيقة).
3. استخدام الإرسال شرائح زجاجية، إزالة الشمع الشرائح في يغسل أربعة من مسح عامل لمدة 5 دقائق في كل منها باستخدام الشافطة [بشنر] إزالة الحل بين يغسل.
4. يغسل الشرائح ثلاث مرات في 100% EtOH لمدة 1 دقيقة.
5. ترطيب الشرائح في سلسلة متدرجة من الإيثانول في ترتيب عكسي لتجهيز (95% و 70%، 50% و 25%) لمدة 1 دقيقة ويعقب اثنين 1-مين يغسل في برنامج تلفزيوني 1 x.
6. مباشرة تحميل المقاطع في وسط تصاعد مخزنة تريس (انظر الجدول للمواد)، وتنطبق ساترة، تجنب الأخذ بفقاعات الهواء. تسمح المتوسطة المتصاعدة بلمرة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
7. وبمجرد بلمرة، ختم ساترة للشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. قد يتم تخزين الشرائح مختومة إلى أجل غير مسمى في الظلام في 4 ˚C.

النتائج

ينشئ هذا الأسلوب بيوفيلم رقيقة-الأقسام حيث يمكن تصويرها السمات المورفولوجية المميزة والمناطق للتعبير الجيني DIC والفحص المجهري fluorescence تيم. بينما DIC التصوير باستخدام 40 × الهدف الغمر النفط يمكن أن تكون كافية لإظهار بعض الخصائص المورفولوجية (الشكل 2E)، وقد وج...

Discussion

عينات الأنسجة التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة هو أسلوب النسيجي كلاسيكية التي يمكن تصوير هياكل المورفولوجية الدقيقة ويستخدم عادة على أنسجة حقيقية النواة، وقد طبقت بنجاح بعض العينات الجرثومية^{8 ،9}. بينما كريومبيدينج يسمح للقوى الاحتفاظ بإشارة الذاتية وإي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010