פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

Summary

אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

Abstract

חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין היא טכניקה הוקמה באופן כללי במערכות האיקריוטים. כאן, אנו מספקים שיטה הקיבעון, הטבעה, ואת חלוקתה של biofilms בשלמותם המושבה חיידקים באמצעות perfused פרפין. להתאים שיטה זו לשימוש על המושבה biofilms, אנחנו פיתח טכניקות לשמירה על כל דגימה על מצע הגידול שלה, למינציה זה עם overlayer אגר, נוספו ליזין הפתרון מקבע. אלה אופטימיזציות לשפר את שימור הדגימה של שימור תכונות micromorphological. דוגמאות שהוכנו באופן זה נתונות דק חלוקתה והדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור, זריחה, שידור. אנחנו החלת טכניקה זו המושבה biofilms של Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis ויבריו cholerae. רמה גבוהה של פירוט הגלויות בדגימות שנוצר על ידי שיטה זו, בשילוב עם זן כתבת הנדסה או השימוש של צבע ספציפי, יכול לספק תובנות מרגש הפיזיולוגיה והפיתוח של קהילות מיקרוביאלי.

Introduction

רוב החיידקים יש את היכולת ליצור biofilms, קהילות של תאים מחוזק ע י מטריצות מתוצרת עצמית. ניתן לגדל Biofilms בסוגים רבים של כיוונונים פיזית, עם משטרים שונים של הוראה התזונתי, המצע. מבחני ספציפי עבור ביופילמים נוטים להניב מבנים multicellular לשחזור, ואת לארכיטקטורות נפוצות שנצפו phylogenetically מגוון מינים הקהילה או ברמה מאקרוסקופית. כאשר חיידקים גדלים כמו מושבות בינוני מוצק תחת אווירה, מורפולוגיה מאקרוסקופית מוסרת מידע אודות היכולת לייצור מטריקס, לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם אחרים תכונות ^1,2,3. הארכיטקטורה הפנימית של מושבות חיידקים יכולים גם לספק רמזים לגבי כימיה biofilm ספציפיים, פיזיולוגיה, אבל היה קשה לאפיין. היישומים האחרונים של טכניקות cryoembedding ו- cryosectioning למושבות חיידקים אפשרו הדמיה והדמיה של תכונות ספציפיות החלטה חסרת תקדים ^4,5,6. עם זאת, מחקרים ברקמות בעלי חיים הראו כי פרפין הטבעה ומוצריה מעולה של מורפולוגיה בהשוואה cryoembedding ⁷ שימש כדי להמחיש חיידקים רקמות ^8,9. לכן פיתחנו פרוטוקול קיבוע, פרפין הטבעה של דק חלוקתה של מושבת חיידקים biofilms. כאן, אנו נתאר את הכנת Pseudomonas aeruginosa PA14 המושבה-biofilm דק סעיפים ^10,11, אבל אנחנו גם בהצלחה החלת טכניקה זו biofilms הנוצרת על-ידי החיידק Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ו ויבריו cholerae¹².

התהליך של הטמעה-פרפין, דק-חלוקתה biofilms עוקב אחר פשוט הגיון. ראשית, biofilms עטוף בשכבה של אגר לשמר מורפולוגיה במהלך העיבוד. שנית, עטוף-biofilms טובע לשבועיים כדי crosslink מקרומולקולות, לשמר את micromorphology. אלה מכן מיובש עם אלכוהול, פינה עם הממס יותר לא קוטביים הינם הסתננו ואז עם פרפין נוזלי. לאחר שחדר, הדגימות מוטבעים לגושי שעווה על חלוקתה. סעיפים לחתוך, רכוב על שקופיות, ואז ולמיומנות כדי להחזיר אותם למצב יותר מקורי. מנקודה זו, ניתן צבעונית או מכוסה הרכבה בינונית לבדיקה מיקרוסקופית.

פרוטוקול זה מייצר חלקים דקים של חיידקים פתוגנים המועברים במזון מתאים לבדיקה היסטולוגית. המושבה biofilm substructures גלויים כאשר סעיפים דקים שהוכן בשיטה זו הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור. Biofilms יכול להיות גם גדל על כתמי פלורסנט המכיל מדיה ספציפיים עבור תכונות בודדות או צבעונית בשלב התייבשות, מייד לפני הרכבה (שלבים 9.5-9.6). לבסוף, ניתן לתכנן חיידקים כדי לייצר חלבונים פלורסנט אופנה מכוננת או מוסדר ומאפשר בחיי עיר הדיווח של התא הפצה או גנים ביטוי בתוך קהילות אלה. השתמשנו בשיטות אלה כדי לקבוע המושבה biofilm עומק תא הפצה, הפצה מטריקס, דפוסי הצמיחה, ייתכן גנים.

Protocol

1. גידול של Pseudomonas aeruginosa Biofilms המושבה

1. הכנת לוחות בינוני-Bilayer
   1. להכין עם 10 גרם/ליטר טריפטון, אגר 10 גרם/ליטר (ראה טבלה של חומרים) פתרון במים יונים.
   2. אוטוקלב במשך 20 דק מגניב ל 50-60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
   3. שופכים 45 מ של הפתרון אגר-טריפטון לתוך תבשיל מרובע 100 מ"מ x 100 מ"מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות צינור חרוטי 50-mL. לאפשר את אגר לגבש (~ 20-30 דקות). שופכים שכבה שנייה, 15-mL על גבי השכבה הראשונה. תן לחזק בן לילה, הסרת עיבוי של העפעפיים במידת הצורך על ידי מנגב עם טישו נטולת מוך.
2. תצפיתנות כלי Biofilms המושבה
   1. פסים הזנים של ריבית מן המקפיא מניות על פלטות אגר LB¹³ , דגירה בחושך 12-16 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו- 80-100% לחות יחסית.
   2. עבור כל זן או שכפול, להשתמש מושבה בודדת ועד לחסן 2 מ ל LB דגירה בחושך 12-16 קמ"ש ב 37 ° C עם רועדת-250 סל"ד.
   3. תת תרבות על ידי דילול מטריים לתוך טריים LB ואת המקננת בחושך 2.5-3 h ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
   4. למדוד צפיפות אופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהתאים עם LB סטרילי כדי להשיג השעיה תא עם מנת יתר_{500 nm} של ~ 0.5.
   5. בהתאם המושבה הרצוי גודל, µL pipet 2.5-10 של התא השעיה על צלחת בינונית-bilayer (להכין בשלב 1.1) ולאפשר במקום להתייבש במשך ~ 20 דק. עוזב את המכסה פטרי אג'ר ליד להבה פתוחה יכול להקל על ייבוש.
   6. דגירה מושבות ספוט-25 ° C ו- 80-100% לחות, בחושך עד 4 ימים.

2. הכנת הפתרון מקבע

1. להכין את הפתרון לשבועיים ביום של מדגם קציר. לדלל 37% פורמלדהיד (FA) ב- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 4% הפא.
   התראה: הפא הוא תנודתי, רעיל. ללבוש ציוד מגן ולעבוד בשכונה-fume מאוורר היטב.
2. מיד לפני שימוש, להתמוסס L-ליזין הידרוכלוריד ב 4% פא (להכין בשלב 2.1) בטמפרטורת החדר כדי ריכוז סופי של 50 מ מ L-ליזין HCl.

3. ישירה ליישום של מקבע המושבה Biofilm [אופציונלית]

הערה: מצאנו כי biofilm מורפולוגיה נשמר בצורה הטובה ביותר כאשר הכיסוי אגר נוספת לפני קיבוע. עם זאת, שלב זה מהווה גם שינוי בתנאים סביבתיים יכולים להשפיע על ביטוי גנים. כתב פלורסנט ביטוי דפוסי צריכה ולכן אפשר יהיה לאמתו באמצעות פרוטוקול נפרד שבו הצעד קיבוע מבוצע לפני התוספת של הכיסוי אגר, כפי שמתואר כאן.

1. ביום של קיבעון, והוא פועל בשכונה-fume מאוורר היטב, pipette מקבע את מוכנה בשלב 2 ישירות אל פני השטח אגר סביב הקצה של המושבה, ולאפשר לו להגיע לפריפריה של המושבה בלי השוקע זה. חלים רק כמו הרבה מקבע כמו יש צורך מלא להקיף את המושבה, כ-500 µL. להתיר את מקבע לנטרל לתוך המושבה, אגר המקיפים.
2. ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה ומדיה שמסביב, בערך 20-30 דקות, הפא שיורית אינה גלויה על הצלחת, חזור על שלב 3.1. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב.
3. ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה, מדיה שמסביב חזור על שלב 3.1, הפעם החלת מקבע פני השטח של המושבה ישירות. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב, ממשיך לשלב 4 רק אחרי הכל מקבע כבר נספג, אינה גלויה על הצלחת.

4. overlaying מושבות עם אגר

1. ביום של קיבעון, להכין 10 גרם/ליטר פתרון אגר מים יונים, החיטוי במשך 10-20 דקות להתמוסס. מגניב באמבט מים כדי 50 הלעפה תרוטרפמט
2. שופכים בעדינות 15 מ"ל של הפתרון אגר מדיום הגידול ואת המושבה. לאפשר את אגר ליצירת ג'ל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות (איור 1B).
3. השימוש סכין גילוח חדה לחתוך של צ'אק מרובע, 3-שכבה עם המושבה למינציה בין שתי השכבות העליון. אם הכנת דוגמאות מרובים, ודא כי כל צ'אק הוא חתך לגודל דומה.
4. הסר בעדינות אגר עודף הצ'אק המכיל מושבת.
5. כדי להרים את שתי השכבות העליונות של אגר (המכיל את המושבה) מן השכבה התחתונה של הצ'אק (איור 1C), להרטיב ראש שטוח מרית 1 x PBS או מים ולהוסיף בעדינות בין הרבדים העליונים והתחתונים. המושבה למינציה צריך להפריד בין השכבה התחתונה. יש להיזהר לא לעוות או לכופף את המושבה למינציה בעת הרמת זה מבסיסו.

5. קיבוע

1. עובד בברדס fume מאוורר היטב, להעביר מיד המושבה למינציה (קרי, צ'אק 2-שכבה) לתוך קלטת ההטבעה (ראה טבלה של חומרים), שכותרתו עם עט סימון עמיד כימי. למקם את הקלטת ההטבעה למבוטחים שקופיות זכוכית (ראה טבלה של חומרים) המכיל את מקבע שהוכנו בשלבים 2.1-2.2. ודא כי ישנם אין בועות אוויר לכוד בתוך בקלטת ההטבעה.
2. דגירה המדגם לשבועיים בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.

6. דוגמת עיבוד: מאגר לשטוף, התייבשות, סליקה, הסתננות

1. לאחר קיבוע בין לילה, לשטוף את הדגימה פעמיים ב- PBS 1 x על 1 h. לקבלת תוצאות מיטביות, להפוך לאוטומטיות המגון ריאגנט להשתמש במהדורה הפונקציה של מעבד רקמות אוטומטית (ראה טבלה של חומרים) מוגדר קביעת ערך נמוך. אם המעבד לא זמין, ניתן להפעיל עיבוד ידני.
2. פעל לשטוף את מאגר על-ידי התייבשות באמצעות סדרת דילולים אתנול (EtOH) ב- PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) מדורגת 1 h כל בטמפרטורת החדר.
3. מייבשים ב שלושה שוטף של 100% EtOH על 1 h כל בטמפרטורת החדר.
4. נקה המדגם מיובש ב שלושה שוטף של סוכן ניקוי על בסיס שמן תפוז 100% (ראה טבלה של חומרים) עבור 1 h כל בטמפרטורת החדר.
5. לחדור הדגימה שנוקה פעמיים עם שעווה מותכת שעווה (ראה טבלה של חומרים), מחומם ל 55˚C, כבר שעתיים כל אחד.

7. דוגמאות הטבעה

1. ממלאים תבנית שעווה מותכת פרפין מחומם ל הלעפה תרוטרפמט 55. השתמש מרית מחוממת שטוחים, להעביר במהירות את הצ'אק הסתנן מ בקלטת ההטבעה לתבנית שעווה, המבטיח הצ'אק. מונח מקביל לבסיס התבנית. למנוע הפעלת לחץ יתר על גבי הצ'אק. שעווה בתבניות ייתכן תלת-ממדי מותאמת אישית מודפס, או אינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
2. אפשר שעווה לגבש בין לילה-הלעפה תרוטרפמט 4. ניתן לאחסן דגימות יצוק ומצופה בשעווה מוצק ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט.
3. לאחר השעווה התחזק, לסלק את הדגימה של העובש ולחיתוך שעווה עודפת מ מסביב הדגימה. עם סכין גילוח. להשאיר עודף שעווה הארכת מקצה אחד של המדגם, מקביל למישור חלוקתה, זה יכול לשמש כדי. תהדק את זה לתוך האזמל הקטן (ראה טבלה של חומרים). גם יוצאים נדן ווקס, כ 1 מ מ עבה, סביב המדגם, להחליק את הפנים שלה.

8. חלוקתה

1. חום באמבט מים כדי הלעפה תרוטרפמט 42. תהדק את המדגם לתוך האזמל הקטן עם פני השטח של המושבה מונחה בניצב על קצה הלהב (ראה טבלה של חומרים).
2. חתוך את הדגימה במרווחים 50-מיקרומטר עד הגיעה למטוס הרצוי של המושבה, שממנו ייאספו מקטעים.
3. חותך רצועה של המספר הרצוי סעיפים בעובי 10-מיקרומטר באמצעות מיקרוטום של הגדר מהירות אופטים של 75-80 סל"ד ואת זווית סיווג של 6-10˚ להשתמש במכחול שקצהו הקנס כדי לנתק את רצועת הכלים של הלהב.
4. באמצעות טיפת מים בקצה של פסטר פיפטה (מועדפת) או מלקחיים, להעביר בעדינות את רצועת הכלים המים הרותחים. להיות זהירים כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת המקטע.
5. מיד להוסיף שקופית לאמבט מים ומקם אותה מתחת לרצועת הכלים בזווית של 45˚.
6. לגעת בקצה הצר של רצועת הכלים אל השקופית, רק מתחת לתווית עמומה. רצועת הכלים צריך לדבוק.
7. משוך את השקופית מהאמבטיה מים, התאמת הזווית להיות בניצב למשטח של המים, ומאפשר הכלים כדי להשתטח נגד השקופית לאורכו. למנוע השמנה עודף מים מתחת לרצועת הכלים.
8. בעדינות לעמוד השקופית אל סופג נטולת רקמות, הפתילה המים העודפים מהסעיף.
9. להניח את השקופית על מגבת נייר, ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה בחושך. ניתן לאחסן שקופיות ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט בחושך.

9. חום-תיקון התייבשות, הרכבה

1. מחממים תנור מפולס כדי הלעפה תרוטרפמט 45. מחממים את השקופית למשך 30-60 דקות. השעווה להיות מותך למחצה ולשטח נגד השקופית.
2. בעדינות להרים את השקופית מ הכיריים ושים אותה שטוח על משטח חלק, מפולס, בטמפרטורת החדר, באמצעות טיפול להבטיח כי שעווה מותכת לא למשוך בכל צד של השקופית, עד שהשעווה עפור (~ 1 דקה).
3. באמצעות הדיוור שקופיות זכוכית, שעווה מבטל את השקופיות ארבע שוטף של הבהרת סוכן עבור 5 דקות כל אחד, באמצעות ליניקת ביכנר כדי להסיר את הפתרון בין שוטף.
4. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-100% EtOH עבור 1 דקות כל אחד.
5. נתרענן השקופיות בסדרה מדורגת של אתנול בסדר ההפוך של עיבוד (95%, 70%, 50% ו- 25%) 1 דקות, ולאחריו שוטף 1-מין שני ב- 1 x PBS.
6. מיד הר הסעיפים במדיום באגירה טריס הרכבה (ראה טבלה של חומרים) ולהחיל על coverslip, הימנעות המבוא של בועות אוויר. לאפשר הרכבה בינוניים עד פולימריזציה ללילה בטמפרטורת החדר.
7. ברגע polymerized, חותם את coverslip אל השקופית באמצעות לק ברורה. ניתן לאחסן שקופיות אטום ללא הגבלת זמן בחושך-הלעפה תרוטרפמט 4.

תוצאות

שיטה זו יוצרת biofilm דק-סעיפים שבה תכונות מורפולוגיות שונות ואזורי גנים יכולים לדימות על ידי DIC, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, TEM. בעוד DIC הדמיה באמצעות 40 X שמן טבילה המטרה יכול להיות מספיק כדי להראות כמה תכונות מורפולוגיות (איור 2E), מצאנו כי קרינה פלואורסצנטית מיק?...

Discussion

דגימות רקמה הטבעה-פרפין, דק-חלוקתה היא טכניקה היסטולוגית הקלאסי מאפשר הדמיה של מבנה מיקרו-מורפולוגי, משמש בדרך כלל על רקמות האיקריוטים ולאחר הוחלה בהצלחה מסוימת על חיידקים דגימות^{8 ,9}. בעוד cryoembedding מאפשר שמירה חזקה של אות אנדוגני, immunofluorescent, פרפין הטבעת היא כל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010